（营养与食品卫生学专业论文）微波固相合成葡寡糖及其抗氧化与免疫功能研究.pdf

摘要 微波固相合成葡寡糖及其抗氧化与免疫功能研究 学科、专业：医学、营养与食品卫生学 硕士研究生姓名：刘云 指导教师：施用晖 摘要 入学时间：2 0 0 7 9 答辩时间：2 0 0 9 7 授予学位时间： 本论文对微波固相合成葡寡糖进行了合成工艺的优化，并对产物寡糖的体外抗氧化 活性及对小鼠氧化应激与炎症反应的调节作用进行了研究，最后评价了葡寡糖产物的食 用安全性及大剂量摄食葡寡糖产物对小鼠体内抗氧化系统的影响。 使用隧道式微波加热设备进行固相合成葡寡糖，采用三因素三水平通用旋转组合设 计优化合成条件；选取三种不同聚合度的微波合成葡寡糖产物( l g o s 、m g o s 、h g o s ) 进行体外清除自由基( o h 、d p p h 、a b t s + ) 及对小鼠氧化应激与炎症反应的研究， 昆明小鼠每日分别灌胃生理盐水、果寡糖( f o s ) 、不同聚合度葡寡糖( l g o s 、m g o s 、 h g o s ) ，2 1d 后，腹腔注射脂多糖( l p s ) 诱导小鼠建立氧化应激与炎症反应模型，检 测抗氧化指标( r o s 、g s h p x 、c a t 、t - a o c 、m d a ) 与细胞因子指标( i l 一1 、t n f - a 、 n o 、n o s ) ：通过急性毒性试验及3 0d 喂养试验，来评价葡寡糖产物的食用安全性及大 剂量摄食葡寡糖( 2 o 、4 o 、8 o 添加量) 对小鼠抗氧化系统的影响。 试验结果：( 1 ) 微波固相合成最佳工艺条件：葡萄糖反应物质量为3k g 时，微波加 热时间2 8 3m i n ，催化剂添加量4 4 ，引发剂添加量1 9 6 ，最大产物转化率为8 0 1 。 ( 2 ) 三种不同聚合度葡寡糖产物在体外具有很好的清除自由基能力。灌胃0 5g k g 的不 同聚合度葡寡糖产物能显著降低l p s 诱导小鼠全血、肝脏的r o s 水平，显著提高血浆 及肝脏抗氧化酶( g s h p x 、c a t ) 活性及总抗氧化能力( t - a o c ) ，显著降低m d a 含量， 抑制细胞因子( i l 一1 、t n f 氓n o ) 的释放及i n o s 活性。相关性分析表明葡寡糖可能 通过提高机体的抗氧化能力来达到对氧化应激与炎症反应的调节。( 3 ) 葡寡糖的急性毒 性l d 5 0 大于1 5g k g b w ，属于无毒级别，摄食不剂量葡寡糖产物可以提高小鼠的抗氧 化能力。高剂量组( 8 0 ) 肾脏t - a o c 较正常组显著降低、m d a 显著升高，高剂量( 8 0 ) 摄入葡寡糖产物可能使肾脏抗氧化能力下降。 关键词：葡寡糖；微波；抗氧化；免疫；自由基 a b s t r a c t i nt h i s p a p e r , t h es y n t h e s i s c o n d i t i o n so fm i c r o w a v es o l i d p h a s es y n t h e s i z e g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sw e r eo p t i m i z e da n dt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yi nv i t r o ，t h er e g u l a t o r y f u n c t i o no ft h eg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e so nt h eo x i d a t i v es t r e s sa n di n f l a m m a t o r yr e s p o n s ew e r e s t u d i e d f i n a l l y , w ee v a l u a t e dt h ef o o ds a f e t yo ft h ep r o d u c t sa n di t se f f e c to na n t i o x i d a n t s y s t e mo ft h em i c ef e dh i g h d o s eg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e s g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e s w e r e p r o d u c e db yt u n n e l m i c r o w a v es o l i d - s t a t er e a c t i o n e q u i p m e n t t h e r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d b y t h r e e f a c t o r - t h r e e l e v e l g e n e r a l r o t a t i o nd e s i g n t h r e eg l u c o o l i g o s a e c h a r i d e s 、加t l ld i f f e r e n td e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o nw e r e s e l e c t e dt os t u d yt h es c a v e n g i n ga c t i v i t yt of r e er a d i c a l si nv i t r oa n dt h er e g u l a t o r yf u n c t i o no n t h eo x i d a t i v es t r e s sa n di n f l a m m a t o r yr e s p o n s e k u n m i n gm i c ec o n s u m e da i lo r d i n a r yd i e t w e r ef i l l e dt h es t o m a c hs a l i n e ，f o s ，l g o s ，m g o s ，h g o sr e s p e c t i v e l ye v e r yd a y a f t e r21 d a y s ，e s t a b i l i s h i n gt h em o d e lm i c eo ft h eo x i d a t i v es t r e s sa n di n f l a m m a t o r yr e s p o n s eu n d e r l p si n d u c et od e t e c ta n t i o x i d a n ti n d i c a t o r s ( r o s 、g s h - p x 、c a t ，t - a o c ，m d a ) a n d c y t o k i n e si n d i c a t o r s ( i l - 1 、t n f a 、n o 、n o s ) w ee v a l u a t e dt h ef o o ds a f e t yo ft h e g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sa n di t se f f e c to na n t i o x i d a n ts y s t e mo ft h em i c ef e dh i g h d o s e ( 2 0 ， 4 0 ，a n d8 0 o fa d d i n gv o l u m e ) g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sb ya c u t et o x i c i t yt e s ta n d3 0 - d a y s f e e d i n gt e s t t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：( 1 ) 1 1 1 ef i n a lo p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n so ft h eq u a l i t yo f g l u c o s es u b s t r a t ew a s3 0k gw a sb u i l da s2 8 3m i no fm i c r o w a v eh e a t i n gt i m e ，4 4 c a t a l y s t a m o u n t ，19 6 i n i t i a t o r t h eh i g h e s tc o n v e r s i o nr a t eo fp r o d u c tw a s8 0 1 ( 2 ) t 1 1 r e e g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sw i t hd i f f e r e n td e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o nh a ds c a v e n g i n ga c t i v i t yt o f r e er a d i c a l si nv i t r oa n di nv i v o t h eg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sc o u l de f f i c i e n t l yr e d u c et h ef r e e r a d i c a lo f m i c ef i l l e dt h es t o m a c h0 5 9 k g b wg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sw i t hd i f f e r e n td e g r e e so f p o l y m e r i z a t i o ni n b l o o da n dl i v e r a c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n ta c t i v i t y ( g s h p x ，c a t ) a n d t - a o ci ni np l a s m aa n dl i v e rw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da n dm d aw a ss i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h eg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e sa l s oc a l lr e d u c et h ec o n t e n to fc y t o k i n e s ( i l 一1 ，t n f 一仅， n o ) a n dt h ea c t i v i t yo fi n o s c o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a to l i g o s a c c h a r i d e sm a yr e g u l a t e t h eo x i d a t i v es t r e s sa n di n f l a m m a t o r yr e s p o n s eb yi n h i b i t i n gt h eg e n e r a t i o no ff r e er a d i c a l s a n de n h a n c ea n t i o x i d a n te n z y m ea c t i v i t y ( 3 ) t h ea c u t et o x i c i t yl d s oo fg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e s w a sg r e a t e rt h a n15g k g 。b w , s oi ti sn o n - t o x i cl e v e l t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so ft h e d i f f e r e n t d o s eg r o u p sw e r eh i g h e rt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p i nt h ek i d n e y , t - a o co ft h e h i g h d o s eg r o u ph a sas i g n i f i c a n tr e d u c t i o nt h a nt h ec o n t r o lg r o u pa n dm d a h a sas i g n i f i c a n t e x a l t a t i o n t h eh i g h - d o s eg l u c o o l i g o s a c c h a r i d e s ( 8 o ) c o u l dl e a ds c a v e n g i n ga c t i v i t yo ft h e k i d n e yt or e d u c e k e y w o r d s ：g l u c o o l i g o s a c c h a r i d e s ；m i c r o w a v e ；a n t i o x i d a n t ；i m m u n e ；f r e er a d i c a l s ； 主要缩略词总汇 l p s d p p h a b t s 5 h m f h i 心 a n s r o s g s h p x c a t s o d t - a o c m d a a l t g p t n o s i n o s c n o s t n o s i l 1 t n f a f o s l g o s m g o s h g o s 主要缩略词总汇 脂多糖 l ，1 二苯基p 苦基肼 2 ，2 。连氮双( 3 乙基苯并噻唑啉6 磺酸) 5 羟甲基糠醛 辣根过氧化物酶 1 苯胺基8 萘磺酸 活性氧自由基 谷胱甘肽过氧化物酶 过氧化氢酶 超氧化物岐化酶 总抗氧化能力 丙二醛 谷丙转氨酶 一氧化氮合酶 诱导型一氧化氮合酶 结构型一氧化氮合酶 总一氧化氮合酶 白细胞介素l 肿瘤坏死因子 果寡糖 低聚合度葡寡糖 中聚合度葡寡糖 高聚合度葡寡糖 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：叼年7 月! o 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 ， 签名： 纠l 厶导师签名： 日期办7 引言 1 引言 1 1 功链性寡糖概述 1 1 1 寡糖及功能性寡糖 m o r oe 等人( 1 9 0 0 ) 发现人体母乳中含有一种肠道菌群生长因子，这种生长因子 后来被证实其成分为寡糖【玎。1 9 3 0 年，b h e l g e r i e h 等人首先提出来寡糖( o l i g o s a c c h a r i d e s ) 一词，“o l i g o ”源于希腊文，意思是“寡 ，是由2 1 0 个单糖结合成的直链或支链聚合 糖，又被称为低聚糖。其可分为普通寡糖和功能性寡糖两类。普通寡糖主要有蔗糖、乳 糖、麦芽糖等，主要为人体提供所需的能量和怡人的甜味。功能性寡糖主要有果寡糖、 葡寡糖、异麦芽寡糖、大豆寡糖和木寡糖等，人体肠道内没有水解它们的酶系统，但对 人体有着特别的生理功能【2 1 。已经研究发现的功能性寡糖有千余种，但是只有少数天然 的功能性寡糖存在于食品中，由于生产资源条件的限制，只有除大豆寡糖等少数几种由 提取法制取外，大部分功能性寡糖主要是通过生物技术把低廉的淀粉原料转化而成的。 迄今为止，国际上已有7 0 余种功能性寡糖研究开发成功。 1 1 2 功能性寡糖的应用及发展概况 寡糖产业在国际上已经发展成为一个重要的生物技术产业。功能性寡糖目前主要应 用在食品领域，全球食品市场总值超过4 0 0 亿美元。如异麦芽寡糖被广泛应用于各类保 健品、饮品、奶制品、糖果和面食等。脑白金、乐百氏、康师傅等品牌产品都添加有异 麦芽寡糖。饲料行业是寡糖应用近次于食品的个行业，全球市场在1 0 0 多亿美元。有 些寡糖可以作为药物开发的前体，寡糖药物的研发近几年才开始，具有很广阔的市场前 景。寡糖农药和寡糖肥料也是最近几年才开始开发的寡糖产品。 日本是最先开发和研究功能性寡糖的国家，上世纪8 0 年代已有多种寡糖产品进入 市场，目前年产量在4 万吨左右，是目前寡糖商品化品种最多的国家。欧洲一些国家开 发的功能性寡糖产品主要为果寡糖和半乳寡糖。欧洲启动了“欧洲糖研究开发网络”， 日本实施了“糖工程前沿计划”。西方各国研发的重点是：寡糖药物和寡糖疫苗。我国 于2 0 世纪8 0 年代开始功能性寡糖的研究，到了“九五”期间，才形成初步工业化和商 品化。目前主要产品有异麦芽寡糖、果寡糖、木寡糖、甘露寡糖、大豆寡糖、水苏糖等。 生产规模比较大的只有异麦芽寡糖和果寡糖，年产量分别在万吨和千吨左右，功能性寡 糖品种比较单一、涉及面还不够广泛、生产成本较高、对寡糖的宣传还不到位，与日本 等发达国家相比还有很大的差罡e 3 1 。 1 2 功能性寡糖的主要生产方法 目前，功能性寡糖的生产方法主要有酶法合成、化学法合成等，酶法是迄今为止合 成功能性寡糖唯一有效的生产方法，大部分的寡糖生产企业都采用酶法生产。化学法合 成种类繁多，但是技术工艺尚未成熟，尚未大规模工业化。微波法是近几年才开始研究 江南大学硕士学位论文 开发的新方法，目前还处于实验室研究阶段。 1 2 1 酶法合成 酶法生产过程一般包括酶的制备、寡糖的合成、产品的分离精制等三个阶段。其优 势是在于它的高度区域和立体选择性，且合成路线比较简单。主要有三种途径来制备寡 糖：一是以淀粉、葡聚糖、果聚糖、果胶等天然多糖为原料，应用酶的定向水解或控制 水解作用来获得目的寡糖，林勤保 4 1 ( 1 9 9 5 ) 用0 1 淀粉酶和真菌淀粉酶水解淀粉制备葡 聚糖；t a k e m u r am 等b j 用酶水解法来生产木寡糖。二是利用酸、热和酶来催化糖基转移 反应来制备寡糖，目前工业化生产功能性寡糖的糖基转移酶主要有环状糊精合成酶、a 葡萄糖基转移酶、b 一葡萄糖基转移酶、果聚糖蔗糖酶、果糖基转移酶掣6 1 。三是利用糖 苷酶通过转糖基作用【7 l 和缩合作用f 8 ，9 】合成功能性寡糖，如王红妹等利用巨大芽孢杆菌 转糖基p 半乳糖苷酶催化生成半乳寡糖；马莺等利用米曲霉b d 呋喃果糖苷酶合成果寡 糖【1 0 j 。酶法合成周期长，一个生产周期通常在一周左右，酶易失活，产物分离纯化困难 而复杂，产率低，传统酶法生产蔗果寡糖的产率一般在5 0 左右。 1 2 2 化学法合成 寡糖的化学合成一直进展缓慢，最大的技术难题在于糖单体异构体的数目及其组成 的寡糖链的异构体数目都是是巨大的。保护基团，选择催化剂和反应条件，确定供体离 去基团以及受体等都需要严谨的设计【l 。迄今为止，尚未找到一个通用的、对所有寡糖 都适合的方法。合成寡糖时，除了要偶联的羟基外，受体中的其它羟基都要保护起来， 偶联完一个羟基之后，再移除下一个要偶联的羟基的保护基，最后移除剩余的保护基， 才能得到目的寡糖【i 引。孔繁祚( 2 0 0 2 ) 等人用不保护的葡萄糖为糖基受体，用酰基溴代 糖为糖基供体，高收率地得到6 位糖基化的产物【l3 1 。化学合成法简便易行，所用酸或氧 化试剂廉价易得，容易实现产业化。但是寡糖产物的分子量范围很宽且比较复杂，还原 端基团容易发生氧化或降解，副产物也比较多【l 训。 1 2 3 微波法合成 微波是以“内加热 的方式对反应物质进行加热，介质中随意取向的偶极子会按电 场方向趋向同一取向，当电场方向每秒钟改变数亿次时，处于电场中的偶极子的取向排 列也随之急剧变化，造成分子间相互碰撞，加剧了分子的运动，提高了分子的平均能量， 从而在很短的时间达到较高温度，降低了反应的活化能，使反应迅速完成【l 5 1 。 g e d y e 等【l6 j ( 1 9 8 6 ) ，首次发现微波可大大加快有机合成反应速率，缩短反应时间。 微波可以催化酯化、缩合、取代、烷基化水解、烯烃加成、消除、取代、等多种有机化 学反应【l7 。陆模文等( 1 9 9 5 ) 研究发现在合成半乳糖1 ，4 内酯的反应过程中，如果用微 波辐射来进行反应，可将反应时间缩短为1 0m i n ，产率可以有效提高3 8 1 1 8 】。苏桂发等 【1 9 1 ( 2 0 0 2 ) 采用微波辐射结合相转移催化技术来制备茉莉醛，其合成产率高达9 0 4 。 李耀先【2 2 2 】( 1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) 课题组，范平等【2 3 】人先后分别报道了微波辐射下酸与醇直 接发生酯化反应的研究。j i n g x i o n gc h e n g ( 2 0 0 5 ) 等【2 4 】首次利用葡萄糖单糖通过微波 2 弓f 畜 固相催化反应来合成低聚葡萄糖。其后，该课题组王芳、王海松、丁苏等( 2 0 0 6 、2 0 0 7 、 2 0 0 8 ) 先后利用微波固相催化技术合成甘露寡糖、葡半乳寡糖、木寡糖等功能性寡糖。 1 2 4 微波法规模化合成寡糖的初步探索 迄今为止，在实验室中利用微波固相合成技术，已成功合成出甘露寡糖、木寡糖、 葡一半乳寡糖等功能性寡糖。在微波固相催化反应中，微波的加热速率、反应体系组成 以及微波的输出功率等均会影响反应的速率：反应物吸收微波能量的多少和快慢与分子 的极性、反应容器的大小：反应物的体积、质量等都有很大的关系。不同的反应需特定 的反应设备和反应条件，需通过实践才能得到最佳条件。因此，连续、规模化生产功能 性寡糖，需要开发一种适于连续化催化合成寡糖的反应设备，并要在此设备的基础上进 行反应条件的优化。 1 3 功能性寡糖的生理功能研究 功能性寡糖具有多种生理功能，如益生作用、免疫调节作用、抗氧化、降血糖、降 血脂、防龋齿、预防便秘等，一直是专家学者研究的热点。目前，对功能性寡糖的研究 大部分集中在其作为“双歧因子”改善肠道功能，提高机体免疫力等方面。寡糖的抗氧 化与免疫调节作用近几年越来越受到关注。 1 3 1 益生作用与免疫调节 益生菌选择性地利用寡糖作为底物进行生长繁殖，而腐败菌却不能利用【2 5 ，2 6 1 。有研 究证实，木寡糖、半乳寡糖、甘露寡糖、果寡糖都可以有效促进肠道有益菌的增值【2 7 3 1 】。 动物试验表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖具有提高机体免疫功能的作用。h o s o n oa ( 2 0 0 3 ) 等人进行的小鼠试验表明，f o s 能通过改变肠道微生态环境而促进肠粘膜的 c d 4 + p p 淋巴细胞亚群分泌i g a 和白细胞介素i l 5 、i l 6 ，并抑制t h 2 控制的免疫应答 【3 2 】。n a k a m u r ay ( 2 0 0 4 ) 等人用f o s 喂食幼鼠，亦发现f o s 能增加肠粘膜上i g a 的 分泌和p l g r 的表达p 引。 益生作用和免疫调节关系为：调节肠内菌群失调状况，促使肠道菌群平衡态、正常 化，诱导肠粘膜淋巴系统的免疫活性【3 4 】；降低肠内p h 值，刺激肠道粘液分泌并加速粘 液层的流动，阻止细菌对肠粘膜的附着并抑制外源致病菌和肠内固有腐败细菌的生长繁 殖，减少肠内腐败有毒物质生成：寡糖的通便作用能迅速将毒性代谢物排出体外，肠道 及血液中的毒素水平相应降低，从而减轻肝脏分解体内毒素的负担【3 5 1 。 1 3 2 抗氧化与免疫调节 1 3 2 1 炎症反应与氧化应激 脂多糖( l p s ) 等多种细胞因子可以诱导活化肝细胞、枯否细胞、肝窦内皮细胞中 i n o s ，产生大量具有细胞毒性作用的内源性n o ，参与各种肝病的病理过程。肝病中枯 否细胞释放肿瘤坏死因子( t n f q ) 、白细胞介素( i l 1 ) 等细胞因子，作用于肝细胞1 3 引。 w i n r o w 等【3 7 】的研究证明在炎症反应过程中伴有大量胞内活性氧自由基产生，攻击生物 膜中的不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应，破坏脂肪酸链和细胞膜的完整性，损伤肝 江南大学硕士学位论文 脏中的各种细胞i 邛j 。 正常生理情况下，生物体内自身的抗氧化系统会清除炎症反应和氧化应激过程中产 生的自由基，产生和清除维持在一个平衡状态上，但是当自由基过多时，其在体内的累 积会促进机体的氧化损伤并大大损害机体的免疫系统【3 9 1 。因此活性氧自由基与机体的多 种疾病和损伤有关，如心脑血管病、肺气肿、白内障、溃疡、老年性痴呆、帕金森氏综 合症、糖尿病并发症等疾病【4 0 】。外源性抗氧化活性物质能够帮助机体的抗氧化系统清除 过多的自由基，保护机体免受自由基的损害，并使免疫细胞在慢性炎症反应中免受过多 的活性氧损伤、避免并发症的产生，增强机体的免疫能力【4 1 1 。 1 3 2 2 抗氧化与免疫调节 过量的自由基会破坏免疫细胞的膜结构和功能，从而导致免疫功能的显著下降。有 研究报道称r o s 可以下行性调节树突状细胞和内皮细胞的抗原递呈作用，抑制t 淋巴 细胞的活性【4 2 。李春美等【4 习( 2 0 0 4 ) 研究证明，柚皮提取物可以提高小鼠血清s o d 活性， 同时降低血清m d a 的含量，增强d n f b 所致小鼠皮肤d t h 反应，并可刺激小鼠免疫 器官( 胸腺、脾脏) 的发育，增强t 细胞免疫功能。闰冬梅( 2 0 0 7 ) 等m 】研究证明，中药 四君子汤能提高脑s o d 活性并抑制脑与肝中m d a 的升高，提高小鼠机体的免疫能力。 但是对于功能性寡糖的抗氧化与免疫调节的研究，只有少许报道，e l l i o t 等【4 5 】研究表明 麦芽寡糖、阿拉伯寡糖、甘露寡糖都能抑制r o s 的产生来提高机体的免疫能力。 1 3 2 3 寡糖的抗氧化功能 近年来，寡糖的抗氧化作用越来越受到关注。功能性寡糖是一种多羟基化合物，羟 基可以提供活泼的氢质子，氢质子直接参与自由基的清除作用。e l l i o t ( 2 0 0 4 ) 等研究表明 麦芽寡糖、阿拉伯寡糖、甘露寡糖都能抑制r o s 的产生 4 5 】。h a i m i nc h e n ( 2 0 0 7 ) 研究发现琼寡糖在肝细胞内外具有很好的清除自由基的活性【4 6 1 。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 研究 表明琼胶寡糖具有清除抗超氧阴离子和羟基自由基的能力f 4 7 1 。王素敏等【4 踟研究表明，大 豆低聚糖能够显著提高大鼠血清、心肌、脑组织s o d 活性。e n o k i 等( 2 0 0 3 ) 研究表 明琼寡糖抑制诱导型一氧化氮合成酶( i n o s ) 的活性【4 引。 1 3 2 4 寡糖聚合度( d p s ) 和抗氧化能力的关系 寡糖的抗氧化能力可能与其聚合度大小有关系，目前对寡糖的抗氧化作用的构效关 系尚不能达到共识，结果间存在明显的差异性。x u e 等( 2 0 0 1 ) 在对来源于l a m i n a r i a j a p o n i c a 的硫酸寡糖的研究中认为，低分子量( 平均分子量为8 0 0 0 - - - , 1 0 0 0 0 ) 寡糖的抗 氧化活性更高。e l l i o t ( 2 0 0 4 ) 等研究表明，阿拉伯寡糖随着聚合度的增加，其抑制r o s 能力逐渐增强。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 对不同分子量的酶降解琼胶寡糖的抗氧化作用进行过 研究表明高分子量的寡糖( 聚合度在1 6 - - 2 4 ) 反而比低分子量寡糖表现出更好的抗超氧 阴离子和羟基自由基的能力。 1 3 3 寡糖的其它生理功能 功能性寡糖还具有降血脂、血糖功能，可以改善脂类代谢，降低糖尿病的发病率。 王素敏等【5 0 】的实验证明，大豆低聚糖可使总胆固醇( t c ) 和甘油三酯( t g ) 分别降低3 8 、 5 9 ，同时可使高密度脂蛋i 兰t ( h d l ) 的含量升高4 5 。日本明治制果生物科学实验室的 4 引言 糖负载实验报道：早空腹服用果寡糖( 对照组口服葡萄糖) ，上午前3h 受试者血糖值及 血中胰岛素均未出现上升；高血脂妇女连服4w 果寡糖后实测血清内总胆固醇等也有显 著改善。 1 4 微波法合成寡糖的安全性 1 4 1 微波法合成产物中的副产物 作为一种化学合成方法，微波合成产品有必要进行安全性评价。有报道，高温或弱 酸等条件可使单糖脱水产生5 羟甲基糠醛( 5 h m f ) 之类的物质【5 l 】。 5 - h m f 的功能性和毒性研究目前还没有定论。丁霞( 2 0 0 8 ) 研究发现，5 - h m f 对 c c h 所致急性肝损伤组织有保护作用，并具有一定的量效关系1 5 2 1 。h o u 等网研究证实 5 - h m f 能促进甘草酸和甘草次酸的抑制肿瘤、抗炎、降血脂的作用。另有一些报道称 5 - h m f 具有一定的毒性作用。r o n a l dl 等( 2 0 0 6 ) 报道，7 5m g k g b w 的5 - h m f 便能 够产生某些毒性作用【5 4 】。m h a u g e na ( 2 0 0 8 ) 研究发现，5 - h m f 可以诱导结肠干细胞 发生突变【5 州。另有研究表明，1 的5 - h m f ，就有可能引发并促进结肠小囊异常生长 ( a c f ) ，并呈一定的剂量依赖性 5 6 1 。 1 4 2 寡糖的适宜添加量 适宜剂量的功能性寡糖才能产生理想效果，添加量过少，可能对动物起不到作用， 添加量过多，不仅增加成本，还可能导致动物腹泻，达不到理想的效果。m u la j & p e r r y f g ( 1 9 9 3 ) 报道，寡糖的添加量高于摄入量的0 5 会增加食糜流动速度，增加软便的发生 率。另外抗氧化剂一旦摄人量过大，反而会产生严重的毒副作用，反而引起抗氧化与免 疫能力下降防5 9 1 。 1 5 立体意义及研究内容 功能性寡糖具有多种生物学活性，可作为一种很好的食品添加剂来辅助预防心血管 疾病，增强机体的抵抗疾病的能力。目前，我国可以大批量生产的功能性寡糖只有异麦 芽寡糖和果寡糖，生产成本较高。寡糖的生产量已不能满足日益增长的市场需求。因此 开发一种新型的低成本、高产率的生产方法具有良好经济和社会效应。本文以价格低廉 来源广泛的葡萄糖为原料，利用微波固相加热中试设备合成功能性葡寡糖，并研究了葡 寡糖产物对脂多糖( l p s ) 诱导小鼠氧化应激与炎症反应的调节作用。同时也对微波合 成葡寡糖产物的食用安全性及大剂量摄入葡寡糖对小鼠机体抗氧化系统的影响进行了 评价。为微波固相合成寡糖的工业化生产提供理论基础和技术资料。 本文主要拟从以下几个方面展开研究： l 、以葡萄糖为反应原料，采用隧道式微波加热设备固相合成葡寡糖的工艺优化及 产物组分初步分析鉴定。 2 、不同聚合度葡寡糖体外清除自由基的能力以及对l p s 诱导小鼠氧化应激与炎症 反应的调节作用。 3 、葡寡糖的食用安全性大剂量摄入及对小鼠抗氧化系统的影响。 江南大学硕士学位论文 2 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 主要试剂 葡萄糖( a r ) 购于国药集团化学试剂有限公司。果寡糖( f o s ，纯度9 5 ) 购于 江门量子高科生物工程有限公司。葡萄糖测定试剂盒购于宁波亚太生物技术有限责任公 司。1 ，1 二苯基一p 一苦基肼( d p p h ) 购于s i g m a 公司。2 ，2 连氮一双一( 3 乙基苯并噻唑啉6 磺酸) ( a b t s ) 试剂购于s i g m a 公司。5 羟甲基糠醛( 5 瑚心) 购于上海晶纯试剂有限 公司。辣根过氧化物酶( h r p ) ，购于北京拜尔迪生物技术有限公司。总抗氧化能力 ( t - a o c ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、超氧化物岐化酶( s o d ) 、谷丙转氨酶( a l t g p t ) 、 一氧化氮( n o ) 、一氧化氮合酶( n o s ) 测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。白 细胞介素( i l 1 ) 、肿瘤坏死因子( t n f 0 【) e l i s a 试剂盒北京晶美生物工程有限公司。 2 1 2 主要仪器 隧道式微波固相反应中试设备 x h 一2 0 0 a 电脑微波固液相合成萃取仪 h p l1 0 0 高效液相色谱 傅立叶变换红外光谱仪 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 f d 一1 c e 冷冻干燥机 u v - 210 2 p c 分光光度计 f 9 6 荧光分光光度计 c e n t r i f u g e5 8 0 4 r 高速冷冻离心机器 超低温冷冻冰箱 m p l b 型多参数化学发光测试仪 血糖仪 2 1 3 实验动物 江南大学营养与功能因子实验室研制组装 北京祥鹄科技发展有限公司 美国a g i l e n t 公司 美国n i c o l e t 公司 美国t h e r m o 公司 北京德天佑科技发展有限公司 u n i c o 公司 上海棱光技术有限公司 上海安亭科学仪器厂 美国i n v e t r o 公司 西安迈瑞分析仪器有限公司 美国琼森l i f es c a l l 1 2 0 只4w 龄清洁级雄性昆明种小鼠，体重1 8 2 2 9 ，由中国科学院上海实验动物中 心提供。2 0 只( 雌雄各半) 4w 龄清洁级昆明种小鼠及4 0 只清洁级雌性昆明种小鼠由 苏州大学动物实验中心提供。 2 2 实验方法 2 2 1 微波固相合成方法 2 2 1 1 反应设备及工艺流程 图2 1 是隧道式微波固相反应设备及工艺流程示意图。本实验中，由于葡寡糖产物 6 实验材料与方法 的粘性较大，采用周转盘进行操作。将葡萄糖、催化剂杂多酸a 、引发剂混匀后放入周 转盘内，传送带将其传送进入微波腔体，经微波辐射后即可合成葡寡糖，可连续化操作。 微波发射器为6 个家用微波炉式微波发射器。传送带两端加有微波防泄漏装置，经测量， 微波泄漏低于lm w c m 2 ，低于国家标准。主要技术指标：频率：2 4 5 0 5 0 m h z ；微 波输出功率： 4 5k w ( 不可调) ；进出料口高度：7 5 0m m ；传送带宽度：3 2 4m i l l ；传 输速度：0 - - 2 0m m i n ( 变频调速) ：外型尺寸( 长x 宽高) ：约6 0 6 0 5 0 0 0 x 1 2 1 0 ( 1 1 1 r 1 1 ) 。 1 、物料称重2 、物料粉碎3 、物料混匀4 、操作箱5 、物料传送6 、微波腔体 7 、防泄漏装置8 、调速电机9 、冷却1 0 、粉碎1 1 、包装 ! i t 2 1 微波固相反应设备及工艺流程示意图 f i g 2 - 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo fm i c r o w a v es o l i d s t a t er e a c t i o ne q u i p m e n ta n dp r o c e s s 2 2 1 2 葡萄糖转化率的测定 转化率( ) = ( 反应初始葡萄糖量一剩余葡萄糖量) 反应初始葡萄糖量1 0 0 葡萄糖含量按照宁波亚太生物技术有限责任公司试剂盒说明书测定。 2 2 1 3 合成条件的优化 微波功率( 4 5k w ) 恒定，放入1 0 个周转盘，葡萄糖反应物质量为3 埏，分别研 究微波时间、催化剂添加量、引发剂添加量对葡寡糖转化率的影响。 在单因素试验的基础上，采用三因素三水平二次回归通用旋转组合设计1 6 0 , 6 1 】，在不 同微波时间、催化剂、引发剂添加量的条件下进行微波固相催化合成反应，实验因素与 水平如下表。 表2 1 实验因素与水平表 t a b l e2 1t h el e v e l so ff a c t o r s 7 江南大学硕士学位论文 2 2 2 葡寡糖产物的分析鉴定 2 2 2 1 高效液相色谱( h p l c ) 分析 w a t e r s 4 0 0 e ，色谱柱：s u g a r p a k l ，6 5m m i d 3 0 0m m ，流动相：纯水，流速：0 4 m l m i n ，进样量：1 0u l ，温度：8 0 。 2 2 2 2 红外光谱( i r ) 分析 葡寡糖产物去除游离磷、冷冻干燥后进行红外光谱( m ) 分析。制样方法：a t r 反 射法：扫描次数：6 4 次，分辨率：4c m 。 2 2 2 3 紫外图谱扫描及5 - h m f 、平均聚合度的测定 配制2 0m g m l 的葡寡糖溶液，在2 0 0 6 0 0 n m 以波长范围进行紫外扫描。5 - h m 的 测定参照苏孝礼等1 6 2 1 的紫外分光光度计法测定。用6m o l l 的h c l 溶液水解葡寡糖产物 4 0 m i n ，用1 0 n a o h 溶液调至中性【6 3 , 6 4 】，采用d n s 法测定总糖和还原糖。寡糖平均 聚合度( d p ) 的计算采用可溶性总糖还原糖法。 2 2 3 葡寡糖产物对自由基抑制率的测定 2 2 3 1 葡寡糖产物对o h 自由基的清除作用 采用水杨酸法【6 5 】测定：h 2 0 2 与f e 2 + 体系产生o h ，葡寡糖与水杨酸竞争o h ，而使 有色物质生成量减少。抑制率i ( ) = ( a o - - a ) a o 1 0 0 其中舢为空白对照液 的吸光度，a 为加入葡寡糖后的吸光度。 2 2 3 2 葡寡糖产物对d p p h 自由基的清除作用 参照文献m j ，将葡寡糖配制成一系列浓度的乙醇溶液，取1m l 糖液加入等体积 d p p h 乙醇溶液( o 1m m o l m l ) ，混合均匀后，放置暗室中反应3 0m i l l ，于5 1 7n n l d 测 定吸光值。抑制率i ( ) = 【1 一( a a 1 )a 0 1 0 0 其中为空白对照液的吸光 度，a 为加入葡寡糖后的吸光度，a l 为葡寡糖的本底吸光度。 2 2 3 3 葡寡糖产物对a b t s + 的清除作用 参照k o n g & x i o n 9 1 6 7 方法，并有所改进。抑制率i ( ) = ( a o - - a ) a o 1 0 0 其 中a o 为空白对照液的吸光度，a 为加入葡寡糖后的吸光度。 2 2 4 葡寡糖产物表面疏水性测定 采用a n s ( 1 一苯胺基8 一萘磺酸) 荧光探针法 6 8 , 6 9 1 测定葡寡糖的表面疏水性。a n s 探针在非极性环境中产生荧光，在水或极性环境中没有荧光。a n s 与葡寡糖相对疏水 的区域结合时，会发生荧光。以荧光强度对葡寡糖浓度作图，初始段的斜率即为葡寡糖 分子的表面疏水性指数s o ( 激发波长= 3 8 8n m ，发射波长= 4 9 9n m ) 。 2 2 5 试验动物分组 1 2 0 只4w 龄雄性昆明种小鼠，预饲一周后，按体重随机分为6 组：正常对照组 ( c o n t r 0 1 ) 、模型组( l p s ) 、果寡糖组( f o s ) 、葡寡糖三个组：l g o s ( 低聚合度组) 、 m g o s ( 中聚合度组) 、h g o s ( 高聚合度组) 。各组均饲喂正常日粮，c o n t r o l 和l p s 组 每天按o 5e c k g b w 剂量灌胃o 2 0m l l og b w 生理盐水；f o s 、l g o s 、m g o s 、h g o s 实验材料与方法 组每天分别灌胃同等剂量的f o s 、l g o s 、m g o s 、h g o s 。自然光照，自由采食和饮 水。环境温度控制在2 3 2 ，湿度6 0 。2 1d 后，c o n t r o l 组腹腔注射生理盐水。其 他各组均按5m g k g 剂量腹腔注射l p s 。l p s 刺激后，各组分别在4h 和1 8h 断颈椎处 死小鼠，检测相应指标来研究葡寡糖产物对氧化应激与炎症反应的调节作用。 在上述实验的基础上，得到高聚合度葡寡糖( h g o s ) 对氧化应激与炎症反应的调 节作用最好。选取昆明小鼠2 0 只，雌雄各1 0 只，体重( 2 0 2 ) g 。预饲一周后，按1 5 9 k g b w 剂量灌胃h g o s ，分别在0 、0 。5 、3 、6 、1 2h 鼠尾取血测定全血自由基，继续饲喂两周， 观察小鼠生长状况，及死亡数量。另选用4 0 只清洁级雌性昆明种小鼠，一周预饲后， 随机分成四组：即正常组( 正常日粮) 、葡寡糖低剂量组( 正常日粮+ 2 0 的h g o s ) 、 葡寡糖中剂量组( 正常日粮+ 4 o 的h g o s ) 、葡寡糖高剂量组( 正常日粮+ 8 o 的 h g o s ) ，分别相当于人群推荐摄入量的2 0 、4 0 、8 0 倍。3 0d 后，断颈椎处死