基因工程的基本操作程序 PPT课件.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。（既是概念，又是原理）,基因重组,1,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,2,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（3）人工合成,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,3,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,4,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,5,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,耐热的DNA聚合酶（Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,6,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,7,8,（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,9,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,10,2、表达载体的组成启动子终止子目的基因标记基因等,11,质粒,目的基因,限制酶,12,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,二、基因表达载体的构建,3.过程:,13,14,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌特点：（2）原理、过程,三、将目的基因导入受体细胞,双子叶植物,15,16,2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：,(三)将目的基因导入受体细胞,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,17,18,3、将目的基因导入微生物细胞,（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：Ca2+处理,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,19,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测(分子水平),鉴定（个体水平）,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因复制,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,病原体感染法(接种实验法),20,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,21,22,23,24,思考与探究,1、不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达。如通过CDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录。（2）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。（3）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。（4）有时需要目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光白基因等。,25,思考与探究,2、农杆菌中不同的菌株侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上酚类化合物，（也就是说单子叶植物不能合成酚类化合物）对于单子叶植物不同的种类，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可在侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导性）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,26,思考与探究,3、有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体复合体上加工完成的，内质网和高尔基体复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4、基本操作如下。（1）从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列（CDNA）（2）将CDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另入加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了珠蛋白基因的大肠杆菌收集菌体，破碎后从中提取珠蛋白。,27,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,28,2）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,29,3）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都