（微生物与生化药学专业论文）硫酸多粘菌素b菌种选育与发酵工艺的研究.pdf

摘要 硫酸多粘菌素b 菌种选育与发酵工艺的研究 摘要 硫酸多粘菌素b ( p o l y m y x i nbs u l f a t e ) 是一种由多粘类芽孢杆菌 ( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) 产生的氨基酸和脂肪组成的碱性琐环状多肽 抗生素，它对各种革兰阴性菌引发的疾病有显著的疗效。多年来，多 粘菌素b 一直依赖于进口，为改变该现状，本文对多粘菌素b 生产 菌的诱变育种及发酵生产进行了系统的研究，并取得了良好效果。 通过对培养基的优化，确定了可溶性淀粉和葡萄糖作为复合碳源 时以及( n i - h ) 2 s 0 4 和玉米浆作为复合氮源时，多粘菌素b 产量最高； 同时我们还考察了n a c l 、k h 2 p 0 4 、m g s 0 4 以及生长因子和前体对菌 体生长和多粘菌素b 产量的影响。然后对产量影响较大的四个因素即 可溶性淀粉、( n h 4 ) 2 s 0 4 、玉米浆和m g s 0 4 进行了响应面实验分析， 采用b o x b e h n k e n 实验设计，对发酵培养基进行优化，最终确定发酵 培养基配方为：可溶性淀粉3 3 3g l ，葡萄糖1 5g l ，玉米浆3 1 8 m l l ，( n h 4 ) 2 8 0 48 7g l ，n a c l0 6g l ，k h 2 p 0 4 0 8g l ，m g s 0 40 2 g l ，c a c 0 31 0 9 l ，p h 6 8 。通过发酵验证，多粘菌素b 的产量由 5 9 6 m g l 提高到8 0 4 8 2 m g l ，比优化前提高了3 5 1 。 同时，又对多粘菌素b 生产菌的发酵条件进行了优化，分别考察 了种龄、初始p h 值、接种量、温度、发酵时间、摇床转速等对多粘 菌素b 产量的影响，最终选择了对其产量影响较大的三个因素即初始 北京化工大学硕士学位论文 p h 值、发酵温度和发酵时间，采用b o x b e h n k e n 实验设计进行响应 面分析优化，确定了最佳发酵条件为：初始p h 值6 7 2 ，温度3 0 6 4 。c ， 发酵时间3 7 7 2 h 。在此条件下进行发酵验证，多粘菌素b 的产量可 由8 0 4 8 2m g l 提高到9 1 5 4 8 m g l ，比优化前提高了1 3 7 。 为了进一步提高产量，本文运用常压低温等离子体进行诱变以及 琼脂块扩散法进行筛选等手段进行菌种选育，从2 5 8 3 株诱变后的菌 株中获得了一株高产且遗传性能稳定的优良菌株。通过初始培养基进 行发酵生产，多粘菌素b 的产量可由5 9 6 m g l 提高到1 1 5 9 m g l ， 比出发菌株提高了9 4 5 。 为了验证高产菌株在优化后的培养基和培养条件下多粘菌素b 产量可以达到的最大值，我们将筛选到的高产菌株接入到优化后的培 养基中进行发酵，最终多粘菌素b 的平均产量可由5 9 6 m g l 提高到 1 3 4 1m g l ，比出发菌株提高了1 2 5 。 关键词：硫酸多粘菌素b ，发酵，多粘类芽孢杆菌，菌种诱变，常压 低温等离子体诱变 摘要 s t u d yo nb r e e d i n go fp o l y m y nb s u l f a t ep r o du c i n gs t r a i na n dt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s a b s t r a c t p o l y m y x i nbi s ac l a s so fa l k a l i n ec y c l i cp o l y p e p t i d ea n t i b i o t i c s p r o d u c e db yt h ep a e n i b a c i l l u sp o l y m y x aw h i c hi sc o m p o s e do fa m i n o a c i d sa n df a t i th a sas i g n i f i c a n te f f e c tf o rt h ed i s e a s ec a u s e db y g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a o v e rt h ey e a r s ，p o l y m y x i nbh a sb e e nd e p e n d e n t o ni m p o r t s i no r d e rt oc h a n g et h es t a t u sq u o ，i nt h i sp a p e r , t h eb r e e d i n g o fap o l y m y x i nbp r o d u c i n gs t r a i na n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r ec a r r i e do u ts y s t e m a t i c a l l y , a n dg o o dr e s u l t sw e r e a c h i e v e d f i r s tt h ec u l t u r em e d i u mw a so p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e h i 曲e s ty i e l dw a so b t a i n e dw h e ns o l u b l es t a r c ha n dg l u c o s ew e r eu s e da s c o m p l e xc a r b o ns o u r c e s ；t h eh i g h e s ty i e l dw a so b t a i n e dw h e n ( n h 4 ) 2 s 0 4 a n dc o ins y r u pw e r eu s e da sc o m p l e xn i t r o g e ns o u r c e s ；a tt h es a m et i m e w ea l s oi n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fn a c l ，k h 2 p 0 4a n dm g s 0 4o nc e l l i 北京化工大学硕士学位论文 g r o w t ha n dp o l y m y x i nbp r o d u c t i o n a f t e rt h a t ，w ei n v e s t i g a t e dt h ef o u r f a c t o r st h a th a v es i g n i f i c a n ti m p a c to nt h ey i e l do fp o l y m y x i nb ，t h a ti s ， s o l u b l es t a r c h ，( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 ，m g s 0 4 ，c o r ns y r u pb yt h ec o r r e s p o n d i n g e x p e r i m e n t a ls u r f a c ea n a l y s i s ，u s i n gb o x b e h n k e ne x p e r i m e n t a ld e s i g n ， o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m t h ef i n a l i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n f o r m u l ai s ：s o l u b l es t a r c h3 3 3 9 l ，g l u c o s el5 9 l ，c o r ns y r u p31 8m l l ， ( n h 4 ) 2 s 0 48 7g l ，n a c l0 6g l ，k h 2 p 0 40 8g l ，m g s 0 40 2g l ， c a c 0 310g m ，p h 6 8 t h r o u g hf e r m e n t a t i o nv e r i f i c a t i o n ，t h ep o l y m y x i n b p r o d u c t i o ni nt h en e wf e r m e n t a t i o nm e d i u mf o r m u l ar e a c h e dt o8 0 4 8 2 m g mf r o m5 9 6m g l ，w h i c hw a s3 5 1 h i g h e rt h a n t h a tb e f o r e o p t i m i z a t i o n t h e n ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rp o l y m y x i nbp r o d u c t i o nw e r e o p t i m i z e da n dt h e e f f e c t so fs e e da g e ，i n i t i a lp h ，i n o c u l u ms i z e ， t e m p e r a t u r e ，f e r m e n t a t i o nt i m e ，s h a k i n gs p e e d ，v e n t i l a t i o no np o l y m y x i n bp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d f i n a l l y , t h r e ef a c t o r sw h i c hh a do b v i o u s e f f e c to np o l y m y x i nbp r o d u c t i o nw e r es e l e c t e d ，n a m e l y , i n i t i a lp h ， f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ea n df e r m e n t a t i o nt i m e u s i n gb o x - b e h n k e n e x p e r i m e n t a ld e s i g no ft h ec o r r e s p o n d i n gs u r f a c ea n a l y s i s ，t h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d ：p h6 7 2 ，t e m p e r a t u r e3 0 6 4 。c ， f e r m e n t a t i o nt i m e3 7 7 2 h f e r m e n t a t i o nv e r i f i c a t i o ns h o w e dt 1 1 a t ，u n d e r t h e s ec o n d i t i o n st h ey i e l dc o u l dr e a c h9 1 5 4 8m g lw h i c hw a s1 3 7 h i g h e rt h a nt h a tb e f o r eo p t i m i z a t i o n i v 摘要 i no r d e rt oi n c r e a s et h ey i e l do fp o l y m y x i nb 如r t h 瓯w em u t a t e d p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a u s i n ga t m o s p h e r i cp r e s s u r ep l a s m a a f t e r s c r e e n i n gw i t ht h em e t h o do fa g a rb l o c kd i f f u s i o na n do t h e rm e a n s ，2 5 8 3 m u t a g e n e s i ss t r a i n sw e r ef i n a l l yo b t a i n e d t h ep o l y m y x i nby i e l do ft h e b e s ts t r a i ni nt h eo r i g i n a lc u l t u r em e d i u mc o u l dr e a c hu pt o115 9m g l w h i c hi n c r e a s e d9 4 5 t h a nt h a to ft h ew i l ds t r a i n ，a n di t sg e n e t i c s t a b i l i t yw a sf a v o r a b l e i no r d e rt ov e r i f yt h em a x i m u my i e l do fp o l y m y x i nbi nt h e h i g h - y i e l ds t r a i nw i t ht h eo p t i m i z e dm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n s ，w e i n c u b a t e dt h eh i g h y i e l ds t r a i n si nt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i u m ， a n df i n a l l yt h ey i e l do fp o l y m y x i nbc o u l dr e a c hu pt o13 41m g lf r o m 5 9 6m e , l ，w h i c hw a s12 5 h i g h e rt h a nt h a to ft h ew i l ds t r a i n k e y w o r d s ：s u l f a t ep o l y m y x i nb ，f e r m e n t a t i o n ，p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ，s t r a i nm u t a g e n e s i s ，a t m o s p h e r i cp r e s s u r ep l a s m a v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：i 目盗! 日期： 鲨坦：笪：3 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 导师签名： 日期：塑! 生q 一一 嘲立_ 争一 第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 硫酸多粘菌素b ( p o l y m y x i nbs u l f a t e ) ，又称硫酸粘杆菌素b ，国内药物名称为 多胜菌素乙，是多粘菌素b 的硫酸盐形式。多粘菌素b 是一种由多粘类芽孢杆菌 ( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) 产生的氨基酸和脂肪组成的碱性琐环状多肽抗生素，几乎对所 有革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀菌作用，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、 肺炎克雷伯杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等，尤其对绿脓杆菌有显著作用。 将其作为饲料添加剂【l - 2 】可刺激幼畜生长，增加饲料利用率，提高饲料报酬。还可预防 集约化饲养中常见的大肠杆菌和沙门氏杆菌引起的疾病，具有高效、低毒、在体内残 留少的特点，主要用于防治禽、畜的细菌性肠炎，世界上许多国家已批准该药作为饲 料添加剂使用。临床上【3 一 主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感 染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。 该产品自投放市场以来，因质量过关、市场信誉好而深受客户好评，市场前景广 阔，市场需求近几年来一直呈上升态势。我国于1 9 9 0 年代末开始研制生产多粘菌素b ， 目前国内仅有几家投入生产，且产量有限，主要依赖从日本等国进口来满足需求。而 且国内生产成本较高，产量较低。 为了提高多粘菌素b 的发酵产量，改进发酵方法，本文通过对多粘菌素b 的理化 性质、菌种的选育、培养基的优化以及发酵条件的优化等方面进行分析，以及在对多 粘菌素b 的发酵实验过程中，不断地对实验数据进行分析和研究，设计出一系列关于 多粘菌素b 发酵方法的改良，以提高发酵水平。 1 2 多粘菌素b 物理化学性质 多粘菌素b 常用其硫酸盐，为白色或类白色结晶性粉末，无臭、味苦，具有吸湿 性，易溶于水，不溶于酯、醚、酮、氯仿等有机溶剂【5 】。多粘菌素b 干燥品的化学性 质十分稳定且耐热，加热试验表明：1 0 0 9 天，4 0 6 0 天活力不减。硫酸多粘菌素 b 在米糠、豆饼、淀粉等辅料中4 存放，5 年活力不变；3 7 存放，活力最多只下 降5 左右。硫酸多粘菌素b 在p h 值为5 7 7 5 时的水溶液时相当稳定，室温放置 一周不影响效价，其在强酸及强碱中易于分解，能与苟三酮、双缩脲呈阳性反应【6 l 。 多粘菌素b 为碱性多肽类抗生素i t ，是一个具有1 0 个氨基酸的多肽，其中七个 氨基酸形成环状化舍物在n 端连接一个脂肪链。经研究表明，十个结构的“环”部分 在核磁共振的图谱下可以很好地迭合，而“尾部”则是散乱的。这说明多粘菌素b 的 “尾部 是柔性的，即在溶液中不存在固定构象h 】。 北京化工大学硕士学位论文 多粘菌素b 的分子式：c 5 6 h 9 8 n 1 6 0 1 3 h 2 s 0 4 分子量：1 3 0 1 5 6 比旋度：【o d - ：一5 6 3 。【c 2 15 水】 熔点：2 0 5 1 2 2 c 分子结构如图1 1 所示1 】： 1 3 多粘菌素的发展过程 多粘菌素是1 9 4 7 年从多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) 或产气孢子杆菌 阻a e r o b a l l u s ) 的培养滤液中得到的一种多肽类抗生素，含有a ，b ，c ，d ，e 五种成 分【1 2 - 13 1 。1 9 5 1 年，g e o f f r e ya i n s w o r t h 等人【1 4 】首次报道了一株气生型多粘类芽孢杆菌 ( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) ，并从该菌株的发酵液中分离得到了一种新型的水溶性碱性 抗生素多粘菌素，1 9 6 4 年时证实粘菌素即为硫酸多粘菌素，临床应用时多用其硫酸 盐或甲烷磺酸盐，该抗生素一直被认为是一种新型抗菌素。 2 0 世纪八十年代起，西方各主要国家对饲料用抗生素所引起的公共卫生问题日益 关注，并相继对在动物体中残留较大的抗生素发布禁用令。与此同时，硫酸多粘菌素 口服吸收小，具有良好的抗革兰氏阴性菌作用和抗内毒素作用，引起了畜牧兽医界的 注意。美国和欧盟均批准将其作为兽药使用，用于治疗肠道疾病，在日本还被用作饲 料添加剂。我国于1 9 8 6 年批准日本旭化成工业株式会社的产品进口，作为治疗药物 和饲料添加剂。1 9 8 8 年又批准日本明治制果株式会社的产品进口。我国于上世纪九十 年代末研制成功硫酸多粘菌素，近期硫酸多粘菌素被批准为国家二类新兽药，己进入 临床使用阶段。 2 第一章绪论 1 4 多粘菌素b 药理学的研究进展 1 4 1 抗茵机理及活性 多粘菌素b 对敏感菌的细胞膜具有强大的吸附作用。细胞膜磷脂中存在的游离磷 酸根具有很强的负电性，药物分子中带正电荷的游离氨基可与其结合，使细胞膜的表 面张力降低和通透性增加。最终导致细胞膜解聚，丧失生物活性，使菌体内氨基酸、 嘌呤、嘧啶和无机盐等外漏【1 5 - 1 8 。此外，多粘菌素b 还能影响核质和核糖体功能，导 致细菌死亡。多粘菌素b 对于繁殖期和静止期的敏感菌均可起到杀菌作用，被认为是 快速杀菌剂。由于革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分为粘肽而不是磷脂，因此多粘菌素 b 对革兰氏阳性菌无抗菌活性，而对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布氏杆菌、弧 菌、痢疾杆菌和绿脓杆菌等革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性，对绿脓杆菌和弧菌的杀 菌作用尤为强大【1 9 - 2 3 1 。 1 4 2 药物代谢动力学 多粘菌素b 体内分析方法主要有：微生物学方法、高效液相色谱法( h p l c ) 、酶 联免疫分析法、毛细管电泳法以及薄层层析法( t l c ) 等。但最为常用的h p l c 方法不 仅能分离生物体内多粘菌素b ，而且还能检测其含且【z 4 j 。 吸收：动物胃肠给药，多粘菌素b 吸收不良；粘膜表面、红肿表面或烧伤部位局 部给药也不吸收。兔子胃肠给药吸收很弱，但是初生牛和婴儿胃肠给药却能吸收。 分布：多粘菌素b 体内分布广泛，据报道瞄】小牛体内多粘菌素b 的分布容积( v s s ) 为( 1 0 2 _ + 0 2 9 ) l k g 。多粘菌素b 在机体组织中通常以结合状态的形式存在，药物进入 循环后，与血液中的成分( 如血细胞、血浆蛋白等) 形成结合型药物，而未被结合的 部分则称为游离态。 消除：多粘菌素b 主要通过肾脏排出，在肾功能不全或重复投用大剂量的情况下， 多粘菌素b 会在组织中蓄积。在头1 2 小时内由肾脏排泄少量多粘菌素b ，随后，由 此途径排出数量增多。关于多粘菌素b 清除方面的研究报道极少，目前也只处于观察 阶段 2 6 - 2 8 。 1 4 3 药物效应学 一些学者【2 9 - 3 川研究了硫酸多粘菌素b 和甲烷磺酸粘杆菌素拮抗铜绿假单胞菌的 离体药效学，包括最小抑菌浓度( m i c ) ，杀菌动力学和抗生素后效应( p a e ) 等方面的研 究。对于敏感性菌株，硫酸多粘菌素b 的最小抑制浓度为1 4m g l ，但是甲烷磺酸 粘杆菌素的m i c 相对较高，为4 一1 6m g l 。结合其他关于拮抗铜绿假单胞菌的实验， 硫酸多粘菌素b 的活性是甲烷磺酸粘杆菌素的2 - - 4 倍。 3 北京化工大学硕士学位论文 m o n t e r o 【3 1 】等研究表明多粘菌素b 与亚胺培南( i m i p e i l 锄) 、舒巴坦( s u l b a c t 锄) 、 妥布霉素( t o b r a 2 m y c i n ) 和利福平( r i f a m p i n ) 协同作用于肺炎，其抗菌作用相对较弱。但 是，对于治疗由多重耐药性病菌鲍氏不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rb a u ma n n i i ) 弓l 起的感染， 无论离体还是活体，多粘菌素b 都是非常有应用前景的一种药物。 1 4 4 毒理学 近期研究发现多粘菌素类的神经毒性较肾毒性相对少见。肾毒性和神经毒性为肠 外应用多粘菌素类最常见的毒性反应。f a l a g a s 3 2 - 3 3 】等进行了系统综述，指出最近多粘 菌素类肾毒性发生率和严重程度均低于其他类药物，近1 5 年没有多粘菌素类导致神 经肌接头阻滞或窒息等严重神经性作用的报道。 为评价国产多粘菌素b 。的安全性，一些学者【3 4 弼】还进行了急性毒性试验、小鼠骨 髓细胞的微核试验及精子畸形试验，为该药的毒理学评价提供了依据。结果表明，国 产多粘菌素b 属于低毒类化合物并且不具致突变作用。故此结果为该药在临床中的使 用安全性提供了参考依据。 1 4 5 多粘菌素b 对大肠杆菌的抗生素后效应 长期以来，对于抗菌类药物，人们只是根据体外最小抑菌浓度( m i c ) 和药动学参 数确定给药间隔时间和给药剂量。然而，体外m i c 的测定受诸多因素的影响，差异 很大。自从2 0 世纪7 0 年代明确提出抗生素后效应( p o s t a n t i b i o t i ce f f e c t ，p a e ) 这一概 念之后，很多学者开始对其进行了较为深入的研究。 抗生素后效应是指当抗生素与细菌接触一短暂时间后，即使药物的浓度逐渐降 低，低于m i c 或将药物完全去除后，仍然对幸存细菌的生长有持续抑制作用。几乎 所有的抗菌药物均有p a e 表现，不同药物对不同细菌其p a e 不同。近期一些学者【3 州 通过实验测定了多粘菌素b 对大肠杆菌不同菌株的p a e ，确定了药物作用时间及浓度 对p a e 的影响，为多粘菌素b 的应用提供了理论依据。 经过研究表呀，7 1 ，随着药物作用浓度的增加，p a e 也随之增加。当浓度达3 2m i c 时，p a e 值达峰值，但当浓度达6 4m i c 后，p a e 值大幅下降。这现象表明，可能 与高浓度导致的细菌耐药( 逆反效应) 有关，残存细菌的恢复生长较为迅速，细菌生 长增加1 个对数期时间缩短，故p a e 期缩短。有学者【3 8 】还注意到氨基糖苷类与b 内 酰胺类等杀菌剂在m i c 时对大部分敏感菌已能产生致死性损伤，p a e 反映的仅是对 耐药菌的作用。无论是哪种给药方式，体内浓度一般都达不到6 4m i c ，否则将会产 生极大的毒副作用。因此，多粘菌素b 素浓度在4 - 3 2m i c 时，p a e 时间与浓度呈 正相关，呈明显的直线相关，从p a e 的角度说明多粘菌素b 为浓度依赖性药物。 4 第一章绪论 1 5 多粘菌素b 的研究现状 1 5 1 多粘菌素b 的生产方法 多粘菌素b 一般采用发酵法进行生产【3 9 1 ，其生产菌为多粘类芽孢杆菌 ( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) 。该菌为好氧菌，其细胞呈直杆状，0 5 - - 2 5 1 t m x l 2 l o l 上m ， 常以成对或链状排列，具圆端。芽孢呈椭圆或卵圆形，能抗许多不良环境，每个细胞 产一个芽孢，生孢不被氧所抑制。该菌的一个重要优势是可以在很多便宜的培养基上 生长，如玉米浆，并且可以达到很高的生物量，容易进行高密度培养。 利用微生物发酵法生产多粘菌素b 成本低，生物学活性高的，且具有不受原料限 制；而且多粘菌素b 是胞外抗生素，分泌于发酵液中，分离过程相对简单，生产成本 低，理论上收率没有限制，分离过程比较简单，不存在手性问题等优点，适合大规模 工业生产，是目前最为常用的生产方法。 1 5 2 多粘菌素b 的合成机制 所有多粘菌素结构都带有分支，由一带环状的十肽与一脂肪酸通过肤键相连印】。 脂肪酸主要有( + ) - b 甲基辛酸( m o a ) 和异辛酸( i o a ) 两种，分别由异亮氨酸和缬氨酸合 成。在多粘菌素b 合成的细胞中，生物合成从酞基化二氨基丁酸盐中间代谢产物开始。 用l 2 4 二氨基丁酸( l - d a b ) 1 4 c 作示踪研究，发现标记化合物可接入多粘菌素b 内， 说明前者是多粘菌素b 的前体。 多粘菌素b 的合成与蛋白质的合成无多大关系。利用。苏氨酸1 4 c 的示踪试验发 现，氯霉素、放线霉素d 、嘌吟霉素抑制标记物掺入蛋白质中，而刺激多粘菌素b 的 形成，见表1 1 所示。所用抑制剂对蛋白质和多粘菌素b 的不同作用，说明多粘菌素 b 的合成并不是遵照蛋白质的样板机制进行的。 表i - i 某些抑制剂对1 4 c 标记苏氮酸掺入蛋白质和多粘菌素b 内的影响 t a b l e1 - 1e f f e c t so fc e r t a i ni n h i b i t o r sw i t ho i l1 4 ct a go np r o t e i na n dp o l y m y z i nb 5 北京化工大学硕士学位论文 1 5 3 多粘菌素b 的市场需求 随着多粘菌素b 在医药领域的广泛应用，而且具有较低的毒性及良好的抗菌活 力，这种产品在全世界的开发己成热潮。但由于肾毒性和神经毒性，多粘菌素b 的应 用受到限制，而被疗效好、毒性低的其他抗生素所取代1 4 1 1 。但是由于目前革兰氏阴性 菌耐药性的产生，多粘菌素b 又重新得到重视【4 2 1 ，然而该产品目前在我国的产量很小， 市场极不饱和，国内市场缺口较为严重。 日本首先实现发酵法生产多粘菌素b 的工业化生产【4 3 1 ，是世界上最早也是最主要 的多粘菌素b 生产国，其产量最高可达到2 0 9 l 。近几年我国企业也逐渐掌握了微 生物发酵以及提取法等先进技术，但是多粘菌素b 在国内的生产企业仍然是极为少数 的，而且国内还没有取得原料药生产批文的企业。使用多粘菌素b 生产制剂的企业较 多，例如：北京永光制药、福建省三明制药厂、上海第一生化药业等，制剂企业采用 的原料全部进口，因此，在我国加快开发生产这种市场前景极好的产品己成为当务之 急。 1 6 多粘菌素b 发酵工艺的研究 多粘菌素b 一般采用发酵方法生产，而提高发酵水平有三条途径：一是进行菌种 诱变并筛选优良菌株，二是采用与菌种生长以及最有利产物积累相匹配的最佳培养 基，三是对发酵过程中的各个条件参数进行有效的调控。菌种优化是建立在代谢控制 理论上的菌种选育技术，后面两种方法是建立在生化工程基础上的发酵过程控制技术 4 4 - 4 5 1 o 1 6 1 菌种的诱变及选育 在发酵过程中，生产菌的菌种质量是关键因素，其决定着多粘菌素b 开发和发展 的前途，如何改进菌种的选育方法，改善多粘菌素b 生产菌的质量成为日后研究的一 个重要分支。而诱变技术是应用诱变剂处理生物有机体以获得所需突变体的一种生物 手段。在当今发酵工业和其它生产单位所使用的高产菌株，大部分都是通过诱变技术 来提高其生产性能。一些传统的方法，如自发突变育种嗣、诱变育种【4 刀、原生质体融 合【4 8 - s o l 和基于基因工程技术 5 1 - 5 3 1 的育种方法等，自发突变效率低，进展慢；原生质体 融合和基因工程技术育种，对技术和设备要求较高，过程复杂，费用较大，且成功率 较低。 实验室常用的诱变方法通常可分为物理诱变和化学诱变两大类：物理诱变主要是 各种射线如x 、p 、丫、中子以及紫外线等。化学诱变包括能引起细胞变异的各种化学 药剂，常用的有甲基磺酸乙酯( e m s ) 、甲基磺酸甲酯( m m s ) 、叠氮化钠( n a n 2 ) 、乙烯 6 第一章绪论 亚胺( e i ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 等。 无论是物理诱变所用的各种辐射源还是化学诱变药剂，大部分对人体都有致癌、 致突变和致畸等远期效应，同时这些传统的理化诱变剂在其制备、运输、存储及实验 操作等实际应用中存在诸多不便。因此寻找一种安全有效的诱变剂对于诱变技术的应 用就显得特别重要。 1 6 1 1 传统育种方法 根据多粘菌素b 的生物合成特点，可在对多粘菌素b 生产菌筛选过程中采用诱变 与定向筛选相结合的方式，即根据多粘菌素b 生物合成途径的调控机制和本身的分子 结构特点使用重金属离子和氨基酸结构类似物进行筛选，获得高产菌株。 最为常用的方法是紫外诱变与化学诱变，曾有学者 s 4 5 5 1 以多粘类芽胞杆菌 ( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) 为出发菌株，采用紫外线诱变，并以重金属c u 2 + 作为筛选因 子，获得一株遗传稳定且多粘菌素b 发酵产量比出发菌株提高4 5 的菌株。对该菌 株再采用亚硝基胍( n t g ) 诱变，以缬氨酸结构类似物a - 氨基丁酸作为筛选因子时得到 一株产量提高3 4 的菌株。 诱变育种方法简便有效，至今仍是工业微生物育种的重要手段，但一般都需要对 很大数量的菌株进行筛选方能奏效。这种育种方式近来年在理论与技术上都有新的发 展，但如何提高效率，减少盲目性，仍是当前的重要问题。同时在研究中也发现不能 用一种筛选方案重复使用，否则筛选效率会急剧下降，甚至不起作用，这可能与抗生 素的生物合成受多基因调控有关。 在笔者尝试使用了紫外诱变和亚硝基胍( n t g ) 诱变方法后发现，其产量提高率并 不高，而且操作繁琐，不易控制，最为重要的是上述两种方法都有较高的危险性和毒 性，对身体有较大的伤害。因此，采用更为简便、安全、高效的诱变方法，是今后诱 变育种的新趋势，也是简化操作和保障科研人员安全的重要方法。本文使用一种设备 简单且安全无污染的新型物理诱变方法一常压低温气体放电等离子体诱变育种法。 1 6 1 2 常压低温等离子体育种技术 常压低温气体放电等离子体是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在 常压( 1 a t i n ) 下产生温度在2 5 - - 4 0 之间的、具有高活性粒子( 如处于激发态的氦原子、 氧原子、氮原子、o h 、自由基等) 浓度的等离子体射流。科学研究表明，等离子体 中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁膜的结构及通透性改变， 并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产 生致畸突变。 目前常压低温气体放电等离子体技术已广泛用于污染物的分析鉴别，废气、废液 7 北京化工大学硕士学位论文 和废渣的处理等。近几年来，有报道认为低温等离子体对微生物具有杀灭作用，可以 用于特殊材料的消毒灭菌。而且还有些报道说明等离子体对生物体不但具有杀灭效 应，还具有积极的生物学效应但目前对低温等离子体的生物学效应研究还处于探索 阶段。l a r o u s s ip o j 等首次发现在电阻阻挡放电等离子体灭菌的过程中，经等离子体照 射后的e c o l i 对几种底物( l 岩藻糖、d 山梨醇和d 半乳糖醛酸) 的利用比对照组有显 著的提高。后来y i n t 5 7 1 等报道了经磁化弧光等离子体处理过的番茄种子的产量提高了 2 0 7 。y u s s 等在利用介质阻挡放电等离子体杀灭酵母的过程中发现，酵母线粒体琥 珀酸脱氢酶的活性提高。 与传统诱变方法相比，采用常压低温等离子体能够有效造成d n a 多样性的损伤， 突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变菌株；与分子操作手段相比，常压低温等 离子体在密闭的放电室中产生，断电后消失，无任何残留物，其发生装置简单，易于 操作，在进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程 等优点。常压低温等离子体育种机( a t m o s p h e r i c p r e s s u r ep l a s m ab r e e d i n gs y s t e m ， a p p b s ) 对单一菌种或混合菌种的诱变育种均适用，对人体无副作用，对环境无污染， 是一种高效、绿色、环保的新一代基于物理化学因子耦合强化作用的微生物育种新技 术。 1 6 1 3 常压低温等离子体诱变育种设备 清华大学工程物理系等离子体健康科学研究组与化学工程系生物化工研究所联 合研制开发了新型常压低温等离子体育种机，该育种机采用1 3 5 6m h z 射频电源驱 动，其主要工作参数范围见表1 2 所示： 、 表1 - 2 常压低温等离子体育种机工作参数 t a b l e1 - 2t h ew o r k i n gp a r a m e t e r so f a t m o s p h e r i c - p r e s s u r ep l a s m ab r e e d i n gs y s t e m 第一章绪论 图1 4 新型常压低温等离子体育种机 f i g 1 2a t m o s p h e r i c - p r e s s u r ep l a s m ab r 嘣l i n gs y s t e m ，a p p b s 圈1 - 2 为常压低温等离子体育种机( a t m o s p h e r i c - p r e s s u r ep l a s m ab r e w i n gs y s t e m ， a p p b s ) ，是清华大学工程物理系等离子体健康科学研究组与化学工程系环境生物技 术实验室联合研制开发的新型常压低温等离子体育种机 61 4 常压低温等离子体诱变机理 采用氮气为工作气体的常压低温等离子体源的发射光谱如图1 3 所示，从中可以 看到该等离子体源中含有多种化学活性粒子成分，如o h “2 + ，u ：0 一f ，u “ 3 0 6 - 3 1 0m n ) 、氮分子二正系统( 一兀。一矿0 、氮分子一负系统( 矿+ 。一恐0 ，激 发态氨原子、氢原子和氧原子等。如图1 - 4 所示，等离子体中的这些化学活性粒子能 够使d n a 等遗传物质的分子结构发生改变，从而使得微生物基因重组、产生变异成 为可能。 北京化工大学硕士学位论文 波长( n 搬) 图l - 3 常压低温等离子体发射光谱图 f i g 1 - 3t h ee m i s s i o ns p e c l l u mo fa t m o s p h e r i c - p r e s s u r ep l a s m a q - 离子体对d n a 撅伤 f 心 釉图 确 辛o 。一 图l - 4 等离子体对d n a 损伤示意图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cd i a g r a mo f p l a s m ao nd n ad a m a g e 1 6 1 5 常压低温等离子体诱变育种的优势 目前已有多种微生物诱变育种方法，与这些方法相比，新型常压低温等离子体微 生物诱变育种在仪器操作、安全性及成本上均具有独特的优势，见表1 3 所示： 1 0 争掣七 第一章绪论 表l - 3 常压低温等离子体诱变与其他诱变方法的比较 t a b l e1 - 3a t m o s p h e r i c p r e s s u r ep l a s m ab r e e d i n gc o m p a r ew i t ho t h e r s 在以上文献和实验基础上，本文采用大气压介质阻挡放电冷等离子体对野生多粘 类芽孢杆菌进行诱变，经等离子体反复诱变和筛选，最终获得了一株高产多粘菌素b 的优良突变菌株，并通过发酵验证了它们的遗传稳定性，在第五章中详述。 1 6 1 6 筛选方法 初筛的方法主要采用平板琼脂块扩散法【5 9 柳】，平板琼脂块扩散法，又称圆筒平板 法( c y l i n d e rp l a t em e t h o d ) 。用于测定抗生素效价的生物学定量方法之一。标准的方法 是以2 0 毫升的琼脂培养基放入培养皿内做成平面，上面加上预先培养的试验标准菌 种，即掺入了大肠杆菌的琼脂4 毫升，而使之凝固，即做成供试菌平板表面。 由生产菌在平板上发育形成单菌落的过程中，会分泌出多粘菌素b 并会全部积累 在独立的琼脂块中，然后将琼脂块移至供试菌平板表面，在3 0 - 3 2 培养2 0 一3 0 小时。 则其中的多粘菌素b 会不断的向平板四周扩散，由于琼脂块周围产生浓度梯度，大肠 北京化工大学硕士学位论文 杆菌的繁殖被阻止于有效浓度范围之内而形成圆形的透明带，即形成抑菌圈。根据抑 菌圈的直径，可初步判断该单菌落产多粘菌素b 的强弱。其直径d 与多粘菌素b 浓度 c 之间的关系如式1 1 所示： d = k l o g l o c + a ( k 、a 为常数) ( 式l 1 ) 与标准多粘菌素b 液相比较，可求得多粘菌素b 浓度。此外还有使用圆形滤纸代 替，使被检液渗入的滤纸法。该方法可以省去工作量大、操作复杂的摇瓶初筛等步骤， 从而提高筛选效率。 复筛则采用摇瓶发酵，并通过h p l c 进行精确测量，确定高产菌株，具体方法在 第二章中详述。 1 6 2 培养基的优化 碳源的影响：选用葡萄糖、可溶性淀粉等碳源进行发酵实验，结果发现不同碳源 对菌体浓度影响较大。在单独使用葡萄糖作为碳源时，菌丝生长迅速，1 6 h 菌浓即可 达到1 8 以上，但由于葡萄糖浓度高，菌丝生长太快，造成产量下降。用可溶性淀粉、 玉米粉作为碳源时，由于葡萄糖含量低，菌丝生长很慢，菌浓达到1 8 时较使用葡萄 糖慢6 小时以上。 氮源的影响：以葡萄糖为碳源，其他培养条件不变，分别选用麦胚粉及其与蛋白 胨、硫酸铵组成的复合氮源进行试验，实验结果表明，蛋白胨有利于菌体生长，促进 多粘菌素b 的合成，硫酸铵在发酵过程中利用迅速是主要的氮源，随着氨的被利用， 导致发酵液的p h 下降，可能对产物的生成不利，所以必须在发酵培养基中加入其它 氮源。 碳氮比的影响：采用葡萄糖为碳源，与不同量的蛋白胨配制成不同碳氮比的培养 基进行实验，比较不同碳氮比对多粘菌素b 产量的影响。若碳氮比增大，则氮源不足， 影响菌体生长状况，进而影响多粘菌素b 合成；碳氮比减小时，氮源过量，菌体生长 过于旺盛，不利于产物积累1 6 2 删。 文献中【6 5 】采用正交实验对多粘类芽孢杆菌的培养基进行优化，通过统计学分析， 确定发酵培养基：玉米淀粉( 需液化) 1