（分析化学专业论文）以dna和蛋白质为探针的固液界面单分子荧光成像研究.pdf

硕l 学位论文 摘要 生命科学本质的逐步探索和科学研究对传统分析提出了新的要求。以往常规 的分析和检测方法得到的测量结果只是分子群体的平均值，而生命的基本过程取 决于细胞内不同分子与同类分子之间的协调作用，因此，欲了解生物过程的化学 性质及其运作机制，人们必须在单分子水平对生物分子的化学和物理性质进行深 入探索。 单分子检测( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 是一种超灵敏的检测技术， 经过二十多年的发展，单分子单细胞检测为揭示物理学、化学，特别是生命运动 的规律提供了重要的手段。单分子荧光成像技术是s m d 技术中应用最广、获得信 息最多的方法之一。 在过去的十几年来，单分子荧光成像技术已经能够成功探测和实时追踪到固 液界面、液液界面和活细胞内等不同微环境下单个分子的生理特性。固液界面是 d n a 和蛋白质等生物大分子在体外研究和应用的最重要的界面之一。通过单分子 荧光成像实验可以记录以前未曾实时看到的单个分子的定位、运动轨迹、多聚体 形成、动态变化及动力学过程等。这对于探索细胞的活动、阐明生物分子在细胞 表面的生物过程、设计新的生物材料、寻找传感器中最佳的基底材料、理解色谱 和毛细管电泳的分离机制是很关键的。 基于上述原因，本论文开展了以下三个方面的工作： ( 1 ) 单分子荧光成像中的图像处理优化研究 图像处理与分析是单分子荧光成像研究的关键性内容。单分子荧光成像的图 像处理与图像分析贯穿整个实验过程，但又是一项繁琐而艰巨的任务。免费开源 软件i m a g ej 软件使用起来方便、快捷，在提高图像分析可靠性的同时，大大节约 了数据分析的时间，为单分子荧光成像分析提供了重要的工具。基于此，本章主 要研究了i m a g ej 软件在识别单个生物大分子的吸附解吸附事件、计算单分子的吸 附个数、测定单个分子的荧光强度和单个分子的漂白步骤( 漂白曲线) 等方面的 应用，重点讨论了单分子荧光成像分析中图像叠加的帧数、二维旋转球法扣除背 景中小球半径、粒子计数分析中阈值和单个光斑像素大小的正确选取对单分子吸 附个数计算结果可靠性的影响。以单个藻红蛋白分子在界面吸附成像为例，证明 了这些参数的选取和优化对单分子荧光成像分析结果可靠性有很大的影响。 ( 2 ) d n a 在琼脂糖修饰的玻璃表面行为的单分子荧光成像研究 琼脂糖凝胶常用于凝胶电泳中分离和纯化核酸、蛋白质等生物大分子。分离 过程中固定相和单个生物分子之间的动态相互作用正是色谱和电泳等生物分离方 法最优化的基础。本论文应用物镜型全内反射荧光显微镜，以y o y o 1 为探针研究 i i 以d n a 和蛋白质为探针的同液界面荦分了荧光成像研究 了琼脂糖的表面性质，主要考察了不同的p h 值、离子强度和琼脂糖浓度对d n a 吸 附动力学行为的影响。得出的结论为：d n a 分子在琼脂糖表面的吸附量和吸附形 式随p h 值和离子强度的变化是不同的；d n a 在不同浓度琼脂糖表面的吸附行为可 归结为静电作用、疏水作用和琼脂糖表面粗糙度三重作用的影响，主导作用是静 电作用、疏水作用，琼脂糖表面的构形在某种程度上也影响着d n a 的吸附。 ( 3 ) 巯基乙醇对藻红蛋白单分子行为影响的荧光成像研究 荧光团的光致漂白和闪烁现象严重影响单分子荧光成像研究。在单分子荧光 研究中，加入巯基乙醇( 2 m e r c a p t o e t h a n o l ，b m e ) 可以降低荧光团的漂白速率、 减弱闪烁现象，从而提高单分子荧光检测的分辨率和灵敏度。然而，b m e 对单分 子其它行为如吸附和荧光强度的影响并未得到充分研究。本论文应用宽场荧光成 像技术，以藻红蛋白( b p h y c o e r y t h r i n ，b p e ) 为模型蛋白，从单分子角度系统地 研究了b m e 对蛋白在固一液界面吸附的影响，并对其机理进行了探讨。结果表明： b m e 浓度的增加可增强b p e 在盖玻片表面的吸附，吸附个数大约可增加到最初 的1 6 o 倍，同时也可使其荧光强度增强，但是更高浓度( 5 0 0m m o l l ) 的b m e 可使蛋白部分变性使其吸附个数降低，光斑的平均荧光强度降低；这些结果与荧 光光谱的结果相一致。 通过以上研究实现了准确、快速的单分子荧光成像分析，并通过实时观测固 一液界面分子的动力学过程，成功研究了影响生物大分子表面吸附机理的基本相 互作用，为探测色谱和电泳的分离机制，d n a 芯片和生物芯片的制作提供了更加 详细的基础理论依据。 关键词：单分子检测；固一液界面；生物分子；琼脂糖；d n a ；蛋白质 i l i 硕一 ：学位论文 a bs t r a c t s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ( s m d ) r e f e r sas e to fu l t r as e n s i t i v et e c h n i q u e s i nt h e p a s tt w od e c a d e s ，s i n g l em o l e c u l ea n ds i n g l ec e l ld e t e c t i o nt e c h n i q u e sh a v ep r o v e dt o b ei m p o r t a n tm e t h o d st ou n v e i lt h ep h y s i c s ，c h e m i s t r ya n dm e c h a n i s m so fm a n y i m p o r t a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e s a m o n gt h e m ，s i n g l e - m o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n g t e c h n i q u e sa r eu s e dm o s to f t e n i nt h ep a s to n ed e c a d eo rs o ，s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n gh a sr e a c h e d t h er e g i m eo fd e t e c t i n ga n dm o n i t o r i n gt h ep r o p e r t i e so fi n d i v i d u a lm o l e c u l e si n d i f f e r e n tn a n o e n v i r o n m e n t s ，i n c l u d i n gs o l i d l i q u i d ，l i q u i d l i q u i di n t e r f a c e sa n di nl i v e c e l l s s o l i d l i q u i di n t e r f a c ei s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm o d e l sf o ri n v e s t i g a t i n g b i o m o l e c u l eb e h a v i o r si nv i t r o s i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c e i m a g i n gh a sg r e a t p o t e n t i a lf o rr e a l t i m eo b s e r v a t i o no ft h em o t i o n ，a g g r e g a t i o n ，d y n a m i ch e t e r o g e n e i t y a n dk i n e t i cs t a t e so fm o l e c u l e s ，r e v e a l i n gd i f f e r e n c e sb e t w e e ni n d i v i d u a lb e h a v i o r sa n d t h ee n s e m b l ea v e r a g eb e h a v i o r ，a n dc a t c h i n gr a r ee v e n t st h a ta r eo f t e nh i d d e ni nt h e m a c r o s c o p i cr a n g e t h eo b s e r v a t i o no fs i n g l eb i o m o l e c u l e sc a np r o v i d ei n s i g h t si n t o m o l e c u l a rg e n e t i c s ，b i o c h i p a s s e m b l y ，b i o s e n s o rd e s i g n ，b i o p h y s i c s a n db a s i c s e p a r a t i o nt h e o r i e so fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h i st h e s i s c o n t a i n st h ef o l l o w i n gt h r e es e c t i o n s ： ( 1 ) o p t i m i z a t i o no fi m a g ea n a l y s i sf o rs i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n g s u c c e s s f u li m a g ep r o c e s s i n ga n da n a l y s i si s v e r yi m p o r t a n tf o ri n f o r m a t i o n e x t r a c t i o nf r o ms i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ne x p e r i m e n t s b u ti t i so f t e na d a u n t i n gt a s kg i v e nt h eh u g ea m o u n t so fd a t ao b t a i n e d f r e ea n do p e ns o u r c ei m a g e a n a l y s i ss o f t w a r ei m a g ejp r o v i d e sap o w e r f u lt o o lf o rs u c ht a s k s c o m p a r e dt om a n u a l o p e r a t i o n ，i m a g ea n a l y s i su s i n gi m a g e ji sf a s ta n dr e p r o d u c i b l e ，s ow ec a ns a v eal o t o ft i m eo nd a t aa n a l y s i s h e r e ，w ei n t r o d u c et h ea p p l i c a t i o no fi m a g ejt oi d e n t i f yt h e m o l e c u l a ra d s o r p t i o n d e s o r p t i o np r o c e s s ，c o u n ta d s o r b e dm o l e c u l e s ，d e t e r m i n et h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n ds i n g l e - s t e pb l e a c h i n go fi n d i v i d u a lm o l e c u l e s t h ee f f e c t s o ff r a m ea v e r a g e ，r a d i u so f2 dr o l l i n g b a l lb a c k g r o u n ds u b t r a c t i o na l g o r i t h m ，t h e t h r e s h o l da n ds i n g l e p a r t i c l es i z e s e l e c t i o no nt h er e l i a b i l i t yo fs i n g l em o l e c u l e c o u n t i n gw e r ea l s od i s c u s s e d w eh a v et a k e nt h em o v i eo fs i n g l eb p h y c o e r y t h r i n ( b p e ) m o l e c u l ea d s o r p t i o n o n ag l a s ss u r f a c ea sa ne x a m p l e i ti n d i c a t e dt h a t o p t i m i z a t i o no fi m a g ea n a l y s i sp a r a m e t e r sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rt h er e l i a b i l i t yo f 以d n a 和蛋白质为探针的l 舌i 液界面单分了荧光成像研究 s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n ga n a l y s i s ( 2 ) s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n go fd n a m o l e c u l e sa ta g a r o s es u r f a c e s a g a r o s eg e lh a sb e e nw i d e l y u s e di n g e le l e c t r o p h o r e s i st os e p a r a t e a n dp u r i f y b i o l o g i c a lm o l e c u l e ss u c ha sn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n s h o w e v e r ，r e l a t i v e l yl i t t l e i s k n o w na b o u td y n a m i ci n t e r a c t i o n s b e t w e e n s t a t i o n a r yp h a s e a n di n d i v i d u a l b i o m o l e c u l e sa ts i n g l em o l e c u l el e v e l t h e s ef u n d a m e n t a lp r o p e r t i e sa r ei m p o r t a n tf o r o p t i m i z i n gb i o s e p a r a t i o n m e t h o d ss u c ha ss i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h ya n d e l e c t r o p h o r e s i s i nt h ep r e s e n tw o r k ，w eh a v es t u d i e dd y n a m i cb e h a v i o r so fy o y o 一1 l a b e l e ds i n g l e 久- d n am o l e c u l e so na g a r o s e m o d i f i e ds u r f a c eu s i n go b j e c t i v e t y p e t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ( t i r f m ) t h ea d s o r p t i o na n dm o t i o n o fi n d i v i d u a ld n am o l e c u l e sa tt h ei n t e r f a c eh a v eb e e nm o n i t o r e da saf u n c t i o no fp h ， i o n i cs t r e n g t ha n da g a r o s ec o n c e n t r a t i o n s w ec o n c l u d e dt h a tt h eq u a n t i t ya n db e h a v i o r o fd n a a d s o r p t i o no na g a r o s es u r f a c ev a r yw i t ht h ec h a n g eo fp h a n di o n i cs t r e n g t h t h eb e h a v i o ro fd n aa b s o r p t i o nc a nb ea t t r i b u t e dt oac o m b i n a t i o no fh y d r o p h o b i c a t t r a c t i o n ，e l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o na n ds u r f a c er o u g h n e s s b o t he l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o n a n dh y d r o p h o b i ca t t r a c t i o np l a yam a j o rr o l ew h i l et h es u r f a c et o p o g r a p h ya l s oa f f e c t s d n a a d s o r p t i o nd y n a m i c sa ta g a r o s e m o d i f i e dg l a s ss u r f a c e s ( 3 ) s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n ga n a l y s i so f2 - m e r c a p t o e t h a n o li n d u c e d a d s o r p t i o no fb - p h y c o e r y t h r i no ns i l i c as u r f a c e t h ep h o t o b l e a c h i n ga n db l i n k i n go fi n d i v i d u a lf l u o r o p h o r e sh a v el i m i t e dt h e a p p l i c a t i o n o fs i n g l e - m o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n g i nm a n ys i n g l em o l e c u l e f l u o r e s c e n c e i m a g i n gs t u d i e s ，2 一m e r c a p t o e t h a n o l ( b m e ) i s u s e dt or e d u c et h e p h o t o b l e a c h i n gr a t e ，d e c r e a s eb l i n k i n ga n di m p r o v et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ys t a b i l i t y o ff l u o r o p h o r e s b u tt h ee f f e c to fb m eo no t h e rs i n g l e m o l e c u l eb e h a v i o r sh a sn o t b e e ni n v e s t i g a t e di nd e t a i l s o f a r h e r e ，w ei n v e s t i g a t ee v e n t s o fb m e - i n d u c e d a d s o r p t i o no fb p eo ns i l i c as u r f a c e t h ee f f e c to fb m e o nt h ea d s o r p t i o no fb p ei s s t u d i e dq u a n t i t a t i v e l yu s i n gs i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n g ，a n dt h em e c h a n i s m o fb m e i n d u c e da d s o r p t i o no fb p eo ns i l i c as u r f a c ew a sa l s oa n a l y z e d i ti n d i c a t e d t h a ta st h ec o n c e n t r a t i o no fb m ei n c r e a s e d ，t h ea d s o r p t i o no fb p eo ng l a s ss u r f a c e i n c r e a s e d t h en u m b e ro fa d s o r b e db p ei n c r e a s e dt o16 0t i m e so ft h a tw i t h o u tb m e ， a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya l s oe n h a n c e d h o w e v e r ，h i g h e rc o n c e n t r a t i o n so fb m e c a u s em a n yp r o t e i n st od e n a t u r e a sar e s u l t ，t h en u m b e ro fa d s o r b e db - p ed e c r e a s e d ， a n dt h ea v e r a g ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yr e d u c e d t h er e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h a to f f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ym e a s u r e m e n t a c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s ，i tc a nb es u m m a r i z e dt h a tw eh a v ea c h i e v e dt h er e l i a b l ea n d v 硕一l ：学位论文 r a p i ds i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g i n ga n a l y s i s ，o b s e r v e dt h ed y n a m i cp r o c e s so f b i o m o l e c u l e sa tt h el i q u i d s o l i di n t e r f a c ei nr e a lt i m ea n di n v e s t i g a t e dt h ef u n d a m e n t a l i n t e r a c t i o n st h a ta f f e c tt h es i n g l em o l e c u l ea d s o r p t i o na ts u r f a c e s t h e s eo f f e r e du s v a l u a b l ei n s i g h t si n t oc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o nm e c h a n i s m sa n dd n am i c r oa r r a y a n db i o s e n s o rf a b r i c a t i o n k e y w o r d s ：s i n g l e m o l e c u l es p e c t r o s c o p y ；s o l i d l i q u i di n t e r f a c e ；b i o m o l e c u l e s ； a g a r o s e ；d n a ；p r o t e i n v i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本 声明的法律后果由本人承担。 作者签名：詹晡 日 期：如7 年6 月8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密耐。 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名：巷赡日期：7 年石月8日 别帷名哆醐叫肘日 硕上学位论文 第1 章前言 科学的进步不但要求对物质的整体特征进行鉴定和测定，同时还要求对单分 子化学和物理性质进行深入探索。生命的基本过程取决于细胞内许多不同分子与 同类分子之间的协调作用，因而要了解生命的基本过程，必须在微观世界单分子 水平探索和阐明生命现象的本质，进而展现生命科学的全景。单分子检测( s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 是分析化学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的 前沿领域，达到了分子检测灵敏度的极限，是物质低含量监测技术中最后一个里 程碑。单分子荧光检测揭开了长期以来笼罩在分子探测上的系综平均测量值的 神秘面纱，为我们打开了通往光学介观世界的大门陋1 。 单分子荧光检测技术是s m d 技术中最灵敏的方法之一。经过二十多年的发展， 单分子荧光检测为揭示物理学、化学，特别是生命运动的规律提供了重要的手段， 成为人们日益关注的现代科学研究技术。单个分子检测的概念最早在1 9 5 9 年由 f e y n m a n 提出。1 9 7 6 年，h i r s c h f e l d 第一次尝试探测液体中的单个分子的荧光口1 ， 从此开启了单分子光学研究的大门。19 8 3 年，人们真正开始了单分子荧光的检测。 随着光学和探测技术的发展，直到1 9 8 9 年m o e r n e r 等人才成功地在低温下首次观察 到分子晶体中掺杂的单个分子的荧光h3 。此后通过进一步改善荧光收集效率和探 测器技术，室温下探测单个分子才成为现实睛6 1 。2 0 世纪9 0 年代之后，室温条件下 溶液相中单分子荧光成像技术迅速发展并趋于成熟旧1 ，s m d 技术逐渐成为研究生 命活动机制的有力手段。随着生命科学研究中的荧光标记技术的日益成熟，人们 不仅可以在溶液中对单个分子进行检测和成像，而且可以对单分子的光谱性质进 行检测并实时监控其动态过程，特别是能通过在生物大分子中单个标记的荧光分 子来研究生命过程中的生物大分子( l l 女n d n a 、r n a 等) 的结构和功能。 1 1 单分子检测的意义 在一个包含完全相同个体的系综，当测量时间足够长的时候，系综测量和单 分子测量结果相同，但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在 不断地运动，测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间； 另一种情况是在非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均( 实际上几 乎所有生物体系都不是均相体系) 。上述两点都导致系综测量结果和单分子测量 结果不等。一般系综测量结果表示的只是大量群体的平均值，用群体测量代替单 体将会掩盖很多重要的信息。与之相比单分子检测技术( s i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o n ，s m d ) 具有以下特点 。： 以d n a 和蛋白质为探针的同液界面争分了荧光成像研究 ( 1 ) 单分子检测技术研究的体系是处于非平衡态下的个体行为或平衡状态下 的涨落，从而能够完全排除宏观测量对系统复杂性的整体平均，发现隐藏在总体 平均值中的局部差异，追踪掩盖在平衡状态下的微观动力学变化过程。 ( 2 ) 它能使我们在取得对多个单分子的大量测量数据后，对于感兴趣的动力 学、热力学参数建立一个频率分布与波动变化的图谱。这些图谱所涵盖的信息比 通过宏观测量得到的该参数的平均值所涵盖的信息要多得多。如在活细胞体系中 由于其空间及化学环境的非均匀性，获得化学反应中每一个单分子的动力学、热 力学的分布及波动信息，对了解细胞内的一些生命过程是十分重要的。 ( 3 ) 在一个随时间变化的过程中，由于不要求大量分子的状态保持同步，单 分子水平的测量能够揭示不同分子的反应路径或状态演变的差异，捕捉到被宏观 测量所淹没的极少数的中间体或过渡状态。 1 2 荧光发射的原理 2 s 21 一 o 。 2 。 s 11 0 ， 吸 收 2 。 s o1 一 仉 2 。 1t 1 一 o 一 图1 1 荧光发射的机理呻1 荧光发射的原理如图1 1 所示随1 ：s o ，s l ，s 2 分别为基态、第一激发单重态、 第二激发单重态，t l 为激发三重态。分子吸收一个光子h v a 后，被激发到较高的 电子态s i 或s 2 以上的能级后通过振动弛豫和内转换回到s l 的最低振动能级，然 后发射一个荧光光子h v f ，同时使分子回到s o 的较高振动能级，最后快速弛豫到 s o 最低振动能级。由于弛豫过程造成了无辐射能量损失，因此荧光光谱发生红移。 同时，分子也可能从s l 无辐射系间窜跃到t l ，由于自旋禁阻，其效率远低于从 s l 到s o 的辐射跃迁时间。然后从三重态跃迁到s l 并发射一个磷光光子h v p 。单重 态向三重态的跃迁会降低分子的荧光量子产率和缩短分子的荧光寿命，当处于s ， 态的电子弛豫到t l 态时，分子的荧光很弱，乃至没有荧光，形成荧光暗态。一旦 硕l ：学位论文 当电子从s l 或t l 态回到s o 态时，分子处于新的一轮激发和发射的循环过程。因 而形成一个发射一暗态交替的量子跳跃过程，这种量子跳跃过程是单分子荧光的 主要特征之一拍1 。这一重要特征导致了实验中观察到的单分子荧光光谱和荧光强 度的涨落现象，并主要取决于单分子的局域环境及其淬灭途径。因而测量单分子 的荧光量子跳跃过程、荧光寿命和荧光量子产率可以提供很多关于单个荧光分子 所在的局域环境的特性和变化情况的信息。 在理想情况下，一个分子大约能辐射出1 0 。1 0 。个荧光光子。目前光学检测 系统收集、检测光子的效率约为5 ，最好的能达到l o 左右。因此，我们可从一 个“表现”好的荧光分子中观测到5 0 0 0 到5 0 0 0 0 个光子，这一数目不仅足以探测到 单个分子，而且足以进行光谱辨认和实时监测。 1 3 单分子荧光检测的方法 在单分子的实际荧光检测中是用激光激发荧光分子或用染料分子标记的其他 分子使其发出荧光。由于荧光物质通过激光束的时间比荧光的激发态寿命大得多， 因此当荧光分子穿越激光束时可以被反复激发而在基态s o 和电子激发态s l 之间反 复循环，发射出大量的荧光光子，即“光子爆发”。通过这种在短时间内发出大 量光子的“光子爆发”现象可以把单个荧光物质分子的荧光同很强的背景杂散光 区别开来，从而有效地探测单个荧光分子，并从这样的爆发中获取研究对象的相 关信息旧1 。实现单分子荧光检测的重要手段之一就是最大限度地降低背景噪声。 在单分子荧光检测中，单分子信号与探测体积无关，而背景噪声则与探测体积有 关。因而，尽量减少探测体积成为降低背景噪声的重要原则之一。本论文将从减 少探测体积着手，系统地探讨单分子荧光检测的方法。 目前，根据所用仪器及对样品激发方式的不同，单分子荧光检测的光学成像 方法大体可分为宽场落射式荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜、全内反射 荧光显微镜和近场扫描光学显微镜四种类型。 1 3 1 宽场落射式荧光显微镜 宽场落射式荧光显微镜( w i d e f i e l de p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 是单分子 成像最直接和最简单的方法，将普通的荧光显微镜加以改进就可以实现单分子水 平上的成像。其装置如图1 2 所示。激发光由二向色分光镜反射通过物镜，然后入 射到切片上激发荧光物。同时，二向色分光镜通过物镜收集发射的荧光。发射滤 光片吸收激发光谱的反射光，让荧光透过，进入目镜。二向色分光镜是落射式荧 光显微镜的关键部件，与主光路呈4 5 度角安置。检测装置为高灵敏度的电荷藕合 器件( c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ，c c d ) ，如增强型c c d 。 但是当激发光穿过物镜到达样品时，能照亮样品溶液中进入光路中的全部分 以d n a 和蛋白质为探针的同液界面单分了荧光成像研究 子和荧光杂质，然而当荧光进入目镜进行成像采集时，不仅能看清焦平面附近大 约lp m 厚度左右的样本，也能看到焦平面之外分子的模糊成像，由此形成较大的 探测体积。因为探测体积较大，焦平面上下成像模糊的分子、背景荧光以及散射 光等严重干扰单分子成像，极大的降低了信噪比。因而，宽场显微镜只适用于检 测在界面吸附或在界面附近做自由运动的分子。 光源。 激发滤光片。 图1 2 宽场落射式荧光显微镜 1 3 2 激光扫描共聚焦显微镜 在生命科学的研究中，由于宽场激发波长远远大于光学衍射极限给研究带来 许多限制，这就需要减少探测体积，发展一种分辨率较高的单分子探测方法。激 光扫描共聚焦荧光显微镜( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ， l s c f m ) 的发展给单分子探测技术带来了新的生机n0 i 。基于采用光学系统的共轭 焦点技术，使光源、样品和检测器处于彼此对应的共轭位置这一原理，l s c f m u u 与普通光学显微镜相比，最大的优势在于其光路中安装的两个聚焦针孔不仅保证 了很好的光学收集效率和较高的信噪比，而且提高了轴向分辨率。 在共聚焦成像过程中，第一个针孔的作用主要是将激光光源发出的激光束聚 焦在样品的某一层面上，滤掉激光束中非高斯分布的那部分杂散光。随后，激光 束被二向色分光镜反射，进入物镜使之聚焦到样品上，从而激发荧光分子使之发 射出荧光。最后，荧光经同一物镜聚焦穿过第二个针孔( 孔径大约控制在5 0 “m ) 到达监测器。此时焦平面以外的荧光被聚焦在第二个针孔之外，不能穿过第二个 针孑l ，这些信号就不能传输到检测器中。因此，检测器只能检测到焦平面处所发 出的荧光信号。通过沿样品水平和垂直方向移动样品或物镜的位置，可以获得样 品的三维荧光信息，并且无需破坏样品，如图1 3c 1 2 1 所示。因为从单个分子收集到 硕上学位论文 的有效光子数目有限，针孔的直径又决定共聚焦成像区域的绝对深度，所以必须 选择适当大小的针孔孔径。此外，为得到最好信噪比还必须同时严格地控制共聚 焦显微镜的两个焦点使之位于同一光轴上，这样才可保证共聚焦成像获得足够高 的分辨率和足够强的光信号。该技术成像的分辨率与下面的因素有关：( 1 ) 激发 光与入射光的波长，( 2 ) 针孔的孔径，( 3 ) 物镜的数值孔径，( 4 ) 光程中物质 的折射率，( 5 ) 仪器的准直性。 l s c f m 技术的激光束探测体积仅为l o - 2 1l ，极大的降低了背景噪声，大大提 高了信噪比。一般在水平方向的分辨率大约为0 2 微米，在垂直方向的分辨率大约 为o 1 微米。这对生物学体系中单细胞研究尤其重要，因为焦平面以外的细胞自身 荧光需要最小化。此外，该技术突破了普通光学显微镜只能观察平面图像的限制， 实现了一定厚度样品的三维层析图像，可提供较高的时间和空间分辨率。目前已 应用于单分子荧光能量共振转移检测，光谱分析，动力学检测等1 引。但作为一 种点扫描成像技术，共聚焦荧光显微镜的时间分辨率有限，难以对溶液中自由扩 散的单个分子示踪。此外，由于荧光信号较弱，通常需要较强的激发光源如激光， 经常会导致样品的光漂白。 图1 3 激光扫描共焦显微镜的光路示意图n 2 1 激光从a r 离子激光器发出，经激发光针孑l 后被一双色镜反射，进入物镜使之聚 焦到样品上，从样品上激发出的荧光被同一物镜收集透过双色镜后经发射光滤 光片后进入检测器端针孔然后被光电倍增管检测 1 3 3 全内反射荧光显微镜 全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ， t r f m ) 是一种最为常用的单分子、单细胞研究手段，它主要是用来研究在两个 具有不同折射率的介质交界表面的单分子行为。当光波穿越一个高折射率的介质 ( 如玻璃1 到达一个相对低折射率的表面( 如水或缓冲液) 时，如果入射角度在临界 点之上，光会被完全反射回来，并且在折射率较低的介质内，从临界面丌始形成 持续的光波，光强度从分界面开始以指数级的速度递减，被称为“隐失波”。t i r f m 就是利用此隐失波照明样品，激发界面上大约2 0 0n m 以内的荧光分子，极大的降 低了背景噪声，因此具有其它光学成像无法比拟的高信噪比和对比度。 木 拽坡片 植健 射光 反射光 木 蛾睦片 图14 两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统：( a ) 为棱镜型，( b ) 为物镜型 到目前为止，已经发展r 多种全内反射荧光显微镜成像系统。其中最为普遍 的有两种类型：棱镜型和物镜型，如图l4 “。棱镜型t i r f m 只需要显微镜，棱镜 和激光光源，建立该系统价格便宜，而且在设计满足照明和聚焦要求的光学系统 时，几乎没有限制所以容易实现。棱镜为发生全内反射的光学器件，物镜只是 荧光信号的收集器。在具体操作时应十分注意所选用棱镜表面的平整度，如果表 面过于粗糙就柏可能使一些光线在棱镜表面上发生散射或导致入射角的不一致而 使一部分光线不能发生全内反射。在探测上，不容易受到入射光的干扰。因此， 该系统背景噪声极低，能够得到高质量成像。然而该系统放置样品的空间位于棱 镜和盖玻片之间，所以受到样品大小和样品放置的限制，不利于研究细胞、组织 等较厚的样品，也很难将该技术与其它高灵敏度的检测手段联合使用。物镜型 t i r f m 使用高数值孔径的物镜作为样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全内 反射的光学器件，故高数值孔径的物镜使用是该系统的关键。在该系统中，样品 的大小不受到棱镜的限制，样品的放置也非常方便，且收集荧光的效率较棱镜型 的要高，不过存在难以精确控制入射光的角度以致很难进行精确控制激发深度“” 反射光 射光 硕j ：学位论文 的缺陷。此外，由于样品远离物镜，物镜型全内反射荧光显微镜可以与多种其他 技术相结合，例如微操作，微分干涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等 n 6 h 1 ，因而相对于棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。然而，t i r f m 的激发 区只限制在焦平面上薄薄的一层，不能观测垂直焦平面的成像，因而其应用受到 限制。 1 3 4 近场光学扫描显微镜 近场扫描光学显微镜( n e a r f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p y ，n s o m ) 是在 扫描探针显微镜基础上与光学探测方法相结合而发展起来的单分子荧光成像技 术。由于光衍射现象的存在，普通光学显微镜成像的分辨率常受到光波波长的限 制，而n s o m 则能够突破光学衍射的极限获得超高分辨率。 近场光谱学是最吸引人、最有发展前途的研究。1 9 2 8 年，s y n g e 第一次提出近 场光学的方法，1 9 7 2 年t r a u t m a n 等人最初证明近场光学发生在微波波长范围n 8 | 。 所谓近场是指光源与样品间的距离远