（细胞生物学专业论文）leydig细胞和生精细胞对sertoli细胞核孔数量的影响.pdf

摘要 s e r t o l i 细胞、l e y d i g 细胞和精细胞是哺乳动物睾丸内的三种主要的细胞，它们之间 关系密切。最近的研究显示，s e r t o l i 细胞核孔数量可能与l e y d i g 细胞及精细胞相关。 为了证明s e r t o l i 细胞核孔数量与这两种细胞的关系，本实验对大鼠腹腔注射e d s ，特异 去除睾丸l e y d i g 细胞，7 天后取材，利用免疫荧光技术和激光扫描共聚焦显微技术，获 得单个s e r t o l i 细胞核的全部系列扫描图像，对所得图像进行处理和统计学分析，检测大 鼠s e r t o l i 细胞核孔数量及变化。对小鼠腹腔注射b u s u l f a n ，去除精原干细胞，一个月 后取材，用相同方法检测s e r t o l i 细胞的核孑l 数量。结果表明，e d s 处理后，l e y d i g 细胞 凋亡，大鼠s e r t o li 细胞核孔数量减少( p ( 0 0 1 ) 。b u s u l f a n 处理后，小鼠精原干细胞 去除，管腔内只有s e r t o l i 细胞，s e r t o l i 细胞核孔数量是否变化有待于进一步研究。 关键词：s e r t o l i 细胞；l e y d i g 细胞；核孔数量；激光扫描共聚焦显微技术 a b s t r a c t s e r t o l ic e l l ，l e y d i gc e l la n dg e r mc e l ta r em a j o rc e l l si nm a m m a lt e s t i sa n d t h e yh a v ec l o s er e l a t i o n s ，r e c e n ts t u d i e ss h o w t h e r em a yb eac o r r e l a t i o nb e t w e e n s e r t o l ic e l l u l a rn u c l e a rp o r en u m b e ra n dl e y d i gc e l lo rg e r mc e l l f o rf i n d i n gt h i s ， w et r e a t e dr a tw i t he d sf o rs e v e nd a y st or e m o v el e y d i gc e l l sa n dg e tas e r i e so f d a t ao fs i n g l en u c l e a ro fs e r t o l ic e l lw i t hi m m u n o f l u o r e s c e n tt e c h n i q u ea n d c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y t h ed a t aw e r ep r o c e s s e da n da n a l y z e db y s o f t w a r et od e t e c tt h en u m b e r sa n dc h a n g eo fn u c l e a rp o r e s m i c ew e r et r e a t e d w l 凌b u s u l f a nf o ram o n t h or e m o v et h es p e r m a t o g o n i a ls t e mc e l l sa n dd a t a p r o c e s s e da n da n a l y z e da st h es a m e t h er e s u l ts h o w s ，a f t e rt r e a d e dw i t he d s ， r a t s l e y d i gc e l l sa p o p t o s i sa n dt h en u c l e a rp o r en u m b e ro fs e r t o l ic e l lr e d u c e ( p o 。0 1 ) t h eb u s u l f a nt r e a t e dm i c es h o w st h a tt h e r ew e r eo n l ys e r t o l ic e l l si n s u m i n i f e r o u st u b u l ea n dt h en u m b e ro ft h e i rn u c l e a rp o r e ss h o u l db ed e t e c t e d f t u r t h e r k e yw o r d s ：s e r t o l ic e l l ：l e y d i gc e l l ：n u c l e a rp o r en u m b e r ；l a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p y 4 蓄爨帮楚大学学位论文擞鞭牲声明 本人鄹激声鹱：所呈交魏学位论文，是本人在嚣师静指导下，独立避行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文刁；含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识副本声鼹的法律络果由本人承担。 学位论文幸# 者签名：爹髦 日期：2 0 0 6 年5 月3 0 曰 首都师范大学学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 著向国家主管部门或其指定机构邀交论文懿电子版嚣 纸凌舨。舂权将学位论文嗣予菲赢利 鑫酌的少量簸翩著允许论文遂入学校图书馆被查阕。有权将学位论文的游容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文 乍者签名：譬舅 蠢麓：2 0 0 6 年5 翔3 0 鑫 第一部分文献综述及本题意义 一、睾丸中主要细胞的功能及关系 1 。s e r t o l i 缨藏的功髓 睾丸s e r t o l i 细胞( 支持细胞) 及其结构是由德国人e n r i c o ls e r t o l i 在1 8 6 5 年首 先发现。s e r t o l i 细胞被认为魑生精细胞的支架，为嫩精细胞提供必需的睹养物质，能合成 与分泌雄激索结合蛋白( a n d r o g e nb i n d i n gp r o t e i n ，a b p ) ，为生精细臌提供高浓度的雄 激素环凌笛 1 。目露s e r t o l i 鬃麓还链舍藏分泌多秘物痰，s e r t o l i 缨藤之淹静紧密连接 构成血一翠辫障，为精子的生成提供免疫豁免的徽环境。 1 1 s e r t o l i 细胞在生精过稷中的作用s e r t o l i 细胞供给生精过稷所需能量及营养物 质。生糖缨勰藏熬过程中懿戆源一嚣酸薤、黍酝酸熬怒s e r t o l i 爨藏京f s t t 终用下生戏豹。 生糖过程中掰需的雄激素、髓类、各种维生素和金耩元素也是与s e r t o l i 细胞的结合蛋自 结合，输送到生精细胞的【2 】。 s e r t o l i 细胞上有促卵泡刺激索( f s h ) 受体。f s h 对精子形成的启渤是必需的，而睾酮 则在精母缨胞减数分裂至i 精予成熟鲍各个除段起作用。f s h 作用于s e r t o li 细胞，与其细 瑰貘上静f s h 受俸结合、激滔躲漂冷孩蕾酸舔纯酪，产生环磷酸豫蛰( e 勰移、嚣者孬激 活磷酸化酶，启动基因转录，使m r n a 活化、产生雄激索结合蛋白( a b p ) 等，a b p 与睾酮结合， 维持曲细精管内睾酮的高浓度，造成生精细胞分化成熟的内环境。a b p 还将睾酮运送到附 睾，促进精予的成熟 3 1 。 l ，2 s e r t o l i 缨藏戆努泌凌戆s e r t o l i 爨藏襞够分泌多秘耱蒺，按凌麓霹霆秀滚下a 类： 1 2 1 转运疆白类：转铁蛋囱( t r a n s f e r r i n ) 、罐激素结合蛋自( a n d r o g e nb i n d i n g p r o t e i n ，a b p ) 、铜蓝蛋白( c e r u l ap l a s m i n ) 、维生索结合蛋白、硫酸糖醺白l 和2 、v 一谷氨酰转移酶等。 i ，2 2 谖节攮叁类：缪勒管李牵稍物痰( m u i l e r i a ni n h i b i t i n gp r o t e i n s ，m i s ) 是胚骚罩 期在f s h 作用下s e r t o l i 细胞分泌的一种蛋白质，它能使中肾势管退化消失，参与性别分 化。或熟受s e r t o l i 缭魏熊分泌一秘窝藏缡魏激滔器自，鬣莲闻袋缀瘫功能豹澎或州。s e r t o l i 细胞分泌内皮索( e n d o t h e l i n ，e t ) ，目前认为内皮素由s e r t o l i 细胞产生后通邋旁分泌方 式调节黎丸功能揸j 。 1 。2 3 生疑因子类：抑制素( i n h i b i n ) 、激活索( a c t iv i n ) 、转化生长因子q ( t g f ) 、转 化生长阂子1 3 ( t g f0 ) 、胰岛索样生长因子一1 ( i g f 1 ) 、白介索一1 ( i l 一1 ) 和白介素一6 ( i l 一6 ) ，s e r t o l i 缨腿分泌生长因子( s e r t o l ic e l1 - s e c r e t e dg r o w t hf a c t o r ，s c s g f ) 、 生精生长因子( s p e r m a t o g e n i cg r o w t hf a c t o r ，s g f ) 、活性素婷，这些生长因子与睾丸萁 德缨爨分泌茨生长因子，擒藏晕丸局部生长因子网。最遥证实，籁籍期及蠢生蠢李孛经营养 索一3 ( n e u r o t r o p h i n 一3 ，n t 3 ) 和神经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r ，n g f ) 在s e r t o l i 细胞 肉可持续性表达i 鲥，飘两为研究s e r t o l i 细胞更广泛的成霜提供了有力酌基础。 l 。2 4类固醇类：s e r t o l i 细腿内孕烯醇酮可变成睾酮，1 7 b 一雌二醇”j 。s e r t o l i 细腿内 有发达的滑面内质网、商尔基体、溶酶体、脂肪滴，一部分细胞还见到有内脊的线粒体， 均提示女产生类隧醇激豢。s e r t o l i 缨爨戆产生耀激素，巍阕囊绥腥产生憋睾酮农s e r t o l i 细胞受f s h 作用经芳香化转变为雌激素。 1 2 。5 萁德：参与擒成垒耱小镑基貘懿屡粘连蛋叁l a m i n i n ) 、i v 型簸藤蛋叁、e n a c t i n 和硫酸肝素类糖胺多糖，嚣白多糖，纤维粘连蛋白( f i b r o n e e t i n ) ；与s e r t o l i 细胞间结合 有关静簇集素、s e r t o l i 绸您与生精细穗闻连接裔关的攀丸素( t e s t i n ) 嘲：参与基膜更新 及s e r t o l i 细胞遴接复合体开放和关闭的纤溶酶原激活素。 1 3 s e r t o l i 细胞的免疫排羿功能s e r t o l i 细胞在睾丸生精小管中构成血一睾屏障，除阻 止终米撬原进入零丸，弓l 发免疫废答铃，还可以防止囊身撬原( 垒精缨腿) 与极钵接触瑟萼| 发的免痰应答，因为精母细胞在增殖与分化的过程中，细胞表面结构不断地变化，因而具有 7 凝体囊骞撬黎经f l 。戴乡 ，s e 拜o l i 绥憨分泌豹各耱缨蘧因子，奁攀丸弱部澎成绥麓因子阙 络，调节犟丸的局部免疫功能。如i l 一1 ，i l - 6 ，t n f - a ，t g f b 等，t g f - 0 对各类免疫细胞 翔萱绸熬、b 缨胞、涨缯脆、匿噬细胞等具有翡燕的李璋 稍作用，怒免疫系统鹩负调节因子。 另外，体内的某些器官，如眼睛、大脑、生殖腺( 子宫、卵巢) 等组织中只有少量的免疫细 胞，在抗原侵入时，仅能产生低水平的免疫活动及较弱的炎症反应，以保护这些组织( 器官) 免受因受疫或炎症反艨导致盼组织擐伤，免疫学h 稼这秒现象为受疫熬兔( i m m u n e p r i v i l e g e ) 。举丸的免疫豁免怒由s e r t o l i 细胞维持的。s e r t o l i 细胞通过表达种特殊的 滚瑟分子一f a s l 亲缝撩睾丸弱帮静免疫豁兔。s e 蛀o l i 缨魏表达貔f a s l 有貘缝合型耪分 泌型两种形式，f a s l 可与侵入的免疫细胞膜上f a s 受体结合，诱导免疫细胞凋亡1 8 j 。 s e r t o l i 细胞表达并分泌f a s l ，从而被用于为移植的细胞提供免疫豁免的环境，为糖尿 病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景。学者们将s e r t o l i 细胞用于帕金森病的治疗，证实 大鼠睾丸s e r t o l i 细胞移入成年雄性大鼠脑内可以改善6 一羟多巴胺诱导的类帕金森综合征 这表明s e r t o l i 细胞可能具有分泌对神经元有营养作用的物质，并能使病变的神经元恢复功 能。s e l a w r y 等将大鼠的胰岛组织移入雄性糖尿病w i s t a r l e w i s 大鼠睾丸后，再将睾丸 移入腹腔，很快出现无糖尿( a g l y c o s u r i c ) ，并可维持5 0 d 以上i9 1 ，证明s e r t o l i 细胞可使 胰岛移植物长期存活并保持其分泌功能。 2 l e y d i g 细胞的功能 l e y d i g 细胞( 间质细胞，赖氏细胞) ，含有大量的滑面内质网和丰富的线粒体。主要功 能是合成和分泌雄性激素，促进精子发生。睾丸分泌的雄激素主要有三种睾酮、去 氢异雄酮和雄烯二酮，其中主要起作用的是睾酮。l e y d i g 细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的 9 5 。f s h 主要作用于生精细胞和s e r t o l i 细胞，而l h 主要作用于l e y d i g 细胞。l h 与l e y d i g 细胞膜的l h 受体结合后，激活腺苷酸环化酶，促进细胞c a m p 的生成。c a m p 再激活 依赖c a m p 的蛋白激酶，使蛋白质磷酸化，从而使胆固醇经过一系列中间过程最终生成睾 酮【i o l 。 在胆固醇到睾酮的转化过程中，主要涉及到下列几个步骤：( 1 ) 胆固醇必须从线料体膜 外转运到膜内，转运过程中需要类固醇急性反应蛋( s t a r ) 的参与。( 2 ) 胆固醇转运到线 粒体内膜后，在胆固醇侧链裂解酶细胞色素p 4 5 0 ( p 4 5 0 s c c ) 的催化下变成孕烯醇酮，p 4 5 0 s c c 是类固醇合成的一个限速酶。( 3 ) 孕烯醇酮可直接变为孕酮，两者在1 7 羟化酶1 7 2 0 裂解 酶细胞色素p 4 5 0 ( p 4 5 0 c 1 7 ) 作用下依次转变为1 7 羟孕烯醇酮( 1 7 羟孕酮) 和去氢表雄酮 ( 雄烯二酮) ，p 4 5 0 c 1 7 是另一个限速酶。( 4 ) 去氢表雄酮在1 7b 羟甾脱氢酶( 1 7b h s d ) 催化下可转变为雄烯二酮。( 5 ) 3b 羟甾体脱氢酶( 3b h s d ) 可催化雄烯二酮转变为睾酮， 3b h s d 也是类固醇生物合成的限速酶【1 1 1 。 l e y d i g 细胞合成分泌的睾酮经血液循环至靶器官后，在靶器官所含的5 还原酶的作 用下变为活性更强的双氢睾酮( d h t ) ，它是发挥作用的主要形式。l e y d i g 细胞具有多种 功能，除分泌雄激素外，尚能分泌前列腺素等含氮物质1 0 】。雄激素是固醇甾类激素，其 受体在细胞核内。雄激素受体为个配位子激活转录因子，当它与睾酮或双氢睾酮结合后， 受体蛋白变构，变构后的蛋白能与特异d n a 序列结合，启动基因的转录。 3 s e r t o l i 细胞、l e y d i g 细胞与精细胞的关系 s e r t o l i 细胞j 币h l e y d i g 细胞是非生殖细胞，它们是生殖激素作用的靶细胞。睾丸曲细精 管的生精过程和间质细胞的睾酮分泌均受到下丘脑一垂体的调节。下丘脑分泌的g n r h 经垂 体门脉到达腺垂体，促进腺垂体促性腺激素细胞合成和分泌精予生成素( f s h ) 和间质细胞 刺激素( l h ) 。f s h 作用于s e r t o l i 细胞，刺激s e r t o l i 细胞促进精子生成；l h 作用于l e y d i g 细胞，调节l e y d i g 细胞上的l h 受体并合成睾酮，刺激睾酮释放。l e y d i g 细胞能分泌雄激素， s e r t o l i 细胞在雄激素$ 口f s h 作用下能合成雄激素结合蛋白( a b p ) ，a b p 可与雄激素结合以 保持曲细精管内雄激素水平【l ”。 s e r t o l i 细胞( 支持细胞) 构成曲细精管的上皮组织，它位于曲细精管的基底膜，并 向管腔内延伸。s e r t o l i 细胞相互紧密连接而构成血睾屏障，曲细精管则由这种紧密连接 而分成独立的两部分，即管腔部分和基底膜部分。l e y d i g 细胞位于曲细精管之间的睾丸间 质。s e r t o l i 细胞和l e y d i g 细胞功能的发挥对生精细胞的调节作用是非常重要的【1 2 1 。精子 发生及生精细胞的凋亡这种周而复始的过程与生精细胞和非生殖细胞之间、各级生精细胞 之间、非生殖细胞之间的信号传递，细胞膜激素受体的变化，胞内细胞器、酶以及其它成分 的周期性改变关系密切【i , i o j 。 s e r t o l i 细胞接受来自垂体和睾丸的信号，再产生信号维持生精细胞的生存与分化。 s e r t o l i 细胞提供和调节的局部环境( 如旁分泌物质或营养因子) 对生精上皮某些时点的 生精细胞具有很敏感的影响力，它介导着对生精细胞生存最适合的f s h 和睾酮的生物学效 应，s e r t o l i 细胞对刺激的反应是时期特异性的，这也许可以解释为什么某些时期的生精细 胞在激素缺乏时更容易凋亡。研究发现，成熟大鼠睾丸中s e r t o l i 细胞的雄激素受体存在于 生精卜皮的i i 一期，睾酮在这些时点能抑制生精细胞的凋亡；第期没有雄激素受体， 睾酮显示出促进凋亡的负性效应；x i i i v 期和i 期也没有雄激素受体，睾酮发挥着 中等强度的抑制凋亡作用【1 3 ，1 4 ，”】。精原细胞和精母细胞的凋亡，除了部分由于对受损伤细胞 4 或异常染色体细胞的清除外，s e r t o li 细胞和生精细胞数量平衡的维持也是其原因，对有限 生存因子的争夺等因素调节着凋亡的发生，使机体清除过多细胞，保证s e r t o l i 细胞能支持 最适数量的生殖细胞。 二、核孔复合体的动态变化 1 核孔复合体的结构和蛋白组成 所有真核细胞的核膜都具有核孔，核孔是多种蛋白质组成的复合体。核孔复合体组成 一个有功能的孔道，是所有核质转运物的唯一通道。在结构上，核孔复合体主要由胞质环 ( c y t o p l a s m i cr i n g ) 、核质环( n u c l e a rr i n g ) 、辐( s p o k e ) 等结构组成【1 6 】。胞质环、核质环 都呈八蛋白中心对称结构，从胞质环上发出纤维伸向胞质，核质环上也有纤维发出，并在 核质远端构成一个小环，形成吊篮结构。八条辐位于核质环和胞质环之间的核膜内，也呈 中央对称( 图1 a ) 。哺乳动物核孔复合体含有约3 0 多种核孑l 蛋白( n u c l e o p o r i n ，n u p ) ， 其中有些蛋白质具有多个拷贝形成1 0 0 多个蛋白组成的大分子复合体，分子量约1 2 5m d a 1 6 , 1 7 。在脊椎动物中，只有两个核孔蛋白p o m l 2 1 和g p 2 1 0 是跨膜蛋白，具有将核孔锚 定在核膜上的作用 j 引。其他核孔蛋白均为可溶性蛋白，且多数在胞质和核质中对称分布 ”“。还有一些极少数的核孔蛋白仅在一面分布或倾向于一面分布，它们可能是胞质和核 质的纤维组分。有些核孔蛋白紧密联接在一起，形成核孔亚复合体，它们是核孔组装的组 件( 图1 b ) 。此外大多数核孔蛋白具有f g ( p h e g l y ) 多态重复片段，是核质转运中转运受 体( 如i m p o r t i n p ) 的停泊位点。 核孔是高效繁忙的交通孔道，每个核孔每秒钟有几百次转运事件发生，同时物质进出 核孔是被高度精确调控的。现在人们还不完全清楚核孔怎样介导大型分子流的进出。目前 存在两种不同的观点，一种认为，核孔复合体静止不动，在核质转运中，只为转运受体提 供停泊位点。而另一种观点则认为，许多核孔蛋白是动态变化的，甚至在胞质与核质中快 速穿梭。这些动态变化的核孔蛋白可能参与核质转运过程的许多重要事件，如定位、转运、 循环及转运复合体从核孔释放或调节小g 蛋白r a n 的功能等。核孔蛋白的运动规律目前 还不是非常清楚。核孔复合体的组装和动态变化的研究是揭示核质转逡机制的关键点之 一，同时邋方面的研究也是目前国际研究热点之一。核孔复合体通过煎组装来调节核质转 运，从而赋予细胞薪的功能米皮对不同生理变化。 f i g 1t h es f f t t c t u r e o f ( h e m l c | e a r 斛c d m p l “瞪4 1 a ) s ：| w m a t l cd i a g r a mo f n t t c | c 镕, rp 翻霉c 、o m p l c xs u b s l r u c t u r c s 。( b ) s c h e m a l i c 蝌p 瓣瓣薅l 戢轴no f l h e p o s h i o no f t h # m a j o rl m c l e o p 啦r i n 巍小黼蚤l o x e s 涵v e r t e b r a t e s ， 2 核孔簸含体的动态组装假说 在缫臌新陈代谢中，毅的梭孔露要组装舞核膜。e 应对细胞分裂载其他叟理变化。雀崤 巍动耱稻黪簿纲稳豹缀麓焉攒中，孩孔数量在g ，麓捌g ：裁灞魏，为l 掰稳分裂骰准备馨q 。 同样，卵母细胞在核膜和胞质中积聚数百万的核孔簸台体，为早期快速胚胎发育提供物质 储备。 裹等囊孩生凌在毒丝分裂中经掰了孩貘、竣嚣瓣簿聚器重缓装i 篷纛咎珏，鄄大量接魏 需要在分裂束期同时重新组装在一起。闻期细胞和分裂期细胞的核孔缌装是否具有相同酌 机制目前还不清楚，这两种核孔组装发生在完全不同的细胞时期。有丝分裂后核孔复合体 的组装发生在m 期细胞的胞质中，早于或至少与核膜同步形成；分裂间期核孔复合体的 缝装在阁期缨腿屡盎完成，此瓣缨熬已具有完整的双层核骥结构。 6 第种梭孔复合体组装假激认为局部内外核脱的预先融合引发了核孔组装( 图2 a ) 。 研究人员用非洲爪蟾 卵( x e n o p u se g g ) 提取物和精细胞染色体组成无细臌体系，研究有丝分 裂孛孩藐豹缝装。在髂羚实验巾，热入籀毒藏睡载豢孝枣涮洼莼翅，露获褥无菝魏约棱貘【2 鹳。 因此，该假说认为内外核骥融合焉才能启动核孔复合体的组装。崤乳动物的两个核孔跨膜 蛋白p o m l 2 1 和g p 2 1 0 是内外梭膜融合的标志蛋臼，体外实验中，对g p 2 1 0 胞质端的结构 进行干扰也会抑制核孔复合体的组装【2 “。然而，另外一些实验结论则与之相反，许多组 织或培养缁聪系荠无g p 2 1 0 的表达，这些实验结栗瓣g p 2 1 0 是否在存丝分裂中棱孔组装起 关键 乍鬻掇盘质疑，送i 磊对该骰渡提密质疑。 第二种假说认为核孔组装是由于染色质上结合的一些核孔前体鬣白引发的【2 1 】( 图 2 b ) 。科磺人员很早就从电镜中观察到，在核膜形成蘸，染色质上已存在类似于核孔煦维 稳【凋。竣滚缀遥，在缀憝鸯黧分襞基鬟秀始嚣，n u p l 0 7 ( n u c l e o p o r i n1 0 7 ) 帮n u p l 3 3 ( 或 许是整个n u p l 0 7 1 6 0 复合物) 与染色质连接，早予核膜与染色质的绐台。免疫沉淀去除 n u p l 0 7 1 6 0 复合物可使核孔的体外组装受阻，形成无核孔核膜，而在膜成分围绕染色质 之前加入纯化的n u p l 0 7 1 6 0 复合物，核孔能恢复组装【2 5 l 。这表明n u p l 0 7 - 1 6 0 复合物是 棱魏缓装瓣体，它必矮先与聚魏矮缝合然后方巍弓 发后续旋棱我缝装。n u p l 5 5 选是核藐 复合体组装掰必须鹃前俸蛋国 2 6 1 0 也许还有其德核孔蛋自参与核孔髓体的组装，这些鬣 白质按照一定顺序依次整合，影成有功能的核孔。 第三种核孔组装的假说楚针对已经有完整核膜的阀期细胞提出黪，认为已存在的棱我 镶模扳，复潮生成薪棱孔，然聪按一静“分爱掇潮”透行分离，形戒掰个核t l ( 2 7 1 ( 蓬2 c ) 。 7 震霆霍簟霆霍 羹鎏篝鐾落眷；i 誉蕊n i 麓蠡凿鲞 f i g 2m o d e l so l n u d c a r 艄ma s m b l y m m k o s l s # n d n 地r 曲a 端】 3 不同生理状态下核孔复合体的动态变化 3 。l不麓生遴获悉下孩藐的数爨受纯 核孔复合体可以通过组装和去组黻改变核孔数量，来应对不同生理需要。高等真核生 物核孔在核膜上是完全固定的，这也许和核纤层的相互作用有关。核孔一旦组装好，就形 成看上去在整个阀期都菲常稳定的结构。值在没有经历有丝分裂或细胞凋亡时，核孔数量 也会禳据生理变诧增减。镶懿在我翻以往豹褥究中发袋，醺襞动物翠丸s e r l o ti 缍溅孩魏 的数恳和分布与曲细髓管上皮周期的活动有密切关系 2 8 ，2 9 。该细胞的核孔数爨还受到 l e y d i g 细胞的雄激素绒细胞因子的影响 3 0 】，即核孔复合体在这些生理变化过程中发生了组 装和去组装的活动。 3 2 不秘玺邋状态下棱张蛋皂黪数量变纯 不同的核孔爱白对入核( 出核) 蛋白的亲和力不同，生物体通过更换核孔组分米调控 转运效率。目前已发现有组织特异表达的核孔蛋白，妻i j n u p b s 一6 3 ( r a n b p 2 n u p 3 5 8 的剪切 异构律) 怒人藉细胞和精子中特舜表达的核藐蛋白。又如睾丸中n p a p 6 0 的表达璧是箕他组 织毂1 0 辔f 3 l 】。 组成拨孔复合体的3 0 多零申核孔蛋白功能不同，它们处在不同程度的动态变化中。最近 研究人员得到1 9 种分别在哺乳动物细胞中正确表达的g f p n u p 融合蛋白，利用光漂白后逆 冀 向荧光恢复技术( i n v e r s ef l u o r e s c e n c er e c o v e r ya f t e rp h o t o b l e a c h i n g ，i f r a p ) 对这 些活细胞中的核孑l 蛋白进行动态监测，根据它们在核孔复合体上的滞留时间，将核孔蛋白 分为三组。即滞留时间大于3 5 h 的核孔骨架蛋白( s c a f f o l d ) ，立g p o m l 2 1 、n u p l 0 7 1 6 0 复合 物的组成蛋白等；2 5 至3 0 h 的连接蛋白( a d a p t o r ) ，血h n u p 6 2 等，这些蛋白质可能作为接头 将其他核孔蛋白与骨架相连：以及小于2 5 h ，甚至只有几秒钟的动念核孔蛋白( d y n a m i c ) ， 如n u p l 5 3 、n u p s o 等 3 2 。这些核孔蛋白的运动与核质转运的关系目前还不清楚，但人们己 提出很多假设，包括定位、转运、再循环、从核孔复合体上释放转运复合体口，以及d , g 蛋白r a n 的调节等。 最近对核孔微细结构的研究中也发现核孔处于高度动态变化中，科研人员用冷冻电子 x 射线断层摄影技术( c r y o e l e c t r o nt o m o g r a p h y ) 对核孔进行观察后提出，由于核孔转 运活动如此频繁，过去认为的中央栓( c e n t r a lp l u g ) 也许只是转运过程中的转运复合体， 而并非核孔永久结构，而且在转运复合体通过核孔的整个过程中，核孔结构也不断变化【3 4 1 。 这些实验提示，核孔复合体处在高度动态变化中，而不仅仅是被动的通道。 3 3 不同生理状态下核孔蛋白的结构变化 核孔复合体可以通过内部分子重组来调整转运状态。目前还不清楚这种调控只限于单 个核孔，还是整个细胞核的所有核孔都发生了改变。一般认为，大多数的核孑l 复合体同时 具有输入与输出能力p 5 1 ，但最近在酵母中的研究发现，靠近核仁的核孔可能不能输出 m r n a d 6 i 。由此可见，不同细胞的核孔类型可能不同，单个细胞核的核孔类型也可能不同。 此外，核孔的通透性是可调控的，细胞可以通过调整核孔复合体的分子结构来满足不 同核质转运的需要。分裂细胞和静止细胞核孔的通透性不同。在出芽酵母整个细胞周期中， 核膜不裂解，核孔复合体结构完整，大多数的核孔复合体和入核分子也没有位置变化，但 在核孔上发生了更为精细的调整。在有丝分裂中，n u p l 5 3 p 通过变构改变其结合对象，使 依赖k a p l 2 1 p 的入核通路受到抑制，同时n u p l 5 3 p 的变构也启动了有丝分裂下游事件，如 m a d 2 p 从核孔复合体上释放，并与着丝粒结合等口”。在细胞凋亡的研究中也发现，凋亡过 程中核孔功能受损，但电镜下核孔的形态结构始终完整。这主要是由于c a s p a s e 只降解少 数核心核孔蛋白中某些肽段( 如n u p 9 3 和n u p 9 6n 端的部分多肽) ，它们的降解引起广泛 9 的核质转运通路受阻和核孔通透性改变，但并未导致核孔整体结构的瓦解【3 8 】。最后，一 些病毒可以改变核孔复合体的组成，进而破坏f 常细胞r n a 和蛋白质的转运【3 9 1 。例如， 脊髓灰质炎病毒和鼻病毒感染过程中降解n u p l 5 3 和n u p 6 2 ，导致核蛋白不能入核h 0 。这 些例子说明，核孔内部分子的精细调控可以改变其通透性和转运状态，最终改变整个细胞 的生理状况。 核孔复合体动态变化的研究为核质转运的研究指出了新的方向。过去1 0 年中，核质 转运方面的工作进展迅速，但许多核质转运的模型是建立在带有n l s 及核输出信号序列 ( n u c l e a re x p o r ts e q u e n c e s ，n e s ) 的分子与转运受体识别、并与核孔蛋白f g 重复序列 相互作用这一基础上的，在转运受体与入核( 出核) 分子相互作用中，r a n 是关键的调节 分子1 4 “。以前认为核质转运的调控主要发生在入核分子和出核分子的修饰上，但最新的 研究发现一种新的机制，即通过核孔复合体的分子重组来调控核质转运【”l ，也许这是更 为高效的核质转运调控方式，这方面的工作将是今后核质转运研究领域的一个热点。 目前无论在细胞分化、不同生理状态，还是在病毒感染、细胞不同周期，或是在单个 细胞的某一特异细胞核膜的表面，人们发现的核孔调控现象还不多，不足以获得规律性的 结论，因此不能肯定这些现象是特例，还是生命的共同特征。虽然人们可以利用扫描电镜 观察转运过程中的蛋白质结构，但是核孔的组装速度和动态变化太快，这些大分子是按什 么顺序精确组装的，分裂期和间期细胞的核孔组装是否具有相同机制，不同生理状态下， 核孔组成和结构是怎样变化的等许多问题目前还不清楚。这些关键问题的解决有待于今后 活细胞显微成像技术和亚细胞水平的蛋白质定量技术的进一步发展。 本课题的研究内容和意义 s e a o l i 细胞是睾丸内与生殖细胞关系最为密切的体细胞，在生精细胞发育的整 个过程中，担负着支持、营养和调控的作用。s e r t o l i 细胞一方面调控着生殖细胞的发 育，但同时也会受到l e y d i g 细胞、生殖细胞、下丘脑和垂体等诸因素的影响。对s e r t o l i 细胞的研究将为生殖生物学和生殖技术的发展提供理论依据。 真核生物d n a 的复制、r n a 的合成均发生在细胞核内，而蛋白质的合成却是 在细胞质中进行的，两者之问的双向交流受到细胞核孔复合体的调控。核孔是核膜上 的结构和功能单位，多年来核孔结构一直是细胞生物学和生物物理学的研究重点，现 已提出了多种精细的结构模型。近十年来，核质转运过程及其分子机理的研究也进展 迅速。但核孔数量变化方面的研究目前还相当匮乏。核孔数量在一定程度上反映了细 胞的功能状态，甚至相邻细胞的功能状态。因此对细胞核孔数量的研究可以更好的了 解细胞功能。 最近的研究结果表明，睾丸s e r t o l i 细胞核孑l 的数量和分布受到l e y d i g 细胞雄激 素和或细胞因子的影响，同时s e r t o l i 细胞与精细管上皮周期的活动有密切的关系。 说明s e r t o l i 细胞核孔复合物的数量可能分别受到l e y d i g 细胞、精细胞及其他细胞的 影响。本课题以核孔数量为指标，以大鼠为研究对象，用l e y d i g 细胞特异性药物一 e d s ( 二甲基磺基乙烷，e t h y l e n ed i m e t h a n es u l p h o n a t e ) 诱导l e y d i g 细胞凋亡，并 用激光扫描共聚焦显微技术对s e r t o l i 细胞核进行断层扫描，统计计算核孔数量，分析 核孔数量变化情况，以此探讨s e r t o l i 细胞与l e y d i g 细胞的关系。同时，以小鼠为研 究对象，用b u s u l f a n ( 白消安) 去除精原干细胞，用同样的技术，计算和统计核孔数 量，揭示生精细胞与s e r t o l i 细胞的关系，以及核孔数量的调控机理。 一、实验材料 1 动物来源 第二部分材料与方法 1 2 只雄性成年s p r a g u e d a w l e y 大鼠，俸蘸3 6 0 - 4 0 0 克，购崮托医动物中心；1 2 只雄 性昆明小白鼠，体重约3 0 克，购自北医动物中心。动物喂养在1 2 小时光照、1 2 小时黑 跨静祭 串下，整由摄食、绞承，湛溲控翻在2 2 2 8 。 2 。主菠试割 e d s ( 二甲蕊磺基乙烷) 由本实验室台成；b u s u l f a n ( 白消安，购自s i g m a ) ；t r i z o l ( 货号1 5 5 9 6 。0 2 6 ，魏鸯i n v i t r o g e n ) ；反转录懿( m - m i nr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，赞号 m 1 7 0 1 ，购自p r o m e g a ) ；v i m e n t i n 一抗( 货号a b 7 7 8 3 ，购自a b c a m ) ；f i t c 标记山羊抗兔 二撬( 货号f i 1 0 0 0 ，购爨v e c t o r ) ，l 、鬏抗核孑l 蛋鸯一拣 一3 0 循环 7 2 h m lj 7 2 j o m i l q p c r 产物经1 i 琼指糖凝胶检测，电压1 0 0 伏，2 0 m in 。 2 3 小鼠睾丸指数的检测 分别称取小鼠，：右睾丸的重量，以及体重。按以f 公式引算黎丸指数： 犟丸指数= 盎衣犟丸i j i _ _ 均熏艇( 克) 体重( 克) x 1 0 0 0 0 2 4 小鼠f ：f 1 细精管的冰冻切片检测 从b u s u l f a n 处理组与对照缎分别取样，用冰冻切j 及免疫荧光技术( v i m e n t i n 染细 胞质，p i 染细胞核) 检测精缀二】_ ：_ _ 细胞是否去除。 3 。免疫荧光标记s e r t o l i 细胞核的核孔和细胞骨架蛋白- v i m e n t i n a 组织从一8 0 v 冰箱拿出后，于冰冻切片机( * 2 0 。c ) 内复潞1 0 分钟，1 0 u m 或1 2 9 i n 冰 冻切片。 b 室温跚l 二1 0 m i n 。 4 的多聚甲隧( p b s 配制o 0 1 m o l z i ，p t m 4 ) 稿：室瀑网定2 0 r a i n 。 p b s ( o 0 1 m o l ，p i t 7 4 ) 室温漂洗三次，每次5 m i n 。 每张载玻片滴加5 0 l2 b s a ，室温封闭4 0 r a i n ，湿盒孵育。 兔抗v i m e n t i n 按1 ：l o o 用p b s 稀释，每张载玻片滴加5 0g l ，4 湿盒孵育过夜。 p b s 室温漂洗3 次，每次】o m i n 。 f i t c 标记t | 羊抗兔二抗按1 ：1 0 0 用p b s 稀释，每张载玻片滴加5 0l l l ，室濑湿盒孵 育3 0 m i n ，敲光。 p b s 室温漂洗3 次，每次1 0 m i n ，蔽光。 小鼠抗核孔蛋岛一抗与a l e x af 】u o 国5 6 8 标汜。抗结合5 m i l l 后，室温孵育1 1 1 ，蔽光，： 去除抗：p b s 在室温漂洗3 次每次1 0 m i n ，蔽光。 4 的多聚甲群( p b s 配制0 0 i m o l i ，p h 7 4 ) 室漏围定1 0 m i n ，敝光。 p b s 审温漂洗3 次，每次5 r a i n ，蔽光。 滴加抗荧光褪色剂，每张斤子3 0 9 l ，透明指甲油劐边。 1 i i k i h n o 放入游盒中4 。c 蔽光保存，尽快镜检。 4 激光捆描共聚焦显微镜对s e r t o l i 细胞的核孔成像 蓄宠在低倍镜下，透过v i m e n t i n 技虱s e r t o l i 绸耱麓缨瑰孩。然焉遴遵1 0 0 嫠或6 3 僚 物镜对单个s e r t o l i 细胞核进行放大，同时电子放大z o o m 调致8 1 2 ，使单个s e r t o l i 细胞 的细胞核在屏幕中央。分别确定细胞核z 轴两端的焦距，进行系列扫描。扫描过程中， 用r o i 方式将背景隔离，只扫描目标细胞核，。 激光扫攒共聚焦显微镱( l e i c at c ss p 2 ) 对纂个s e r t o l i 细胞梭进行系列扫摇静主要 参数如下：氮氖绿( g r en e ) 激光器，激发光为5 6 8 n m ，发射光为6 0 3 n m ，物镜为1 0 0 倍油镜头( n a1 4 ，) ，或6 3 储水镜头( n a1 2 ) ，针孔( p i n h o l e ) 1 0 ( a i r y ) ，e x p3 ， p m t7 5 0 8 0 0 ，z o o m8 - 1 2 ，f o r m a t1 0 2 4 1 8 1 0 2 4 ，步躐( s t e ps i z e ) o 3 9 m ，线平均为8 的 系列扫糖，扫弦方式为x y z 。v i m e n t i n 羲二魏荧光采集为氢离子( a 玲激光器在4 8 8 n m 赴 激发，发射光为5 t o n m 。 5 图像处瑷及分析 主要貔嚣橡楚瑾款 孛为p h o t o s h o p ，l e i c a e o n f o c a ls o f t w a r e ，i m a g ep r op l u s ，i m a g e ，。 主要数据处理和分析软件为e x c e l ，s p s s 。软件搜用具体方法详见各软件说明。 单个细胞核的主要参数按以下方法计算： 1 总荧光强度( d e n s i t ys u m ) 一系列图的荧光强度俊( d e n s i t y ) 的累加 2 擎令拔臻荧光强度憨弱( n p cd e n s i 姆) = 蕈令缓季l 连续三张蚕冀中荧蠢强度总纛 3 相对核孔数量( n p ch u m ) = 总荧光强度( d e n s i t ys u m ) 单个孩孔荧光强度总和( n p c d e n s i t y ) 其德舞渡和图像处理方法详见蚤软件说暖。 第三部分结果与分析 一、实验动物模型的建立和检测 1 大鼠l e y d i g 细胞的去除和检测 1 1 e d s 处理后，大鼠睾丸指数的变化 从下图可以看出，与对照组相比，e d s 处理后的6 只大鼠睾丸指数明显下降，与对 照相比差异显著p 0 0 1 。 图1e d s 处理后睾丸指数的变化( p 0 0 1 ) 鼎 靶 芸 肼 睾丸指数= 【左右睾丸平均重量( 克) 体重( 克) x 1 0 0 0 0 1 2 e d s 处理后，3 1 3 - h s d 表达的变化 3 p h s d 是睾酮合成途径中最后一个关键酶，也是l e y d i g 细胞的标志性分子。从图 2 a 中看出，1 - 6 为e d s 处理过的6 只大鼠，3 d h s d 已基本检测不到，说明l e y d i g 细 胞已经凋亡。而对照组的6 只大鼠3 d h s d 表达正常。图b 中d a c t i n 为内参，无论对照 组还是处理组，b a c t i n 均有表达。 图2 r t - p c r 检测l e y d i g 细胞标志分子3 b h s d a l e y d i g 细胞标志分子3 p h s d 的扩增条带，约8 9 0 b p 。b 1 3 - a c t i n 的扩增条带约5 8 0 b p 。 1 - 6 是e d s 处理组的6 个大鼠的样品，7 - 1 2 是对照组的6 个样品。m a r k e r 为天根公司d 2 0 0 0 2 小鼠精原干