（遗传学专业论文）采用mrna差异显示技术分离家蝇幼虫免疫相关基因的研究.pdf

摘要摘要昆虫虽然没有像高等生物那样的特异性免疫系统，但在受到病原体感染后，体内能产生多方面的生理生化反应，抑制或杀死病原体。家蝇( 缸g 面所四f f c 口)在昆虫中占有极其重要的地位，表现出极强的适应恶劣环境的能力，对其免疫防御系统的研究具有非常重要的理论意义和实际应用价值。本文采用脚a 差异显示p c r 技术，对比了家蝇幼虫在受到大肠杆菌( 西c 抛r f c 矗缸f f ) 感染后，基因表达发生的变化。通过对差异片段的回收，克隆测序，n o n h e m 点杂交验证，最终确定了1 0 个诱导后差异表达的真阳性c d n a片段，其长度为1 4 0 一8 2 4 b p 不等。经g e l l b a n k 同源性分析发现，这l o 个片段的氨基酸翻译序列分别与不同物种的不同氮基酸序列有较高的同源性。y g 2 0 一6 0 0 翻译的氨基酸序列与意大利蜜蜂的酚氧化酶原激活因子有3 6 的同源性( e 值为4 e - 2 2 ) ；y g 5 3 7 0 翻译的氨基酸序列与棕尾别麻蝇的前脂肪体蛋白有高达9 2 的同源性( e 值为4 e 5 4 ) ；y a 2 4 1 9 0 翻译的氮基酸序列与家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂有6 5 的同源性( e 值为2 e 0 8 ) 。其它片段也分别与相应物种的幼虫表皮蛋白、组织蛋白酶、真核细胞翻译起始因子、溶菌酶、n a d h脱氢酶亚单位、a t t a c i n 抗菌肽等有较高的同源性。这些基因都直接或闻接地参与了家蝇幼虫免疫调节的生理过程。其中有些基因是近年来刚刚被发现并起步研究的，其结构特征和作用机理还不明确。本文分离出的差异显示片段为家蝇乃至整个昆虫纲的免疫防御系统的研究提供了参考数据。关键词；家蝇幼虫诱导m r n a 差异显示昆虫免疫防御系统b l a s ta b s t r a c ta b s t r a c ta f e r m f b 嘶d 、) l ，i 也p a t l l o g e i i ，v a r i o l l sp h y s i c a l 强db i o c h e i l l i c a lr c a 嘶。璐c a nb cd c t e c t e di nt h eb o d i e so fi n s e c 晦w l l i c hl e a d st 0r c s t r a i n i n go rk l l i i l gl 量l ep a t l l o g e n ，出o u g ht h ei n s c c t sh a v en os p e c i f i ci m m 叫ed c f 萌c el i k en l el l i g h e ra i l i m a l s h o u s e f l yl 胁s 阳面州甜f 缸) i so n eo f t l l em o s ti m p o r t a mi n c t s 锄dh 髂蜘切1 9a b i l i t yt oa d a p tt ot h ea d v e r s ec i r c u r n s t a n c e i ti so fm o m e n t o u st h e o r e t i c a l 锄dp m c 虹c a ls i 鲥f i c a n c et or e s e a r c ht h ei l 玎咖l | i l i t ) rs y s t e mo f h o u s c f l y w bw e r e 鲥吼r co ft h ea l t e r a t i o no fl a r v 神o fh o l l s e f l yi ng e n ee x p r e s s i o nb yl l s i n g 恤m e m o dd d r t - p c ra 船m e s ei 邶e c 招w e r ei i l f c c t c dw i m 西c 妇，砌幻疗1 e nd i 羝r c m i a l l ye x p r e s s e dn l l ep o s i t i v ec d n af h g m e m s ，w i l i c hw e r e1 4 0t o8 2 4 b p1 0 n w e r ea s c e r t 痂e da r e rt h e 舱c o v c r e d 觑g m e m sw e r ec l o n e d ，s e q u e n c e da n dt c s t i f i e db yn o n h 锄d 0 tb l o t t i i l g t h e nw ep e r f b m 川h o m o l o g o 邺孤a l y s i sa n dk n o 啪t l l a tt h ea m i n oa c i d 辩q l l e n c ed e d u c e d 丘d mt l l e s e1 0 如g m e n 乜s h o w e dr e m a r k a b l es i i i l i l 缸w i t hs o m ea m i n oa c i d q u e l l c e so fo t h e rd i 饪b r e n ts p e c i e s t h e蛳i n oa c i ds e q u e i l c ed e d u c e d 矗o my g 2 0 一6 0 0s h o w e d3 6 s i i i l i l a r i t yw i n l 和括坍e 口掘m 正v a l u e = 4 e - 2 2 ) ；l e 锄i n oa c i ds c q l l e n c ed e d u c e d 舫my g 5 3 7 0s h o w e d9 2 s i n l i l 撕t ) ，耐t h 跚咖影p e 懈r 伽e ( ev a l u e = 4 e 一5 4 ) 锄dm e 锄抽oa c i ds e q u e n c ed e d u c e d 舶my a 2 4 1 9 0s h o w e d6 5 s i m i l 撕t yw i t l l 肋m 鱼垮m 酬( ev a l u c = 2 e - 0 8 ) 0 t h e r 丘a g m e n t sa l s os h o w e dh i g l lh o m o l o g yr e s p e c t i v e l y 晰t hl a “a lc u t i c l ep r o t e i n ，c a t b 印s i l le ，蝴o t i c 衄n s l a t i o ni 1 1 i t i a t i o n 缸t o r ，l y s o 巧m e ，n a d hd e h y d i o g e n 嬲es u b u i l i t ，a t t a c i no fr e i 钾a n t 印_ e c i e s t h e s eg e n e sa i s 0p l a yar o l ei np h y s i o l o 百c a lp r o c c s so fi m m u n er e g i l l a t i o no fl a n r o fh o u s c n y i nr e c e n ty e a r sw ed e t e c t e dt h e s cg e n e s ，w h o s t n l c t i l r a lc h a m c t c r i s t i c s 锄de 珏b c tm e c h a l l i s m sa r cl n l d e f i n 吐a n d 赡i n e dt or c a r c ht l l e lt h e d n ai a g i n e n t sp r o v i d ec e r c a i nt h e o r e t i c a lb a s i sf o r 殉】d yo n 证l m u n es y s t e mo f h o u s e 日ya n de v e nt h ew h o l ei l l s e c t a ”k 昭w o r d s ：l a r v a co fh o u s e n y ，i n d u c c ，d d r t - p c ri m m 硼es y s i e mo fi n s e 瓯窜b i a s tn南开大学学位论文版权使用授权书本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。学位论文作者签名：卑放年s 冠&经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。指导教师签名：学位论文作者签名：解密时间：年月日各密级的最长保密年限及书写格式规定如下：内部5 年( 最氏5 年，可少于5 年)秘密1 0 年( 最氏l o 年。可少丁：l o 年)机密2 0 年( 最妖2 0 年，可少于2 0 年)南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：卑狄n 年岁月工乡日第一章前言第一章前言昆虫是世界上真核生物中最为繁茂的类群，据估计其种类达1 0 0 万种以上，。占整个动物数量的9 0 。除海洋外，其余所有的生态环境都有昆虫的分布，这表明昆虫有极强的适应能力和免疫防御系统【l l 。昆虫免疫系统与高等动物的免疫系统具有相似的生理功能，包括免疫防御( i 咖u n o l o 西cd c f e n c e ) ：如清除体内病原物、防止感染等；免疫稳定( i m m u n o l o g i ci 1 0 1 n e o s t a s i s ) ：包括清除体内衰老和损伤的细胞，维持机体的生理平衡以及免疫监视( i m m 硼o l o g i cs u r v c i l l a i l c e ) ：其主要作用是清除体内变异产生的异常( 肿瘤) 细胞，虽然这点在昆虫体内知之甚少，但目前尚未发现昆虫有肿瘤。昆虫免疫系统作为对生命周期短的小型生物的适应，与高等动物免疫系统相比有明显的不同。首先昆虫免疫系统没有明显的记忆功能，不能形成高等动物一次感染，终生免疫的生理现象；其次昆虫没有t 细胞和b 细胞，没有免疫球蛋白及完整的补体系统，缺乏特异的抗原一抗体反应，故其体液免疫基于初级和二级免疫应答。昆虫的免疫类似于高等动物的先天性免疫，而没有明显的获得性免疫【2 j 。第一节昆虫的免疫防御系统昆虫的免疫防御系统大致可分为：物理性屏障，细胞免疫，体液免疫三个层次，如下图所示：物理性屏障：体参消化道内腰等(昆虫免疫l细胞免疫：血细艟( 吞噬、结节和包被作用，。非特异一性免疫i，初级免疫应答：溶菌酶、凝集索、酚氧化酶等il体蔽免疫【= 级免疫应答：抗菌肚等图1 1 昆虫的免疫防御系统垂第一章前言昆虫的物理性屏障，如：体壁，对于外源病原微生物有阻挡作用。昆虫的细胞免疫主要有血细胞介导的吞噬( p h a g o c y t o s i s ) ，结节( n o d u l e ) 和包被作用( e n c a p “a t i o n ) 。昆虫的初级免疫应答是指在血淋巴中作为正常组分的蛋白或其它物质在昆虫受到伤害刺激后引起的迅速免疫应答，包括溶菌酶和凝集素的抗菌作用、酚氧化酶级联反应等；二级免疫应答是接受刺激后昆虫体内防御性蛋白的快速转录激活，例如，合成大量抗菌肽或其它多肽，这些分子主要是由脂肪体( f a t b o d y ) 和血细胞合成并释放到血淋巴中发挥作用的纠。1 1 1昆虫防御的物理性屏障昆虫表皮是阻止有害物质渗入体内的重要物理性屏障，主要包括体壁和消化道内膜等结构。昆虫体壁( b o d yw a l l ，i r i t e g 啪e n t ) 是躯体最外层组织，由胚胎的外胚层部分未分化的细胞所形成的皮细胞层及其分泌物( 表皮) 组成。体壁的保护作用体现在，一方面可防止体内水分的蒸发，以保持体内水分平衡，另一方面可防止外来物质的侵入，使其免受病菌感染、并可抵御杀虫剂等。昆虫的体壁结构如下图所示：体壁真度细胞底厦图1 2 昆虫体壁结构2层质酚mh腚层肺穑雕鼠产t皮皮e表表的上原一譬第一章前言昆虫的表皮分为上表皮和原表皮。上表皮蜡层内蜡质分子作紧密地定向排列，成为防止体内水分向外蒸发和外界水分渗入体内的主要防线，构成体壁的不透水性。黏胶层有保护腊层的作用。表皮质层主要成分为脂蛋白，被醌鞣化后性质十分稳定，具有高度抵抗降解的能力。多元酚层主要成分是鞣化的脂蛋白与多元酚的复合体，其中有多元酚氧化酶，在修复伤口时具有鞣化受损表皮的作用。原表皮是昆虫体壁最重要的结构，又可分为上下两层，主要含有几丁质一蛋白质复合体，构成了昆虫外骨骼的主要成分。其中几丁质是由n 一乙酰葡萄糖胺通过b 1 ，4 键连结起来的线性多捌”。表皮中的蛋白质种类很多。有报道认为，一种麻蝇( 勋即哪q 阴6 棚口细) 的幼虫表皮中至少含有5 0 种以上的蛋白质。从生化的角度来看，昆虫表皮蛋白质依然是一种很含糊的定义，一般将纯化表皮所得到的蛋白，称为表皮蛋白。大多数表皮蛋白的分子量为( 2 0 2 5 ) k d a 【2 】。昆虫表皮蛋白对某些细菌也有抵抗作用。可以阻挡病原菌分泌的酶进入体壁，限制酶对表皮的降解程度，还可以抵抗酶的降解，或抑制病原真菌的水解酶作用【5 l 。真皮细胞是单层细胞，下面是底膜，上面是表皮层，其主要功能为：分泌表皮层，组成昆虫体躯的外骨貉；分泌蜕皮液，在蜕皮过程中消化旧的内表皮，并吸收其产物合成新表皮物质；修补伤口；分泌绛色细胞。底膜( b a s e m e n tm 锄b m n e ) 是紧贴在真皮细胞层下的薄膜，w i g 羽e s w o 汕在1 9 5 6 年发现底膜是一种吞噬细胞分泌的，主要含有中性粘多糖，底膜使皮细胞和血腔分离。在电镜观察下，底膜是一层无定形的颗粒状层次，血细胞、剑梢感觉器、神经末梢及微气管等常附在底膜的内表面。底膜具有选择通透性，使血液中部分化学物质和激素进入皮细胞。1 1 2 昆虫的细胞免疫1 1 2 1 昆虫的血淋巴昆虫的循环系统( c i r c u l a t o i ys y s t e m ) 属开放式，不像哺乳动物那样具有与体腔完全分离的血管系统，它的整个体腔就是血腔( h e m o c o e l ) ，所有内部器官都浸浴在血液中。昆虫的血液，仅是一种循环体液，兼有哺乳动物血液和淋巴液的某些特点，故常称为血淋巴( h 锄o l y i i l p h ) 。血淋巴在体内循环，仅有一部第一章前言分途经背血管，其余均在组织器官间流动。该系统的主要功能是运输养料和代谢废物，维持正常生理所需的血压、渗透压和离子平衡，参与中间代谢，修补伤口，免疫应答等，但无输氧功能嘲。1 1 2 2 昆虫血细胞的防御反应昆虫的细胞免疫主要依赖其血淋巴中的血细胞对外来抗原或异物的吞噬、结节和包被作用。昆虫的血细胞来源于中胚层细胞。近年来，通过相差、透射与扫描电镜及生化染色的应用，一般认为主要有6 种类型的血细胞：原血细胞、浆细胞、粒细胞、珠血细胞、凝血细胞和类绛血细胞【7 】。浆细胞、粒细胞和凝血细胞是免疫反应中最重要的血细胞，其形态、功能均有明显不同。它们通过循环运动接触异物，而后通过特定的功能分子识别结合而产生防卫反应。近年来一些学者通过对血细胞表面决定簇的特点区别和鉴定某些血细胞类型。如伊蚊和果蝇等感染寄生虫后，有较大比例的血细胞有联结标记凝集素的作用。此外抗c e c r o p i a 浆细胞和粒细胞的特异性单抗既可用作鉴定，又可用以研究细胞的相互关系和来源。抗折翅蠊( 口肠6 e ，榔) 浆细胞的单抗仅识别蜚蠊的此类细胞，而对其它昆虫血细胞无作用吼吞噬作用( p h a g o c y t o s i s ) 是指单个细胞将外物吞入细胞内。小剂量微生物或颗粒入侵后常被吞噬。很多种昆虫的浆细胞是参与吞噬的主要细胞，细胞内含有溶酶体酶，并可产生广谱的抗菌蛋白等。其过程包括附着、识别、信号传导、伪足形成、摄入、吞噬体( p h a g o s o m e ) 装配、消化等多个步骤，是一种受体调节的免疫反应。而微生物源的一些多糖因子，以及昆虫体内酚氧化酶原活化过程可以刺激血细胞的吞噬作用，可能是受体识别和调理的重要活性分子来源。当小型病原物大量进入血腔时，浆细胞无法完全吞噬，即会发生结节作用( n o d l l l ef o r i i l a t i o n ) 。结节作用是指多个血细胞结合到聚集的细菌上。首先凝血细胞或粒细胞与病原物接触并发生破裂，诱导病原物周围血液凝集成块，将病原物固定在凝血块内，随后由血细胞破裂释放的异源凝集素，诱使浆细胞附着到凝血块周围，最后，周围的浆细胞扁平化，相互以桥粒联结形成外鞘，被包围的病原物在血细胞分泌的酚和酚氧化酶的作用下，逐步黑化死亡。包被作用( e n c a p s u l a t i o n ) 是指血细胞结合到大的靶标上。当线虫等较大的外侵物侵入血腔时，会发生包被作用。即将外侵物围困于多层血细胞构成的或4第一章前言黑化的外套包囊内，释放的酚类化合物逐步黑色素化，被包围的外侵物随黑色素化而被杀死。形成的结节和包被在超微结构水平上是一致的，表明这两种作用实质上是对不同靶标的同一过程。与吞噬作用不同，结节形成和包被作用最终导致血细胞在靶标的外围形成一层包膜【9 h o “2 】。很多资料表明，血细胞是影响黑化的因素之一。在易感宿主体内，疟原虫很少受到包被，但食蟹猴疟原虫在冈比亚按蚊抗性株体内引起包被。疟原虫经药物作用后，也会引起蚊血细胞的趋附【”l 。埃及伊蚊接种犬恶丝虫微丝坳后，在虫体或附近有血细胞溶解反应并有黑色素形成。寄生虫的黑化是昆虫免疫反应特点之一。猪巨吻棘头虫感染甲虫后，很多血细胞附着在棘头体囊胞表面，有些穿过囊胞，附着在虫体皮层，引起皮层受损，最后使部分感染性棘头体变性【1 4 1 。1 1 2 3 昆虫细胞免疫的机理昆虫血细胞与高等动物细胞相似，在其表面存在附着因子。这是一类含精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的三肽( r g d ) 配体，属整合蛋白( i n t e 鲥n ) 家族，包括纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ) 等多种高密度脂蛋白。血细胞的结节或包被作用，主要是由细胞表面的受体与配体形成结合蛋白造成的。在家蚕中粒细胞和珠血细胞表面的p 1 ，3 葡聚糖识别结合蛋白( p 1 ，3 西u c 姐r e c o 蛳t i o n b i n d i n gp r o t e i n ，p g r p ) 口能对组成细菌细胞壁的p 1 ，3 糖苷键的葡聚糖有特异性识别能力，两者结合后引起b g r p 构象变化，激活丝氨酸蛋白酶( b a e e a s e ) ，进而激活酚氧化酶原级联( p r o p h e n o l o x i d a s ec a s c a d e ) 。同时，p g r p 与p 1 ，3 葡聚糖结合的复合体与粒细胞膜受体结合，引起粒细胞去颗粒化，并释放出贮存于细胞中更多的b g i 冲，随后这些新释放的p g r p 聚集于入侵真菌细胞周围，再激发酚氧化酶酶原级联反应。该反应启动后，相继刺激吞噬作用和包囊作用的调理素( o p s o i l i n ) 和激化因子( c h 咖。虹n e t i cf 如t o r ) 最终导致包被作用的产生。大豆夜蛾( 觑删晒如胁加d 诎邶) 中含r g d s 序列的肽能促进浆细胞( 非粒细胞) 的包被作用，但对吞噬作用无效1 6 】。1 1 3 昆虫的体液免疫昆虫体液免疫依赖血淋巴中产生的初级免疫应答和二级免疫应答。这两种应答产生的免疫因子主要由脂肪体、血细胞和围心细胞合成，马氏管、中肠、第一章前言生殖器官以及受伤或受感染的真皮细胞也有一定的合成能力。初级免疫因子或称先天性免疫因子也可因诱导而得到增强，包括溶菌酶、凝集素、抑血细胞凝集素、酚氧化酶等。二级免疫因子或称后天性免疫因子需要人工或自然的诱导，如抗菌肽( 蛋白) 和抗真菌肽等。同种昆虫中有多种相互协调的免疫因子。它们对微生物的作用包括水解微生物的细胞膜或细胞壁，破坏其通透性；抑制微生物的物质代谢；阻止细胞增殖；代谢产生的细胞毒性物质还能杀死或钝化外源物。1 1 3 1 初级免疫应答( 1 ) 溶菌酶溶菌酶( 1 y s o 巧m e ) 是最先从昆虫血淋巴中纯化的抗菌因子。至今已从柞蚕、果蝇、家蝇、家蚕等昆虫中克隆出了溶菌酶序列。溶菌酶是昆虫体内的正常组分，但可受异物诱导而大量增加。其分子量约为1 4 k d a ，主要由脂肪体合成。它能抗革兰氏阴性细菌，但并不直接杀死细菌，而是通过水解细菌胞壁物质，即水解粘多糖中的n 一乙酰葡萄糖胺和n 一乙酰胞壁酸之间的b 1 ，4 键发挥作用，除去抗菌肽作用后剩下的菌胞壁质囊( m u 陀i i ls a c c u i u s ) 。j a i l l 等【”l 从注射过大肠杆菌的印度柞蚕0 h 肪e r 卯口叼0 豇f 口) 中纯化了一种溶菌酶t s w a b ，并对其晶体结构进行了研究，发现t s w a b 的核心结构与c 一型溶菌酶和a 一乳清蛋白非常相似包括三个外显子及两个内含子。外显子在基因组中的组织形式与脊椎动物溶菌酶相似。另一类蛾类的溶菌酶基因与鸡蛋溶菌酶不同，对革兰氏阳性细胞有强烈抑制作用，并能被入侵细菌侵扰诱导表达。果蝇溶菌酶基因仅在消化道中表达，且可能与食物中细菌有关，还会因细菌入侵而被抑制。( 2 ) 凝集素凝集素是昆虫体液防御的组成因子之一，它是一类糖结合蛋白，能专一地与细胞表面单糖、寡糖结合，具有凝集细胞的作用，能凝集外来的微生物，并介导血细胞对其包被和吞噬，从而有效地防御病原体入侵。自从b e m h e i m e r ( 1 9 5 2 ) 最早报道鳞翅目昆虫血淋巴中的凝集素以来，人们陆续在家蚕d 聊6 畛肌d r f ) 、柞蚕0 n 肪p m e 口妒h f ) 、惜古比天蚕( q 咐f d p 幻阳卯c 唧动、蓖麻蚕( 砌洳朋研胁c ”胁衍肪加f ) 和樗蚕( 肋砌期肌幻c f 矗动中发现了凝集素，并对其进行了分离纯化和特性研究【1 6 1 。凝集素相对分子质量一般较大，家蝇凝集素由一个单体组成，相对分子质量为3 3 k d a ，凝血实验表明其均没有凝血活性【 l 。在家蚕中分离到6第一章前言较特别的凝集素，这个蛋白类似于高等动物血小板凝集因子，其合成的前体为3 4 3 k d a ，而后转化成2 8 0 k d a 的成熟蛋白，内含哺乳动物甘露糖结合蛋白的相似片段，可由注入肽葡聚糖、脂多糖和大肠杆菌刺激合成，在家蚕变态发育时也出现。同一昆虫中存在不同的凝集素，前人已有报导。c h e n 等( 1 9 9 3 ) 从折翅蠊血淋巴中分离纯化出三种凝集素，这三种凝集素均存在于同一发育时期。彭金荣和孙册( 1 9 9 1 ) 发现，在蓖麻蚕幼虫期存在糖专一性不同的两种凝集素，但未见这两种凝集素纯化的进一步报道。裴炎等在2 0 0 1 年研究棕尾别麻蝇血淋巴凝集素时，用亲和层析法纯化了棕尾别麻蝇幼虫和蛹血淋巴中各自存在的两种凝集素。二者在分子量与特性上有明显不同。幼虫凝集素为单体，分子量为7 3 k d a ；蛹的血淋巴凝集素则由两种亚基组成，亚基的分子量分别为3 0 和3 2 k d a 。在糖的专一性上，二者也有较大差异，幼虫凝集素的抑制糖为n 一乙酰半乳糖胺、乳糖和岩藻糖，而蛹凝集素则为甘露糖胺、半乳糖胺和葡萄糖胺。用兔红细胞吸附幼虫血淋巴凝集素后，制备的抗血清对幼虫血淋巴的凝集活性有明显抑制，而对蛹的凝集活性无抑制作用，进一步表明棕尾别麻蝇幼虫和蛹的凝集素是不同的两种凝集素【i 引。以上发现也表明，昆虫凝集素的结构有可能是随着其生长发育而变化的。虽然凝集素是昆虫体液的正常组分，但当昆虫受到物理的、化学的、生物的诱导源所诱导，血淋巴中的凝集素活力可明显增高。我国学者发现几种蚕蛹和家蝇三龄幼虫人工诱导后，凝集素的浓度增加。以针刺、印c 0 r y 射线辐射、超声波、紫外线作诱导源，也可提高血淋巴的凝集活性。( 3 ) 酚氧化酶及其级联反应昆虫酚氧化酶( p h e n 0 1 0 x i d a ) 是一个重要的免疫防卫因子，通常以酚氧化酶酶原( p r o p h e n o l o x i d a s e ，p r 0 p 0 ) 的形式存在于血淋巴中。p m p 0 由浆细胞和凝血细胞合成并释放于血淋巴。在某些昆虫中发现表皮和中肠细胞中也存在。酶原正常情况下在昆虫体内以二聚体存在，含有两个大约为8 0 k d a 的亚基。当昆虫受到外界微生物的入侵和伤害时，酚氧化酶原会裂解成酚氧化酶( p o ) ，参与机体的免疫防御反应【1 9 】。这个裂解过程是通过特异性丝氨酸蛋白酶的级联反应( p p o 级联) 实现的。细菌或真菌细胞壁成分一肽聚糖、b 1 ，3 葡聚糖分别能与昆虫体内的肽聚糖识别结合蛋白( p e p t i d o g l y c 趾r e c o 鲥t i o n ，b i n d i n gp r o t e i i l p g r p ) 【2 0 l 和p - l ，3 一葡聚糖识别结合蛋白( p 1 ，3 出u c 强r e c o g l l i t i o n ，b i n d i n gp r o t e i i l ，p g r p ) 】发生特异性结合使其活化，从而活化p p o 。细菌的另一细胞壁成分一脂7第一章前言多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d c ，l p s ) 也能启动p p o 级联。但这个级联反应的具体过程至今尚未阐明。酚氧化酶( p h e n o l o x i d 撇，p o ) ，又被称为酪氨酸酶，是一种含铜离子的氧化酶，可根据其氧化底物的不同，将其分为单酚氧化酶( m o n o p h e n o l o x i d a ，m p o )和双酚氧化酶( d i p h e n 0 1 0 x i d 船e ，d p o ) 。单酚氧化酶催化酪氨酸羟基化成为l d o p a ；双酚氧化酶能氧化双酚物质( 如l d o p ：a 、多巴胺、n 一乙酰多巴胺) 成为醌，醌又可进一步转变成黑色素。黑色素实际上是由酪氨酸或多巴衍生的o 一氢醌和或0 一醌及由5 ，6 一双羟吲哚衍生的吲哚单体组成的杂多聚体。随后研究在多种昆虫中证实，黑化反应是一个重要的免疫防卫反应。其一是酚氧化反应过程有利产生各种过氧化物自由基和羟基自由基，这些物质表现出极强的细胞毒性，可以直接杀死侵入的微生物。其二是氧化产生的醌类和黑色素，可使蛋白质鞣化，因而可钝化微生物，阻止其在体内扩散漫延。此外，酚氧化酶及其活化过程中的产物，在免疫过程中还可能存在识别和启动其他免疫过程的作用。酚氧化酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、真菌中均可检测到其活性，甚至在一些原核生物中也检测到了酚氧化酶的活性。目前已从昆虫纲鳞翅目的家蚕肋m 6 协m d ，f 、烟草天蛾m 研咖船x 胁、大腊螟g 口耽，细m g ，f d 肥妇、金星栲叶槭大蚕蛾劬却 o m 卯印缸，双翅目的黑腹果蝇d 忉s 印厅池肌p 砌唧s f p r 、冈比亚按蚊4 ，哪 p 胁g 口肌她卵，鞘翅目的东北大黑鳃金龟王f d z d f e 配 细饿d 州琥础口，直翅目的蜚蠊肋6 e r 嬲咖c d 砌脚、亚洲飞蝗三卯淞幻j ，l 诤懈f d ，蛔和甲壳纲的蜊蛄p d c f 7 孙m c 淞跆珂f 螂c “，埘等节肢动物血淋巴中分离鉴定出了酚氧化酶原，进而又克隆出了蜊蛄、家蚕、烟草天蛾、黑腹果蝇、聊 册砌c 堋e 口、冈比亚按蚊、骚扰阿蚊4 m 4 旭，s “6 耐6 n f 珊( c o q u m e n ) 等酚氧化酶原的c q a l l 9 l 。( 4 ) 章鱼胺章鱼胺( o c t o p 咖i n e ) 是无脊椎动物神经系统中普遍存在的多种微量生物胺之一，作为其体内的神经递质，发挥重要作用。因其也广泛存在于昆虫的血淋巴中，发挥免疫功能，所以在此也把它归为体液免疫的初级免疫应答因子。章鱼胺又名章鱼涎胺或真硝胺，化学名称为：卜( 4 羟基苯基) 一2 一氨基乙醇，因首先被发现存在于软体动物章鱼的唾液腺中而得名1 2 ”。不良的生存环境对昆虫体内的章鱼胺分布及含量变化将会产生不同程度的影响。在大蜡螟体内受病原微生物感染以后，血淋巴中章鱼胺含量上升。章鱼胺可能成为一种血细胞激动素，初始非自体触发之后，激发血细胞的活性。但第一章前言一种真正的血细胞激动素原酶氧化酶并不是由章鱼胺激活的。章鱼胺和激活的原酶氧化酶系统促进血淋巴中细菌的死亡。章鱼胺因为具有氨基团，在大蜡螟血淋巴p h 6 5 的情况下带有正电荷，阳离子溶菌酶结合到细菌的负电荷表面，促使细菌粘附到昆虫血细胞上，章鱼胺的正离子电荷结合到带负电荷的蜡状杆菌最卯旭淞和z 厅p m 砸聊b 玎搬上，并促进血淋巴中细菌的死亡。氨基可能在抗原与血细胞之间像外源凝集素( 1 e c 缸) 一样作为分子桥加强细菌与血细胞的结合，或者由于细胞表面较弱的负电荷，减低了细胞之间静电斥力而增加凝聚力。因此在章鱼胺的介导下，促进了血细胞之间凝集和对细菌的包围。无论凝集作用和包被作用都引起细菌死亡【2 l 。( 5 ) 血素在天蚕蛾和烟草天蛾体内分离到的血素，是1 个含有重复免疫球蛋白序列的蛋白质，分子量为4 7 k d a ，一般血淋巴中含量极低，注入细菌后可激发其合成并使之达到l 7 m g m l 的浓度。这种蛋白粘着到细菌或细胞表面，可刺激血细胞的吞噬。在果蝇体内也发现与哺乳动物吞噬细胞受体活性一样的蛋白质，可以调节血细胞的吞噬作用。因此，昆虫虽然没有抗体一抗原识别机制，但仍有一些类似高等动物辅助细胞对异物识别或免疫细胞对非胸腺依赖性抗原的识别机制，依赖体内特定的受体蛋白的结合，启动免疫反应1 2 】。1 1 3 2 二级免疫应答一抗菌肽抗菌肽是昆虫体液免疫的一个重要组分。1 9 7 2 年瑞典科学家b o m 孤等首先从天蚕蛹的免疫血淋巴中分离得到高效抗菌肽c e c r o p i n 【2 3 1 ，后又从家蚕、柞蚕、蓖麻蚕等多种昆虫中分离到抗菌肽。目前已发现的昆虫抗菌肽有1 7 0 多种，研究表明昆虫抗菌肽具有广谱抗菌性，对耐药菌株有明显的杀伤作用，同时对生物体的细胞无破坏性，无免疫原性，它的生成和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入侵的重要屏障，应用前景十分广阔。尽管昆虫抗菌肽在分子大小和氨基酸组成上各不相同，但其共同特点也相当明显，通常其分子量小于5 k d a ，具热稳定性，为碱性肽类物质，大部分形成a 螺旋结构和b 片层结构或二者的混合结构【2 4 】。( i ) 昆虫抗菌肽的诱导众多研究结果表明，物理的、化学的、生物的因子经不同的诱导方式均可诱导产生抗菌肽。如下表所示：9第一章前言表1 1昆虫免疫研究常用诱导源与诱导方式抗菌肽是非专一免疫应答的产物，即诱导源与诱导产物之间无特定的对应关系，不同诱导源可诱导产生相似的抗菌物质。如：屈贤铭等用超声波或直接用大肠杆菌注射处理家蚕( 肋圻鱼垮埘d 一) 、蓖麻蚕( m f f 0 阳m 砌( 咖呐幻r 耙打m )或柞蚕( 4 ，z 砌p 阳p 口p p 删f ) ，均可诱导这些昆虫产生抗菌物质。电泳结果表明，同一种蚕蛹经不同诱导源诱导后形成相同的抗菌物质，而不同种属物种被诱导产生的抗菌物质则有明显的差异【2 ”。单纯化学试剂诱导不如由化学试剂加上大肠杆菌的混合诱导产生的抗菌活力耐2 6 l 。免疫后的昆虫再受到病原微生物感染时，机体具有较强的抗病力。不同抗菌肽经诱导源诱导后，开始出现和达到高峰的时间各不相同。如对天蚕的抗菌肽研究表明，天蚕素基因a 、b 、d 活动时间并非同步。天蚕素a 和b 基因的转录在感染细菌后2 小时出现，4 8 小时后达到峰值，此后数天持续高表达；天蚕素d 则延后4 8 9 6 小时出现反应，而1 1 4 小时后达到表达高峰。与以上结果相对应，感染后l o 一2 4 小时血淋巴中可以检测到成熟的天蚕素a 和b ，而成熟的天蚕素d 却在4 8 小时后才能检测到1 2 ”。这说明各种抗菌肽基因的表达调控具有严格的时序性。( 2 ) 昆虫抗菌肽的分类和结构特征根据各种昆虫抗菌肽的氨基酸组成和结构将其分为4 类：【2 s j c e c m p i n ( 天蚕素) 类昆虫抗菌肽。富含c y s 残基的昆虫抗菌肽( 昆虫防御素) 。富含p r 0 残基的昆虫抗菌肽。富含g l y 残基的昆虫抗菌肽。从总体来看，各种抗菌肽的一级结构都比较相似，来自不同昆虫的抗菌肽，具有下列共同的特性：n 端亲水，c 端疏水，n 端是稳定区，含有色氨酸、赖氨酸和精氨酸残基，c 端含有甘氨酸或脯氨酸残基，中间连接部分含有脯氨酸残基；有2 个a 螺旋，2 个螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区域；分子量小，大约4 k d a ，是半抗原；在动物体液系统中具有广谱杀菌、抑病毒、l o第一章前言抑杀肿瘤细胞等作用，是一类具多种活性的多肽；耐热，稳定性强，1 0 0 3 0 l i l i n 不破坏其抗菌活性；不会诱导耐药菌株的产生。抗菌肽广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物界，是天然免疫的主要成分。圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验均表明各种抗茵肽还具有相似的二级结构：在一定条件下都能形成a 螺旋或b 折叠，a 螺旋的位置可分别处于肽链的n 端、c 端或者整条肽链。甜螺旋是一个近乎完美的水脂两亲性结构，即圆柱形分子的纵轴一边为带正电荷的亲水区，对称面为疏水区。无论是以a 一螺旋还是以p 折叠形式出现，两亲结构是抗菌肽杀菌的关键。不同种类的抗菌肽又有其不同于其它抗菌肽的结构特点。如下所述：天蚕素类昆虫抗菌肽天蚕素类抗菌肽以c c c r o p i n 为代表，主要存在于鳞翅目和双翅目昆虫中。现已从天蚕、果蝇、蜜蜂、家蝇等昆虫中分离纯化得到。其分子结构除了具有所有抗菌肽的共同特点之外，还有以下特点：a 由3 1 3 9 个氨基酸残基组成，分子量约为4 k d a 。b 。不含半胱氨酸，即不能形成分子内二硫键。c 有两个甜螺旋，其中n 端螺旋为双亲m 螺旋。以从果蝇中分离的c e c r o p i na 为例：它具有5 - 2 1 位( n 一末端) 和2 5 3 7 位( c 一末端) 的两个n 螺旋结构，两个甜螺旋结构之间的2 2 2 4 位氨基酸为一个丙氨酸( a l a ) 一甘氨酸( g l y ) 一脯氨酸( p r o ) 的结节部。其中5 - 2 l 位( n 卜末端) 的螺旋i 中极性与非极性氨基酸含量相当，对水和脂都具有亲和性，即为双亲的q 螺旋；2 5 3 7 位( c 一末端) 的螺旋i i 中疏水氨基酸含量高，疏水性强，且c 一末端的羧基被酰胺化 2 9 3 0 1 。d 在许多特定位置有较保守的氨基酸残基。如：2 位上的色氨酸( 1 b ) ，5 、8 和9 位有一个或两个赖氨酸( l y s ) ，1 1 位是天冬氨酸( a s p ) ，1 2 位是精氨酸( a 唱) ，有些位置尽管氨基酸残基种类不同，但仍为保守替换。e c e c r o p i n 分子的合成前体包含有6 2 6 4 个氨基酸残基，具有信号序列和前导序列，并含一个内含子。通过对5 2 种c e c r o p i n 及其类似物序列进行系统生化分析，并对其| i 体( 包含前导肽( p ) 和成熟肽( m ) ) 分别用n j 法进行聚类分析，结果显示c e c r o p i n 具有明显的目间差异( 昆虫c e c r o p i n 主要来源于鳞翅目和双翅目) ，鳞翅类和双翅类各聚成一支。在对前导肽进行聚类分析时，鳞翅目的家蚕c e c r o p i i l a 和b ，美国白蛾的c c c r o p i n 分别聚到一起。而在成熟肽则不如此，而是序列相似的蚕抗菌肽首先聚类。成熟肽作为蚕抗菌肽的活性部分，受其功能第一章前言制约，氨基酸突变较少，进化相对缓慢，而前导肽则更多地体现了物种进化的差异【3 1 1 。这类抗菌肽中还有一个代表就是麻蝇素i ( s a r a d t o x i i li ) 。目前，从经过刺激的棕尾别麻绳( 鼬m d p q 弘弘懈r 打船) 幼虫的血清中已经分离得到了三种麻绳素i ，分别被称为s 黜x i i lia 、ib 和ic 。它们结构相似，均具有3 9 个氨基酸残基( 仅有少数氨基酸不同) ，包含两个部分：n 一末端部分从卜1 9 位，含有9 个带正电荷的氨基酸，其中7 个是碱性氨基酸，亲水性很强；c - 末端部分从2 0 一3 9 位，除了末端的精氨酸( a r g ) 带正电荷外，其它氨基酸均是非极性的，是疏水性区域1 3 2 1 。富含c y s 残基的昆虫抗菌肽此类抗菌肽以昆虫防卫素( d e f c i i s i n ) 为代表，首先由m a s t u r y a l l l a 于1 9 8 8年在一种双翅目昆虫棕尾别麻蝇( & ，c 印蛔g n p e 憎g r f ，劫中发现。防卫素是研究的最为广泛的抗菌肽类。在半翅目、蜻蜒目、双翅目、鞘翅目，毛翅目和膜翅目中均存在。至今，昆虫纲中己有1 5 大类3 0 多种防御素被报道。此类抗菌肽还包括果蝇防卫素( d r o s o m y c i n ) 、麻蝇防卫素( 鼢p e c i l l ) 和死亡素( m a n a t i n ) 等，在结构上主要具备以下特点：a 富含半胱氨酸残基，形成l 一6 对分予内二硫键。如典型的昆虫d e f e m i n由6 个半胱氨酸残基形成3 个二硫键，其排列为c y s 卜c y s 4 ，c y s 2 一c y s 5 ，c y s 3 c y s 6 。这一结构与从哺乳动物体内分离得到的防卫素类抗菌蛋白分子基本相同。果蝇防卫素( d r o s o m y c i n ) 的8 个半胱氨酸残基形成4 个二硫键( c y s 卜c y s 8 ，c y s 2 - c y s 5 ，c y s 3 一c y s 6 ，c y s 4 一c y s 7 ) 1 3 ”。麻蝇防卫素( s a p e c i n ) 具有6 个半胱氨酸，形成3 个二硫键。死亡素( t h a i l a t i n ) 的两个半胱氨酸残基形成分子内的二硫键。b 具有反向平行的b 片层结构，有的还含有一个a 螺旋结构。这种结构依靠分子内二硫键柬维持。如d e f e n s i n 在三维结构上是一个紧密折叠的球形结构，含有一个末端氨基化的环状结构，一个居于中部的洳螺旋结构和一个双链的c 一末端p 片层结构。p 片层结构的第一链通过二硫键c y s 卜c y s 4 与末端氨基化的环相连，第二链通过二硫键c y s 2 一c y s 5 、c y s 3 一c y s 6 与中部的洳螺旋结构相连，共同构成a b p 的空间结构口4 埘l 。对果蝇防卫素( d r o s o m y c i n ) 三维结构研究发现，由于c y s l c y s 8 的存在，d r o s o m y c i n 形成了更为紧密的空问结构，p 片层结构在n 一末端延伸处多出一条链，其中的短链与c 一末端的半胱氨酸残基通过1 2第一章前言c y s 卜c y s 8 形成的二硫键相连，整个分子构成p 吨b p 的空间结构。c 分子量约为4 k d a - 6 k d a ，大多由3 8 4 3 个氨基酸组成。但也有一些例外，如死亡素t l l a l l a t i n 分子中含有2 1 个氨基酸残基；棕尾别麻蝇( 黝m d p 砸龋p p 地矿打埘) 中分离得到的麻蝇防卫素b ( s a p e c i i lb ) ，由3 4 个氨基酸组成；从膜翅目昆虫意大利蜜蜂( 爿p 括m p f ? 咖，玎) 中分离得到的蜜蜂防卫素( r o y a l i s i n ) ，由5 1 个氨基酸组成。富含p m 残基的昆虫抗菌肽这是上世纪8 0 年代末才发现的一种新型昆虫抗菌肽。1 9 8 9 年，由c a s t e e l s等从膜翅目的意大利蜂( 4 坍鲫瞻m ) 中首先发现。后又在膜翅目、双翅目、半翅目和鳞翅目昆虫中分离得到。如：从蜜蜂中分离到的a p i d a c c i n ，从果蝇中分离得到的d r o s o c i n ，从红蝽中分离到的p y r r h o c o r i c m 和m e t a l n i k o i l i m 等。这类抗菌肽的共同特点有：a 富含脯氨酸残基p r o ，脯氨酸含量大于2 5 。如；蜜蜂抗菌肽( a p i d a e c i n )p r o 含量达3 3 ；蜂蛾抗菌肽( a b a e c i n ) p f o 含量为2 9 。b 都含有精氨酸一脯氨酸( a 玛一p r o ) 或者赖氨酸一脯氨酸( l y s p m ) 的氨基酸对，有些带有典型的精氨酸一脯氨酸一精氨酸( a 唱一p r o a 玛) 结构【3 6 1 。c 由1 5 3 9 个氨基酸残基组成，分子量为2 4 k d a 。d 此类抗菌肽有一些在特定位置的氨基酸残基上有o 糖基化结构。例如：分别来源于果蝇和无翅红蝽( p 妒柏d 胁印御淞) 的d r o s o c m 和p y r d l o c o r i c i ”。这两类抗菌肽分子中脯氨酸的含量均达到3 0 ，而且都在第1 1 个氨基酸残基( 苏氨酸) 上发生糖基化作用【3 8 】。不同之处在于d r o s o c i n 的苏氨酸残基上连的是n 一乙酰半乳糖胺一半乳糖；而p y 玎i l o c o r i c i n 则在相应的位置连的是n 一乙酰半乳糖胺。用水解酶去除分子中的糖基后，抗菌肽的活性也随即消失，表明分子中的糖对维持抗菌肽的活性是必需的。富含g l y 残基的昆虫抗菌肽a t t a c i n 又名凝集素、攻击素，是首先被发现的此类抗菌肽，于1 9 8 3 年从惜古比天蚕( 助捌印 删钟咖p 细) 中被分离出来。后又发现了鞘翅目的鞘翅肽( c o l e o p t e r i c i n