（细胞生物学专业论文）斑马鱼angiomotinlike2互作蛋白的筛选和功能初步研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者虢雾玩 如，、 剔醛象形饧 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 整可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 签字日期：2 0 06 年r 月 厂 新签7 - ：磊劣 、? p 导师签：弓饧 签字同期：2 0 0z 年晰 髟 ， 国7 府 山东师范大学硕士学位论文 斑马鱼a n g i o m o t i n - l ik e2 互作蛋白的筛选和功能初步研究 中文摘要 斑马鱼是种新兴的模式生物，近十几年来，以斑马鱼为模式生物的研究在 脊椎动物胚胎发育的研究领域获得了长足进展。斑马鱼作为模式生物有着不可替 代的优势，它价格便宜，容易获得，体积小、易密集饲养。斑马鱼的胎间距仅为 3 个月，雌性斑马鱼每周可产生大量后代，其胚胎的受精及发育都在母体外进行， 受精卵大，早期胚胎完全透明，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的 细胞。斑马鱼胚胎发育非常迅速，从受精到孵出大约3 d ，主要器官都在受精后 2 4 h 内形成，在胚胎发育时期，其体型不会发生多大变化；而且，来自于同一母体 的胚胎是同步发育的，易于大量收集特定阶段的同期胚胎材料。目前一种新的手 段注射反义吗啉环寡聚核苷酸以抑制某一特定基因的表达的方法已经在斑 马鱼上得到了很好的应用。此外，斑马鱼基因组的测序工作也已经完成。因此， 本实验室也以斑马鱼作为模式生物，对其胚胎发育过程中重要的蛋白因子 k n g i o m o t i nl i k e2 进行分子生物学方面的研究工作。 a n g i o m o t i n 是通过以a n g i o s t a t i n 为诱饵的酵母双杂交系统筛选得到的， 它是m o t i n 家族的成员之一，该家族迄今为止还发现有另外两个成员，它们是 a n g i o m o t i nl i k e1 ( a m o t l i ) 和a n g i o m o t i f il i k e2 ( a m o t l 2 ) 。它们在分子结 构上都有保守的c o i l e d c o i ld o m a i n 和c - t e r m i n a lp d zb i n d i n gd o m a i n 。 k n g i o m o t i n 可以介导k n g i o s t a t i n 对体外内皮细胞迁移和微管形成的抑制作用， 促进血管生成，这种介导作用依赖于其分子结构中的p d zb i n d i n gd o m a i n 。 a n g i o s t a t i n 是一种血管生成作用的抑制分子，它可以抑制上皮细胞的迁移，增 殖以及微管的形成：这种抑制作用依赖于a n g i o m o t i n 的结合，研究表明 a n g i o m o t i n 在血管生成过程中起核心作用。 本实验室从5 体节时期斑马鱼胚胎的e d n a 文库中应用基因芯片技术筛选得 到了对f g f 信号通路响应的新基因a n g i o m o t i n l i k e2 ( a m o t l 2 ) ，它在斑马鱼 中从未有过相关报道，a m o t l 2 基因编码区全长为2 1 6 6 b p ，形成的蛋白长7 2 1 个 氨基酸残基。从序列信息中我们得知它与小鼠的k n g i o s t a t i n 结合蛋白 a n g i o m o t i n 有很高的同源性，通过整胚原位杂交实验，已经检测到斑马鱼 t- 山东师范大学硕士学位论文 z a m o t l 2 的表达谱，还发现z a m o t l 2 的表达可能与胚胎内的细胞迁移事件有关并 受到f g f 信号通路的调控。 由于z a m o t l 2 在基因序列和结构上与 i o t i n 家族的成员有很高的同源性，其 可能的与细胞迁移有关的生物学功能以及响应胚胎f g f 信号通路的功能都对斑 马鱼胚胎细胞迁移和血管生成的分子机制的研究带来了新的探索，甚至有望通过 解开肿瘤血管生成抑制因子a n g i o s t a t i n 的作用机制达到利用生物科技治疗肿 瘤的目的，因此我们将其作为研究对象，通过检测蛋白质相互作用的实验方法寻 找与之互作的蛋白。 我们以斑马鱼不同时期胚胎( 1 细胞期、4 0 # b 包、2 4 小时) 的m r n a 混合物 为模板构建了c d n a 文库，通过酵母双杂交技术筛选到了约3 0 种能够与z a m o t l 2 发生相互作用的文库蛋白，在筛选得到的阳性克隆中挑选出了d a p p e rh o m o l o g 2 ( d p r 2 ) 蛋白和g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e3 ( g s k 3 ) 蛋白作为下一步的研究 对象。这是因为这两种蛋白在脊椎动物胚胎发育的重要信号通路如n o d a l 信号和 w n t 信号中都起着十分重要的作用，且目前研究现状也比较成熟，对于进一步揭 示z a m o t l 2 对胚胎发育的细胞迁移、血管发生等生命活动具有重要的研究意义。 关键词：斑马鱼、z a m o t l 2 、酵母双杂交、d p r 2 、g s k 3 分类号：q 7 8 山东师范大学碱十学位论文 a s t u d yo fs c r e e n i n go ft h ep r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t h z e b r a f i s ha n g i o m o t i n l i k e 2v i ay e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m a b s t r a c t z e b r a f i s h ( b r a c h y d a n i or e r i o ) ，a san e wm o d e la n i m a lw i l d l yu s e do ne m b r y o d e v e l o p m e n ts t u d yo fv e r t e b r a t e ，b e c a m ep o p u l a ra n du s e f u l i nr e c e n tt e ny e a r s ，t h e s t u d yo fv e r t e b r a t ee m b r y od e v e l o p m e n tu s i n gt h i sm o d e lh a sd e v e l o p e dr a p i d l y t h e r ea r es e v e r a la d v a n t a g e so fz e b r a f i s ht ob eam o d e la n i m a l f i r s t l y , t h e ya r es m a l l a n de a s yt ob er a i s e d t h ef e m a l ec a nl a ym o r et h a n2 0 0e g g so n c eaw e e ka n dt h e e m b r y o sn e e do n l y3m o n t h st ob eh a t c h e d ，s e c o n d l y , t h ez y g o t e so fz e b r a f i s ha r eb i g a n dl i m p i d ，s oi ti sq u i t ec o n v e n i e n tt oo b s e r v et h ew h o l ed e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e so f z e b r a f i s he m b r y oa n da n a l y s et h ef e a s i b l ee n d p o i n t si ne m b r y o t o x i c o l o g i c a lt e s t i n g f i n a l l y , t h ed e v e l o p m e n to fz e b r a f i s he m b r y oi sq u i t er a p i d ，o n l yn e e d3d a y sf r o m i m p r e g n a t e dt oi n c u b a t e d r e c e n t l ya n e wm e t h o dw h i c hm i c r o i n j e c tm o r p h o l i n oi n t o t h ee m b r y oo fz e b r a f i s ht oi n h i b i ts p e c i a lg e n e sa c t i v i t yh a se f f e c t i v e l yt ob eu s e d a s ar e s u l t ，w ed e c i d e dt ou s ez e b r a f i s ha sam o d e lt os t u d ya ni m p o r t a n tp r o t e i nn a m e d z e b r a f i s ha n g i o m o t i nl i k e2 ( z a m o t l 2 ) an o v e lp r o t e i n ，n a m e da n g i o m o t i n ，h a v eb e e nr e c e n t l yi d e n t i f i e d b yi t sa b i l i t y t ob i n dt h ea n g i o g e n e s i si n h i b i t o r a n g i o s t a t i n i nt h e y e a s tt w o 。h y b r i ds y s t e m a n g i o m o t i nb e l o n g st oaf a m i l yw i t ht w oo t h e rm e m b e r s ，a m o t l 一1a n da m o t l 2 c h a r a c t e r i z e db yc o i l e d - c o i la n dc - t e r m i n a lp d zb i n d i n gd o m a i n s h e r ew es h o wt h a t t h ep u t a t i v ep d zb i n d i n gm o t i fo fa n g i o m o t i ns e r v e sa sap r o t e i nr e c o g n i t i o ns i t ea n d t h a td e l e t i o n o ft h r e ea m i n oa c i d si n t h i ss i t er e s u l t si ni n h i b i t i o no fe h e m o t a x i s f u r t h e r m o r e ，e n d o t h e l i a lc e l l se x p r e s s i n gm u t a n ta n g i o m o t i nf a i l e dt om i g r a t ea n d f o r mt u b e si na ni nv i t r ot u b ef o r m a t i o na s s a y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ep u t a t i v e p d zb i n d i n gm o t i fo fa n g i o m o t i np l a y sac r i t i c a lr o l ei nr e g u l a t i n gt h er e s p o n s i v e n e s s o fe n d o t h e l i a lc e l l st oc h e m o t a c t i cc u e s a n g i o s t a t i n ，ac i r c u l a t i n gi n h i b i t o ro f a n g i o g e n e s i s ，w a si d e n t i f i e db y i t s a b i l i t y t om a i n t a i nd o r m a n c yo fe s t a b l i s h e d m e t a s t a s e si nv i v o i nv i t r o ，a n g i o s t a t i ni n h i b i t s e n d o t h e l i a lc e l l m i g r a t i o n ， p r o l i f e r a t i o n ，a n dt u b ef o r m a t i o n ，a n di n d u c e sa p o p t o s i s i nac e l l t y p e - s p e c i f i c - - ， 3 山东师范夫学硕 。学位论文 m a n n e n t h e s ef i n d i n g si n d i c a t et h a ta n g i o s t a t i ni n h i b i t sc e l lm i g r a t i o nb yi n t e r f e r i n g w i t ha n g i o m o t i na c t i v i t yi ne n d o t h e l i a lc e l l s w eh a v es c r e e n e da m o t l 2g e n eu s i n gg e n ec h i pm e t h o df r o mz e b r a f i s he a r l y d e v e l o p m e n t a le m b r y o sc d n al i b r a r y i tc a nr e s p o n dt ot h ef g fs i g n a l i n gp a t h w a y t h e r ei sn or e p o r t so fa m o t l 2i nz e b r a f i s hf i e l dn o w t h ef u l ls e q u e n c el e n g t ho f a m o t l 2i s216 6b p ，a n dt h ep r o t e i nh a s7 21a m i n oa c i d s w eh a v ei d e n t i f i e da m o t l 2 h o m o l o gi nm i c ef r o ms e q u e n c ea n a l y s i s ，t h e a l i g n m e n to ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c e s e n c o d ei n t h i st w op r o t e i n sa r eh i g h l yh o m o l o g i c v i aw h o l em o u n ti n s i t u h y b r i d i z a t i o nw eh a v ed i s c o v e r e dt h ed e v e l o p m e n te x p r e s s i o np a t t e mo fa m o t l 2i n z e b r a f i s he m b r y o ，a n df o u n dt h ee x p r e s s i o no fa m o t l 2m a yb ec o n n e c t e dw i t ht h e c e l lm i g r a t i o na n dw a sr e g u l a t e db yf g f s i g n a l i n gp a t h w a y a m o t l 2i sh i g h l yh o m o l o g i ct ot h em e m b e r so fm o t i nf a m i l y , t h ef u n c t i o no fi t w h i c hm a yb er e l a t e dt oc e l lm i g r a t i o na n dc a r lb er e g u l a t e db yf g fs i g n a lo p e na n e ws t u d yo ft h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fz e b r a f i s he m b r y oc e l lm i g r a t i o na n d a n g i o g e n e s i s s ow eh o p et os c r e e nt h ep r o t e i n sw h i c hc a ni n t e r a c tw i t ha m o t l 2a n d c a nf i n dan e w w a y t oc u r ec a n c e rw i t han e wm e d i c a t i o na n g i o s t a t i o n w eu s e dt h em i x t u r eo fm r n ao fz e b r a f i s he m b r y oi nd i f f e r e n td e v e l o p m e n t a l s t a g e ss u c ha sl c e l l ，4 0 e p i b o l y , 5s o m i t ea n d2 4 ha st h et e m p l a t et oc o n s t r u c tt h e c d n a l i b r a r y , a n ds c r e e n e da b o u t3 0k i n d so fl i b r a r yp r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t ha m o t l 2 t h r o u g hy e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m f r o mt h er e s u l t sw es e l e c t e dd a p p e rh o m o l o g 2 ( d p r 2 ) a n d g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e3 ( g s k 3 ) a s t h e n e x ts t u d yo b j e c t s b e c a u s e t h e y a r eb o t hi m p o r t a n tp r o t e i n si nm a n yk e ys i g n a l i n gp a t h w a yi nv e r t e b r a t ed e v e l o p m e n t i ti ss n r et h e s er e s u l t sa r eu s e f u lt od i s c o v e rt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fz e b r a f i s h e m b r y oc e l lm i g r a t i o na n da n g i o g e n e s i s 4 k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ，a m o t l 2 ，y e a s tt w o - h y b r i d ，d p r 2 ，g s k 3 c a t e g o r yn u m b e r ：q 7 8 山东师范人学硕i 学位论文 第一章文献综述 1 斑马鱼是脊椎动物早期胚胎发育研究中的模式动物 1 1 斑马鱼作为模式生物的优点 理想的研究系统是科学研究与发展的关键，果蝇( b r o s o p h i l a ) 和线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se e g a n s ) 作为无脊椎动物发育生物学研究的模式动物奠定 了分子发育生物学研究的基础。它们之所以能够作为模式动物，其主要原因就 在于它们将胚胎学和遗传学二者有机的结合起来。因为我们不但可以对它们胚 胎的发育过程进行观察，而且可以对其进行突变研究，分析遗传方面的影响。 但是，由于脊椎动物在胚胎结构及形态形成等方面都与无脊椎动物存在差异， 其中有些特征根本不能用无脊椎动物进行研究，进行脊椎动物胚胎的形成及人 类发育方面的研究就必须借助于理想的脊椎动物的模式种。鼠类虽然带动了现 代高等遗传学( 特别是基因转移方面的) 的发展，但其胚胎深埋于母体子宫中无 法进行观察；爪蟾一直是胚胎学的好材料，但因其繁殖太慢而难以成为遗传学 研究的好对象；其他的模式动物也存在着一些缺点。在脊椎动物发育生物学研 究方面，始终难以找到像果蝇和线虫一样理想的模式动物，而繁育能力强、体 外受精、胚胎透明的鱼类订：始引起了发育生物学家们的注意。 剀1 1 斑马鱼j c l 片 美国俄勒冈大学己故的著名遗传学家g e o r g es t r e i s i n g e r 在二十多年前 把目光转向了一个小型的鱼类斑马鱼( d a n i or e r i o ) ，并开始了对其发育 山东帅范大学硕+ 学位论文 生物学方面的研究。斑马鱼是在印度和巴基斯坦河里发现的一种鲤鱼，成年 鱼3 - 4 c m 长，身上有漂亮的斑马花纹，群居生活，( 如图1 1 ) 。随着近十几年 来大批分子生物学家对斑马鱼的重视，斑马鱼在提示生命本质及其运行机制的 发育生物学领域中的地位同趋重要。此后，越来越多的发育生物学家开始把目 光投向了斑马鱼，使其做为研究脊椎动物发育的模式生物而得到越来越广泛的 应用。目前斑马鱼已成为胚胎发育遗传控制研究中盛行的动物模型，被誉为“脊 椎动物中的果蝇”f 2 1 。 斑马鱼之所以可以作为一种理想的模式生物，主要因为其具有以下几点特 征： 斑马鱼价格便宜，容易获得。成年斑马鱼的体长仅3 c m 左右，而且能承受高密 度饲养一每升水中最多可容纳5 尾，意味着容易饲养大量群体，管理饲养易 行。 斑马鱼的胎帕j 距短，为3 个月，每条雌性斑马鱼每周可产生大量后代( 2 0 0 枚胚胎) ，受精及发育都在母体外进行，因此容易进行观察和操作，如进行组 织移植或化学药物刺激等。 斑马鱼的胚胎在母体外发育，可以在母体外对胚胎进行独立操作；胚胎发育 非常迅速( 从受精到孵出大约3 d ，主要器官都在受精后2 4 h 内形成) ，而且， 来之自同一母体的胚胎是同步发育的，易于大量收集特定阶段的同期胚胎材 料。 受精卵大( 直径约l m m ) ，早 期胚胎完全透明，因而易于 观察内部结构。单倍体，雌 核发育二倍体的制备和突 变体的获得均较容易。胚胎 是完全透明的，这样即使在 发育的高级阶段，仍然可以 观察到全部的细胞。这使得 研究者不仅能跟踪观察每 一个细胞的发育命运，而且图1 2 斑马鱼胚胎发育时空图谱 山东师范大学硕士学位论文 也可观察得到原肠期的细胞运动、脑区的形成和心跳等胚胎发育事件，还可 以在胚胎之间移植组织甚至细胞，发育过程中的突变体也很容易就能被鉴定 出来。 在胚胎发育时期，其体型不会发生多大变化。一些技术和荧光染色获得胚胎 发育图，细胞及组织移植技术，全胚组织标本制作技术，及全胚原位杂交技术 都可以在后期胚胎上实施。通过显微注射操作实施的转基因技术也已经比较 成熟f 3 _ 8 1 。 目前一种新的手段注射反义吗啉环寡聚核苷酸以抑制某一特定基因的 表达的方法已经在斑马鱼上得到了很好的应用，这对研究某一个基因的功能 有了巨大的推动作用 9 1 。 c k 夕l - ，斑马鱼基因组的测序工作也已经完成。 目前，斑马鱼已应用于细胞系谱分析，突变鉴别，饱和诱变分析，基因转移 研究等领域，其可以将经典遗传学和胚胎观察与胚胎操作结合起来的优势使我们 有条件去鉴定分析控制胚胎发育和器官发生的基因，从而在发育生物学领域获得 突破性的进展，并带动生命科学和相关学科的变革和发展【“】。 1 2 斑马鱼早期胚胎发育阶段 根据斑马鱼在受精后3 d 之内发育过程中的主要形态变化，可以将其胚胎发 生过程分为8 个大的时期受精卵期( 受精开始) 、卵裂期( 受精后0 ，7 5 h 开 始) 、囊胚期( 受精后2 2 5 h 开始) 、原肠胚期( 受精后5 2 5 h 开始) 、分节期( 受 精后l o h 开始) 、咽胚期( 受精后2 4 h 丌始) 以及孵化期( 受精后4 8 h 开始) ，然 后进入幼鱼阶段( 受精后3 d ) 1 2 】( 见表1 1 和图1 2 ) 。 1 3 斑马鱼早期的细胞运动以及命运图谱 斑马鱼的胚胎发育过程为一个不完全卵裂的过程( 又叫偏裂) ，即卵裂的过 程主要发生在动物极，为端黄卵。在发育到了1 2 8 细胞期时，胚胎进入囊胚期， 这时胚胎除分裂外主要的细胞运动为外包，它的基本任务是将积累的分裂球或者 胚盘铺展到卵黄细胞的表面。在经过两次分裂进入中囊胚过渡期，此时细胞分裂 变慢，分为3 种细胞：与卵黄接触的卵黄多核层( y s l ) ，位于胚胎最外层的表 - 7 山东师范人学顺l 一学位论立 胚层( e v l ) 以及位于上述二者之间的深层细胞( 仅有该细胞才发育为胚 表1 1 斑马鱼早期发育的各个时期 胎的本体) 。在胚胎进入原肠胚之后，细胞除了外包外还进行内卷和汇聚运动。 分裂球的内卷发生在胚盘的全部边缘，导致了内部细胞层的形成。内部细胞层， 即下胚层，将会衍生出中胚层( m e s o d e r m ) 和内胚层( e n d o d e r m ) 。而外层细胞， 即上胚层( 外胚层e c t o d e r m ) ，将产生表皮和神经外胚层。在外包和内卷的同时， 上胚层和下胚层的细胞都向胚胎的背侧集中，形成了躯体轴线的原基，也就是所 谓的“胚盾( e m b r y o n i cs h i e l d ) ”，它是胚胎背部的标志。胚盾是斑马鱼发育的组织 中心，具有类似与爪蟾的胚孔背唇或者鸡与小鼠的亨氏节( h e n s e n sn o d e ) 的功 能。斑马鱼在形成了3 个胚层后，其各部分细胞也就有了相应的发育命运。图 山东师范大学硕士学位论文 1 3 表示了斑马鱼胚胎原肠作用的主要运动，图1 4 简要的列出了斑马鱼胚盾时 期各个胚层的位置以及各处细胞的不同发育命运【l “。 在胚胎原肠期随着原肠作用的进行，胚盾两侧的细胞通过胚盾分别向其前后 两端运动，在背部向前形成脊索前板区域，向后运动形成了脊索u 4 - 1 5 。脊索前部 将发育为胚胎前部的孵化腺以及头部中胚层组织【i “，而后部的脊索则会对后部 的神经组织、体节、脊髓等的发育有影响旧。 、 e x t e o 目o n e f n b q t o n i cs h i e l d c o n v e ，9 0 n c e g e m ln n g 加v o l u d o no r i n g r e s s i o n e p j b o l y 图1 3 原肠中期斑马鱼胚胎的原肠运动，包括延伸( e x t e n s i o n ) ，内卷( i n v o l u t i o n ) ，外包 ( e p i b o l y ) ，汇聚( c o n v e r g e n c e ) 等。 恤 a r d m d 酬 图1 4 胚盾期斑马鱼的结构草图( a ) 以及各处细胞的命运图谱( b ) ，其中p e p 指的是 脊索前板，n o t o c h o r d 指的是脊索。 2a n g i o m o t i n 的研究综述 2 1 肿瘤血管生成与内源性血管抑制因子a n g i o s t a t i n 肿瘤的血管生成对于肿瘤的生长、浸润和转移有重要意义。近年来在肿瘤领 山东师范大学硕士学位论文 域研究的重大进展之就是确立了肿瘤血管生成( a n g i o g e n e s i s ) 在肿瘤发展中 的重要地位与抗血管生成治疗肿瘤( a n t i a n g i o g e n e t i ct h e r a p y ) 的意义。肿瘤的 生长可分为无血管期( a v a s c u l a rs t a g e ) 和血管期( v a s c u l a rs t a g e ) 。体积超过 l 2m 一的肿瘤即进入血管期，需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物从而 迅速生长并可发生转移。 早在7 0 年代初，f o l k m a n 【f8 】就提出，肿瘤生长与血管生成有重要的联系： 肿瘤生长需要血管为之提供养料并运走代谢废物，没有血管，肿瘤一般只生长到 直径1 2m m ，此时的瘤体可通过渗透作用从周围组织中获得营养，维持自身的 生存，而瘤体的进一步长大，则要依靠新生血管以获得充分的营养供应。而且血 管的生成不仅为肿瘤提供了生长必须的营养，同时也为肿瘤细胞扩散提供了可 能。根据这一现象，f o l k m a n 提出了通过对抗肿瘤血管生成来治疗肿瘤的假说， 即以血管内皮细胞为目标靶，通过对抗肿瘤血管生成，切断肿瘤的供养，从而遏 制肿瘤的生长和转移。抗血管生成( a n t i a n g i o g e n e s i s ) 治疗肿瘤的理论与实践从 此得以确立、发展。 2 1 i1 肿瘤的血管生成及形态功能特点 肿瘤血管生成有别于生理条件下严格受控的血管形成过程 ( v a s c u l o g e n e s i s ) 。主要过程目前认为是：诱发因素一肿瘤细胞被活化分泌可能 性血管生成刺激因子，如血管内皮生长因子( v e g f ) 、成纤维细胞生长因子( f g f ) 一激活内皮细胞和金属蛋白酶一基底膜被破坏，内皮细胞收缩、趋化、迁移、增 殖，形成血管芽一血管芽吻合成血管。肿瘤的血管生成是一个持续、无控性的过 程，这种持续无规则性的血管生成推动了肿瘤的生长和转移。 肿瘤主要依靠不断地诱发宿主组织毛细血管生成，并不断地向肿瘤内生长而 建立扩大自己的微血管网。新生的毛细血管出现迅速，生长快，并且新生血管总 是由宿主产生，以血管芽的方式朝肿瘤方向生长，肿瘤组织中缺乏控制血管生成 的调节机制。 人们利用血管灌注、血管造影等方法以及光镜、电镜等技术对肿瘤新生微血 管的形态结构及机能作了大量观察，结果表明：肿瘤新生血管的生长方式与正常 组织有相似之处，但其生长呈持续性，肿瘤组织内缺乏控制血管生成的调节机制， 山东师范火学硕士学位论文 肿瘤血管的l o 2 0 的内皮细胞在任何时候都处于d n a 合成状态；肿瘤血管 形成后不再进一步分化或改建成小静脉和小动脉，肿瘤血管无平滑肌成分，不具 有收缩功能；肿瘤内血管缺乏神经支配和对血管活性物质反应的结构，因此对高 温及血管活性物质的反应明显降低：肿瘤内微血管的形态结构表现出很大的差 异，常出现不规则的狭窄、扩张及扭曲，可能由于肿瘤细胞增殖不均衡，肿瘤各 处不规则扩大的结果。新生微血管腔不规则，呈窦状扩张，壁薄，仅排列一层内 皮细胞，基底膜缺乏或变薄，内皮细胞之间联接常开放，出现裂隙；肿瘤内微血 管网丰富，但肿瘤微循环仍表现出低效和相对不足，肿瘤组织特别是中心部位常 常因为缺血缺氧而坏死。此外，由于肿瘤内微血管渗透性高，有很多大分子物质 漏出，而肿瘤内缺乏淋巴管，组织间液不能及时排出以及肿瘤细胞的迅速增生等 使组织间隙流体静压增高，压迫小血管，血流阻力加大，导致肿瘤组织供血供氧 不足d 9 。 2 1 2 肿瘤血管生成的抑制因子a n g i o s t a t i n 对血管生成调控机制的研究与认识，是抗血管生成治疗的重要基础。近年来， 人们对血管生成因子及其受体家族和血管生成抑制物等进行了广泛而深入的研 究，逐步认识到血管生成因子和内源性血管生成抑制因子间的“平衡与失衡”对 肿瘤血管生成的重要关系。肿瘤血管生成的发生、发展是由这些因子之间的平衡 所决定的。 自f o l k m a n 提出对抗肿瘤血管可以治疗肿瘤的假说以来，许多具有抗血管 生成作用的物质相继被报道，其中尤以内源性血管生成因子备受人们的重视。 血管抑素( a n g i o s t a t i n ，a n g i o s t a t i n ) 是1 9 9 4 年美国哈佛大学医学院的 0 r e i l l y 等学者从荷瘤小鼠的血清和尿液中首次提纯出来的一种血管生成抑 制剂。a n g i o s t a t i n 是纤溶酶原的一个蛋白片段，分子量3 8 k d ，是一个较强 的血管生成和内皮细胞迁移、增殖抑制剂，命名为血管生成素抑制素( 简称血管 抑素) ，随后发现在人体内同样存在这种大分子活性物质，能够特异性抑制内皮 细胞的增殖。 a n g i o s t a t i n 作为新发现的抑制血管生成的因子，特异作用于内皮细胞，不 会产生耐药性与毒副作用，与传统疗法相比，对肿瘤的治疗有着不可比拟的优越 山东师范大学硕。i j 学位论文 性。传统疗法均以肿瘤细胞为靶，但肿瘤细胞基因具有不稳定性，易突变，会产 生耐药性。血管抑素作用的靶细胞是内皮细胞，它不具有肿瘤细胞那种高度不稳 定性，因此不易对血管抑素产生耐药性。再者尽管各种肿瘤细胞差异极大，其血 管细胞差异较小，所以血管抑素可能对不同肿瘤均有疗效。它通过抑制内皮细胞 的增殖和转移，抑制新生血管的生成，控制肿瘤细胞的营养来源，使肿瘤细胞的 增殖与凋亡处于平衡状态以达到治疗肿瘤的目的。 2 2a n g i o m o t i n 研究综述 2 2 1a n g i o m o t i n 的分子结构和功能 a n g i o m o t i n 是通过以a n g i o s t a t i n 为诱饵的酵母双杂交系统筛选得到的， 它是m o t i n 家族的成员之一，除了a n g i o m o t i n 之外，该家族迄今为止还发现有 另外两个成员，它们是a n g i o m o t i nl i k el ( a m o t l l ) 和a n g i o m o t i nl i k e2 ( a m o t l 2 ) 。它们在分子结构上都有保守的c o i l e d c o i ld o m a i n 和c - t e r m i h a l p d zb i n d i n gd o m a i n 。“j ，( 见图2 1 和图2 2 ) 。a n g i o m o t i n 可以介导 a n g i o s t a t i n 对体外内皮细胞迁移和微管形成的抑制作用，促进血管生成。这种 介导作用依赖于其分子结构中的p d zb i n d i n gd o m a i n ，有研究表明野生型的 a n g i o m o t i n 在小鼠内皮细胞表达后，可在趋化因子bf g f 、v e g f 、l p a 的刺激下 使细胞迁移作用增强：而敲除掉a n g i o m o t i n 末端3 个氨基酸残基即p d zb i n d i n g d o m a i n 区域的突变体则不能响应上述趋化因子的刺激，不能促进细胞迁移【2 4 】。 1 2 n g m m o i i nc h u m a n 砸墨匠= 当兰= = 二= = = = = = 二二蠢雩汹 3 7 1mb a n 昏o m o t i nf m o u s o a m o t mc h u n 幢n ) a m o u f m o ) a m o _ 1 1 2m u m a n ) m o t l 2 ( m o u s e l 图2 山东师范人学硕 。学位论文 a n a n 嘲耐曲啦阽 n 口l 。咖帅p o z 时心目 “匮瑟瑟瑟蚕e 盈三j 二二口c t 22 7 8 3 t 23 4 24 谨蛳8 ” g 麓m 哪惝d o m s i n c o z l 鲥目d a t n 懈p o zb “5 n g a m o t l l 一 二二卫霎霾圈圈目e 三二二 c 1 1 笋 2 碍4 6 昭瑚两89 拍 g m 啪r 冲舶啉n d l _ d 州1 1 1 牟p o zb i r d n g n m 敝 ”咀 二 匿毯圈蕊圈三三 c 图2 2m o t i n 蛋自家族成员的蛋白结构域 细胞迁移是许多重要生命活动如免疫反应、神经系统生成和血管生成中必不 可少的活动，p d zb i n d i n gd o m a i n 和含有p d z 结构域的蛋白己被证明在很多蛋 白相互作用和细胞迁移事件中具有关键作用，如将特定蛋白靶定于膜的特定区域 ”“，多个p d z 蛋白相互作用组成有利于信号复合物与膜受体相互联系的蛋白支 架1 2 ，p d z 蛋白结合到膜受体上调控细胞水平的迁移反应如微管形成、内皮细胞 迁移等”1 。p d zb i n d i n gd o m a i n 的分子三维结构见( 图2 3 ) ，它的功能类似于 s h 2 和s h 3d o m a i n ，在信号通路的转导过程中，它常常作用于特定的蛋白并将其 靶定在通路的特定位点上，因此它在m o t i n 家族的成员的生物功能方面可能发挥 重要的作用2 2 1 。有趣的是p d zd o m a i n 和p d zb i n d i n gd o m a i n 可能是定位于紧 密联结上的蛋白的一个通用结构域 2 8 1 。m o t i n 家族的另一保守功能区 c o i l e dc o i ld o m a i n ，它的主要的结构功能类似于介导微丝蛋白。c o i l e d c o i l 能够作为功能区域促使两个多肽相互联系，该功能可能是形成二聚体的基础，例 如在作为转录因子的亮氨酸拉链家族中形成二聚体，如作为小g t p a s e s 的r h o 家族的r a c 蛋白，就可以通过其增强子a r f a p t i n p o r l 的c o i l e d c o i ld o m a i n 与之相互作用【2 9 j 。 图2 3p d zd o m a i n 蛋白折叠图 山东师范大学硕士学位论文 2 2 2a n g i o m o t i n 的作用机制和研究现状 清华大学生物科学与技术系分子发育生物学实验室从5 体节时期斑马鱼胚 胎的e d n a 文库中应用基因芯片技术筛选得到了对f g f 信号通路响应的新基因 a n g i o m o t i n l i k e2 ( a m o t l 2 ) ，它在斑马鱼中从未有过相关报道，a m o t l 2 基因 编码区全长为2 1 6 6 b p ，形成的蛋白长7 2 1 个氨基酸残基。从序列信息中我们得 知它与小鼠的a n g i o s t a t i n 结合蛋白a n g i o m o t i n 有很高的同源性，a n g i o s t a t i n 是一一种血管生成作用的抑止分子，它可以抑止上皮细胞的迁移，增殖以及微管的 形成：而这种抑止作用依赖于a n g i o m o t i n 的结合【3 0 j ，在小鼠的上皮细胞中报道， 没有a n g i o m o t i n 表达的细胞的微管生成不受a n g i o s t a t i n 的抑止，而 a n g i o m o t i n 表达的细胞中这种抑止作用非常明显，这就提示了a n g i o m o t i n 在血 管生成过程中是a n g i o s t a t i n 的介导者1 3 “。另外瑞典学者h o l m g r e n 发现 a n g i o m o t i n 敲除的小鼠或者重要结构域突变都在血管生成过程中存在明显的缺 陷，甚至导致胚胎阶段的死亡，这更况明了a n g i o m o t i n 在血管生成过程中的核 心作用【3 。最新的研究还表明a n g i o m o t i n 可能不仅通过稳定已经生成的微管， 同时刺激内皮细胞的浸润来发挥其生物功能【3 3 1 。 图2 4 斑马鱼a n g i o m o t i nl i k e2 的表达谱 本实验室通过整胚原位杂交实验，已经检测到斑马鱼a n g i o m o t i nl i k e2 ( z a m o t l 2 ) 的表达谱，( 见图2 4 ) ，显示它本身是一个母体基因，从八细胞开 山东师范大学硕士学位论文 始合子基因开始表达，到了原肠作用开始的时候集中在迁移旺盛的g e r mr i n g 细胞中表达，到了体节发育开始在体节中特异性的表达，并逐步发展到血液中表 达，这与刺激血管生成的预测结论是符合的；另外我们还发现z a m o t l 2 的表达可 能与胚胎内的细胞迁移事件有关，通过显微注射和原位杂交试验结果显示，用针 对z a m l 2 上游非翻译区的反意核苷酸m