（预防兽医学专业论文）h5亚型禽流感病毒抗体快速检测试纸条的研制.pdf

l 华中农业大学学位论文独剑性声明及使只，y = i7 9 9 8 2 8 f r l l l l l l l l r i l ij u l j l ij 1 1 11 1 1 1 r l l t j l l l l l l 学 奇论文 乃 如需保密，解密时阀年月 日 是否保密 。 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的材辩，指导教师对此避行了审定与我一圊工作的隧志对本研究所做的任 何贾献均巴在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：盂虞场 时闻：劬lo 年6 月7 日 学位论文使用授权书 本入完全了解华中农业大学关予保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印捌本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阕览鬏务，可以采用影印、缩印或扫描等复翩手段保存j 编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不圊方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 、 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商盟秘密或申请专利等潜在餐要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 猁槲张蜘黟摊名： 勿础 恻。每6 月7 日 瓤秒二p 年月7 日 注：请将本表直接装订龟学位论文的癣页和目录之间 h 5 亚型禽流感病毒抗体快速检测试纸条的研制 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 缩略语( a b b r e v i o n ) 5 1 文献综述6 l 文献综述。7 1 1 禽流感7 1 2 禽流感的病原学7 1 2 1 禽流感病毒的形态7 1 2 2 禽流感病毒的结构7 1 2 3 禽流感病毒的理化特性一8 1 2 4 禽流感病毒的分类9 1 3禽流感病毒血凝素h a 蛋白9 1 3 1h a 蛋白的三维结构9 1 3 2h a 蛋白的变异性1 0 1 3 3h a 在致病机理中的作用1 1 1 4 禽流感的流行病学1 1 1 4 1 发病季节1 1 1 4 2 传染源1 l 1 4 3 传播途径1 2 1 4 4 易感动物1 2 1 5 禽流感检测方法的研究进展1 2 1 5 1 禽流感病毒的分离与鉴定1 3 1 5 2 禽流感血清学检测技术1 3 1 5 3 分子生物学检测技术1 4 1 5 4 胶体金免疫层析方法1 5 2 研究目的与意义。1 6 3 材料与方法l7 3 1 材料。l7 3 1 1 质粒与载体l7 3 1 2 试剂与试纸条材料。1 7 3 1 3 溶液的配制1 7 3 2 实验方法2 0 3 2 1 禽流感病毒血凝素基因原核表达载体的构建2 0 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 2 2 禽流感病毒血凝素蛋白的表达与纯化2 5 3 2 3 胶体金的制备与鉴定2 7 3 2 4 试纸条检测体系的组成2 9 3 2 5 试纸条各种条件的筛选3 0 3 2 6 试纸条制备材料的处理31 3 2 7 试纸条的性能测定3 2 3 2 8h 5 亚型禽流感病毒抗体快速诊断试剂盒的组装及初步应用3 2 4 实验结果3 4 4 1p c r 扩增结果3 4 4 2 克隆载体的构建和鉴定3 4 4 3 表达载体的构建和鉴定3 5 4 4 诱导表达及纯化后分析3 6 4 5 最佳p h 值的确定3 7 4 6 胶体金标记抗鸡i g gf c 单克隆抗体最适标记量的确定3 8 4 7 试纸条各种条件的筛选3 8 4 8 试纸条性能的测定3 9 4 8 1 特异性试验一3 9 4 8 2 灵敏度试验3 9 4 8 3 重复性和保存期试验4 l 4 9 临床检测结果4 1 5 讨论z i ：1 5 1 蛋白最佳表达条件的确立4 2 5 2 包涵体的纯化与保存4 3 5 3 包被蛋白的要求4 4 5 4 两种血凝素融合蛋白制备的试纸条的比较4 4 5 5h 5 亚型禽流感抗体定性快速检测试剂盒的摸索4 4 6 结论。4 5 参考文献4 6 致 射5 2 建立禽流感h 5 抗体胶体金免疫层析快速检测方法 捅要 禽流感( a v i a ni n f l u e n z a ，a i ) 是由a 型流感病毒( a v i a ni n f l u e n z av i r u s 触v ) 引起禽类的呼吸系统、消化系统甚至全身性败血性病变的急性高度致死性传染 病。近年来，由于造成了人类的感染和死亡，引起了人们的高度重视。 我国现阶段采用疫苗进行免疫预防以控制禽流感的流行。虽然有琼脂扩散、 血凝抑制试验等方法对鸡群的免疫水平进行监测，但难以达到在现场进行即时的 快速检测的目的。因此，建立禽流感病毒抗体的快速检测方法具有非常重要的意 义。现有研究表明，禽流感病毒的血凝素蛋白h a 是诱导动物机体产生中和抗 体的主要免疫原，组成h a 球状头部的h a l 肽链含有与相应抗体特异性结合的 抗原决定簇，h a l 蛋白可以作为抗原用于舢抗体的检测。 本研究主要采用间接法胶体金免疫层析技术，利用原核表达的禽流感血凝素 融合蛋白，建立了禽流感h 5 型病毒抗体胶体金免疫层析快速检测方法，取得了 如下研究结果： 1 禽流感血凝素基因片段h a l 的原核表达及蛋白纯化 将p k g h a l 和p k g h a l d s p 的表达质粒分别在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中 进行表达，经s d s p a g e 分析，表达的融合蛋白均在包涵体内表达，纯化出重 组蛋白的分子量约为6 2k d a 。w e s t e r n b l o t 结果显示重组蛋白均具有较好的免疫 学活性。 2 h 5 亚型禽流感病毒抗体快速检测试纸条的研制 柠檬酸三钠还原法制备2 0n l l l 的胶体金，用1 0m g m l 鼠抗鸡i g gf c 段单 克隆抗体标记，标记的最佳p h 为8 o ，最适标记量为7 肛g m l 。用纯化的禽流感 病毒h 5 血凝素g s t h a l 或g s t h a l d s p 融合蛋白及兔抗鼠i g g 分别作为检 测线和质控线包被于n c 膜上，以金标鼠抗鸡i g gf c 单克隆抗体作为示踪物， 成功地建立了h 5 亚型禽流感病毒抗体胶体金免疫层析快速检测方法。试验证明 该试纸条与禽流感h 5 亚型标准阳性血清反应后，检测线出现明显的红色条带， 而该试纸条与生理盐水( 空白) 、s p f 鸡阴性血清、禽流感h 9 亚型、标准鸡新 城疫病毒( n d v ) 、鸡传染性法氏囊病毒( i b d v ) 、鸡传染性支气管炎病毒( i b v ) 、 鸡毒霉形体( m g ) 等阳性血清反应后，检测线不出现红色条带，说明本试纸条 的特异性强，灵敏度高。并对试剂盒的重复性、稳定性和保存期进行了摸索，确 定本实验研制的试剂盒重复性好、稳定性强。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 3 h 5 亚型禽流感病毒抗体快速检测试纸条的初步应用 从湖北新洲和京山鸡场送检的2 6 0 份鸡血清样品分别用血凝抑制试验( h i ) 和本实验研制的禽流感h 5 亚型病毒抗体快速检测试纸条同时检测，检测结果为： 用h i 法检测到2 3 2 份阳性血清，检出率为8 9 2 ( 2 3 2 2 6 0 ) ；本实验利用g s t h a l 蛋白研制的快速检测试纸条共检测到2 2 5 份阳性样品，检出率为8 6 5 ( 2 2 5 2 6 0 ) ，二者符合率为9 6 9 8 ( 2 2 5 2 3 2 ) ；用g s t h a l d s p 蛋白制备的快 速检测试纸条共检测到2 2 2 份阳性样品，检出率为8 5 4 ( 2 2 2 2 6 0 ) ，与h i 法 的符合率为9 5 6 8 ( 2 2 2 2 3 2 ) 。这表明两种蛋白研制的试纸条检测结果差别很小； 本实验研制的禽流感h 5 抗体胶体金快速检测试纸条与h i 法的符合率很高。 关键词：禽流感病毒；血凝素蛋白；胶体金；快速检测；试纸条 2 建立禽流感h 5 抗体胶体金免疫层析快速检测方法 a b s t r a c t a v i a ni n f l u e n z a ( a di sah i g h l yf a t a li n f e c t i o u sd i s e a s ec a u s e db ya v i a n i n f l u e n z av i r u s ( a i v ) s e r o t y p ea i ti sa l s oas e v e r ei n f e c t i o u sd i s e a s e sm a i n l y i n d u c e dr e s p i r a t o r yd i s e a s e ，d i g e s t i v ed i s e a s e s ，a n dr e p r o d u c t i v es y s t e m r e c e n t l y , v a r i a n ts t r a i n so fa v i a ni n f l u e n z av i r u sc a ni n f e c th u m a nb e i n g sa n dc a u s ed i s e a s e e v e nd e a t h ，w h i c hb e c o m eat h r e a tf o rh u m a n sa n dr a i s eg r e a tp u b l i ch e a l t hc o n c e r n a tp r e s e n ti n a c t i v a t e dv i r u sw e r ee f f e c t i v e l yu s e dt oc o n t r o lt h eo u t b r e a ko fa i a n di t se p i d e m i ci nc h i n a , b u tt h e r ew a san e wc h a l l e n g eo fh o wt od e t e r m i n et h e l e v e lo fi m m u n i t ya n de v a l u a t et h ei m m u n es i t u a t i o n h e n c e ，i tw a se s s e n t i a l l yt o e s t a b l i s ham e t h o dt or a p i dd e t e c tt h ea n t i b o d yt i t e ro fi m m u n i z e dc h i c k e n i tw a sw e l l k n o w nt h a tt h eh e m a g g l u t i n i n ( h a ) p r o t e i nw a st h em o s ti m p o r t a n ta n t i g e no fa i v a n dc a nb eu s e dt oi n d u c en e u t r a l i z a t i o na n t i b o d y h a lw a st h em a i nt h ec o m p o s eo f h ah e a ds t r u c t u r ec o n t a i n se p i t o p e s ，h a lc a nb eu s e dt od e t e c tt h ea n t i b o d yt i t e ro f a i v t h i sr e s e a r c hf o c u s e do nd e v e l o p i n ga n de v a l u a t i n gam e t h o df o rr a p i dd e t e c t i o n o fa n t i b o d yt i t e ro fh 5s u b t y p eo fa r c , w h i c hw a sb a s e do na ni n d i r e c tm e t h o do f c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u e t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 t h ee x p r e s s i o no fa i v h e m a g g l u t i n i ng e n ef r a g m e n ta n di t sp u r i f i c a t i o n r r e c o m b i n a n tp l a s m i dp k g - h a1a n dp k g - h a1 - d s pw e r et r a n s f o r m e di n t o e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 、r e s p e c t i v e l y t h ep u r i t yo fr e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r ea n a l y z e db y s d s - p a g ea f t e rt h ef u s i o np r o t e i n sw e r ee x p r e s s e da n dp u r i f i e df r o mi n c l u s i o n b o d i e s t h er e s u l ts h o w st h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r ea b o u t6 2k d a t h er e s u l t o fw e s t e r nb l o t t i n gd e m o n s t r a t e st h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i n sh a v ei m m u n o l o g i c r e a c t i v i t y 2 d e v e l o p m e n ta n dp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no fi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i p s f o rr a p i dd e t e c t i o no fa n t i b o d ya g a i n s th 5 s u b t y p ea i v u s i n gt r i s o d i u m c i t r a t er e d u c t i o nm e t h o dt op r e p a r e2 0 n mc o l l o i d a l g o l d p a r t i c l e sa n dt h e nu s i n gm o u s ea g a i n s tc h i c k e ni g gf cm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) t a gi t ，t h eo p t i m a ll a b e lc o n d i t i o nw a se s t a b l i s h e di nw h i c ht h ep hf o rl a b e l i n gm c a b i s8 0 ，a n dt h em o u n to fm c a bi s7p g m l c o l l o i d a lg o l dc o n j u g a t ew e r eu s e da st h e d e t e c t o rr e a g e n t , t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n so fh a lo rs i g n a lp e p t i d er e m o v e dh a l ， 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 w h i c hw e r ep u r i f i e dw i t ha f f i n i t yp u r i f i c a t i o na n dr a b b i ti g ga g a i n s tm o u s ew e r e i m m o b i l i z e do nt h en i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e 勰t e s tl i n ea n dc o n t r o ll i n e ，r e s p e c t i v e l y , t od e v e l o pt w ok i n d so f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a yf o rr a p i dd e t e c t i o no fa i v a n t i b o d y t h er e s u ko ft h es p e c i f i c i t ys h o w st h a tt h es t r i pw e r ep o s i t i v ew i t hs t a n d a r d p o s i t i v e s e r u n lo fa i vh 5a n d n e g a t i v e t o p o s i t i v e s e l r i m so fa i v h 9 n d v i b d v i b v m g ，s e r u mf r o ms p fc h i c k e n i nc o n c l u s i o n , as p e c i f i c i t y , s e n s i t i v i t y a n d r e p e a t a b i l i t yi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i c s t r i p w a se s t a b l i s h e d s u c c e s s f u l l y 3 d e v e l o p m e n ta n dp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no fi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i p s f o rr a p i dd e t e c t i o no fa n t i b o d ya g a i n s th 5s u b t y p ea i v 2 6 0s e r u ms a m p l e sc o l l e c t e df r o mj i n g s h a na n dx i n z h o uh e b e i ，w h i c hw e r e d e t e c t e dw i t hh im e t h o dt h ee x p e r i m e n tw i t ht h ed e v e l o p m e n to fs u b t y p eh 5a v i a n i n f l u e n z av i r u sa n t i b o d i e st e s ts t r i p t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eh i m e t h o dd e t e c t e dp o s i t i v e2 3 2s e r u m , t h ed e t e c t i o nr a t ew a s8 9 2 ( 2 3 2 2 6 0 ) ； g s t - h a1p r o t e i ni nt h ed e v e l o p m e n to fr a p i dd e t e c t i o nt e s ts t r i pw e r ed e t e c t e d2 2 5 p o s i t i v es a m p l e s ，t h ed e t e c t i o nr a t ew a s8 6 5 ( 2 2 5 2 6 0 ) ，b o t hc o m p l i a n c er a t ew a s 9 6 9 8 ( 2 2 5 2 3 2 ) g s t - h a l 一d s pp r o t e i ni nt h er a p i dt e s ts t r i pw a sp r e p a r e db ya t o t a lo f2 2 2p o s i t i v es a m p l e sd e t e c t e d , t h ed e t e c t i o nr a t ew a s8 5 4 ( 2 2 2 2 6 0 ) ， c o n s i s t e n tw i t ht h eh im e t h o dw a s9 5 6 8 ( 2 2 2 2 3 2 ) t h i si n d i c a t e st h a tt h et w o p r o t e i n sd e v e l o p e dl i t t l ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h es t r i pt e s tr e s u l t s ；a v i a ni n f l u e n z ah 5 a n t i b o d i e sd e v e l o p e dr a p i dd e t e c t i o no fc o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i pm e t h o dc o n s i s t e n t w i t ht h eh i g hr a t eo fh i k e y w o r d s ：a v i a ni n f l u e n z av i r u s ；h e m a g g l u t i n i np r o t e i n ；c o l l o i d a lg o l d ；r a p i d d e t e c t i o n ；s 仃i p 4 c m d d h 2 0 d n a g g i c a g s t h h a h i i b ( i b d i g g i p t g k d l l b m c a b m g n u n m l n c m n d 衄 p b s p e g p v p s e c l x l c e n t i m e t e r d o u b l ed i s t i l l e dh 2 0 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d g r a m c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o - g r a p h y a s s a y g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e h o u r h e m a g g l u t i n a t i o na s s a y h e m a g g l u t i n a t i o ni n h i b i t i o n i n f e c t i o u sb r o n c h i t i s ( v i r u s ) i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s e i m s ) i m m u n o g l o b i _ t l i ng i s o p r o p y l t h i o b d g a l a c t o s i d e k i l o d a l t o n l i t e r l u r i a b e r t t a n im e d i u m m o n o c l o n a la n t i b o d y m y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m m i n u t e m i l l i l i t e r n i t r o c e l l d o s em e m b r a n e n e w c a s t l ed i s e a s e ( v i r u s ) n a n o m e t e r p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y e t h y e n eg l y c o l p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e s e c o n d m i c r o l i t e r 厘米 双蒸水 脱氧核糖核酸 克 胶体金免疫层析技术 谷胱甘肽s 转移酶 小时 血凝试验 血凝抑制试验 传染性支气管炎( 病毒) 鸡传染性法氏囊( 病毒) 免疫球蛋白g 异丙基硫代b d 半乳 糖苷 千道尔顿 升 l b 培养基 单克隆抗体 鸡毒霉形体 分钟 毫升 硝酸纤维素膜 新城疫( 病毒) 纳米 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 秒 微升 5 建立禽流感h 5 抗体胶体金免疫层析快速检测方法 1 文献综述 1 1 禽流感 禽流感，又称真性鸡瘟，是由a 型流感病毒( a v i a ni n f l u e n z av i r u s ，灿v ) 引 起禽类的一种急性高度接触性的烈性传染病，可呈无症状感染、不同程度的呼吸 道症状、生产率下降，以至引起头冠和肉髯呈紫黑色、呼吸困难、下痢、腺胃乳 头和肌胃角质膜下等器官组织广泛性出血、胰腺坏死、纤维素性腹膜炎和1 0 0 死亡率的急性败血症。由于野禽作为流感病毒天然贮毒库的作用( w e b s t e re ta l 1 9 7 8 ；h i n s h a we ta 1 ，1 9 7 9 ；o l s e ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，以及已证实流感病毒可以由禽类 直接感染人( 郭元吉等，1 9 9 9 ；p e i r i se ta 1 ，1 9 9 9 ；c a m e r o ne ta l ，2 0 0 0 ；a l e x a n d e r , 2 0 0 0 ；p e i r i se ta 1 ，2 0 0 1 ) ，引起人类的发病和死亡，所以该病具有重要的公共卫 生意义( h a r v e ye ta ，2 0 0 4 ) 。 1 2 禽流感的病原学 1 2 1 禽流感病毒的形态 禽流感的病原为禽流感病毒，属于正粘病毒科流感病毒属的a 型流感病毒。 病毒的形态多样，呈球形、杆状或长丝状，典型的病毒粒子呈球形( 图1 1 ) 。 病毒粒子在分离初直径8 0n m 1 2 0r i m , 平均1 0 0n n l 。由于选择压力作用的结果， 实验室培养中球状结构占主体。不时地也有细丝状的形式在培养中出现，经过鸡 胚或细胞培养物连续传代后主要变为球型( 高福，1 9 9 9 ) 。流感病毒的多型性是 一种遗传特性，在病毒遗传学研究中可以作为一种遗传标志。 1 2 2 禽流感病毒的结构 禽流感病毒粒子的组成成分包括7 0 0 0 , - , 7 5 的蛋白质，2 0 - 2 4 的脂质， o 8 1 1 的r n a 和5 8 的碳水化合物( c a l n e k ，1 9 9 9 ) 。脂质位于病毒的 膜内，主要成分为磷脂，还有少量的糖脂和胆固醇。碳水化合物在病毒粒子中主 要以糖脂或糖蛋白的形式存在。病毒蛋白及潜在的糖基化位点是病毒基因组特异 的，但病毒膜的糖蛋白或糖类链的脂质和碳水化合物链的成分，是由宿主细胞确 定的。病毒囊膜上镶嵌着两种重要的纤突，呈放射状突出于囊膜表面，是重要的 功能蛋白质。这两种纤突分别为棒状的三聚体血凝素( h e m a g g l u t i n i n , h a ) 和蘑 菇状的四聚体神经氨酸酶( n e u m m i n i d a s e ，n a ) ( 图1 2 ) 。血凝素可以使病毒 吸附于生物细胞的受体上，使其感染；神经氨酸酶可破坏细胞受体，使病毒在宿 主体内自由传播。它们都是一种糖蛋白多聚体，构成主要的跨膜蛋白。这些表面 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 糖蛋白抗原的特异性决定了病毒的亚型。目前，已分离到的a i v 有1 6 种特异的 h a 抗原和9 种特异的n a 抗原( o i e ，2 0 0 4 ；f o u c h i e r e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 禽流感病毒的基因组属于负链单股r n a ( - s r n a ) 病毒。基因组是分节段 的，由8 个( a 型与b 型) 或7 个( c 型) 片段组成，总长约1 0 1 3 6k b 。各 片段长度在8 9 0 - 2 3 4 0 个核苷酸范围内( 图1 2 ) 。 餐i i 触妒 _ l “鲻缎黢缎蚴 徵滋硷滋汹 图1 - 1 禽流感病毒粒子的电镜图图l - 2 禽流感病毒的结构模式图 f i g 1 - 1t h ee l e c t r o n o g r a p ho fa i v v i r i o n f i g 1 - 2t h e s t r u c t u r eo fa i v 1 2 3 禽流感病毒的理化特性 禽流感病毒在4 0 2 0 可以凝集人、猴、豚鼠、犬、貂、大鼠、蛙、鸡和 禽类的红细胞，这是病毒的h a 蛋白与红细胞表面的糖蛋白受体相结合的结果， 但这种凝集可由病毒的n a 蛋白对红细胞受体的破坏而解除。 禽流感病毒是囊膜病毒，并对脂溶剂比较敏感，主要有三个特性：一是其 对外界环境抵抗力较强，有怕热不怕冷的特点，在o 的环境中能存活3 0d ，在 2 2 的环境中能存活4d ，5 6 的环境中能存活3 0r a i n ，而6 0 的环境中1 0 m i n 即可灭活。粪便中病毒受有机物的保护极大地增加了抗灭活能力，在4 条件下 可以保持长达3 0d 5 0d ，2 0 时为7d ；在羽毛中能存活1 8d 。此外，禽流感病 毒可以在自然环境中，其是凉爽和潮湿的条件下，病毒可存活数十周；在冷冻的 禽肉和骨髓中可存活1 0 个月( 吴红专等，1 9 9 8 ) 。二是耐酸对碱敏感，禽流感病 毒在p h4 0 的条件下还具有一定的抵抗力。三是对阳光敏感，病毒裸露在阳光 下4 0h - 一4 8h 即可灭活。由此可见，禽流感病毒没有超常的稳定性，对病毒本身 的灭活并不困难，可在加热、非等渗、极端的p h 和干燥的条件下将其失活。 8 建立禽流感h 5 抗体胶体金免疫层析快速检测方法 1 2 4 禽流感病毒的分类 根据致病性大小不同可以把a i v 分为三大类：一类为高致病性禽流感病毒 ( h i g h l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a ，i - i p a i v ) ：如h 5 、h 7 亚型，这类病毒致病 的潜伏期短，传播快，发病急，发病率高，死亡率高，感染的鸡群常常“全 军覆没 。h p a i 已被世界动物卫生组织( o m ) 列为a 类烈性传染病( 甘孟侯， 2 0 0 2 ) 。一类为低致病性禽流感病毒( 1 0 wp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a , l p a i v ) ： 如h 1 n 1 、h 4 n 2 、h 9 n 2 、h 9 n 3 ，这类病毒致病潜伏期长，传播慢，病程长， 发病率和死亡率低，可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降， 出现零星死亡。另一类为非致病性禽流感病毒禽流感病毒( n o n p a t h o g e n i ca v i a n i n f l u e n z a ，n p a ) ：不引起任何症状，但可以从感染动物血清中检出相应的 抗体。 1 3 禽流感病毒血凝素h a 蛋白 1 3 1h a 蛋白的三维结构 利用x 线晶体衍射技术证实，流感病毒的h a 蛋白以三聚体( t r i m e r ) 的形 式存在于双层类脂膜上，即由3 个非共价结合的h a 蛋白单体所组成，长约1 3 5 l l i i ( 1 3 5 a ) 。h a 蛋白三聚体可分为呈杆状的基底部及呈球状的头部两部分， 基底部长约7 6 衄( 7 6 a ) ，纤细杆状，由h a 2 部分和部分h a l 片段组成，与 囊膜相连。头部较膨大，主要是由h a l 肽链组成，含有受体结合位点和抗原决 定簇。a i v 识别宿主细胞的能力是由h a 受体结合位点的结构决定的( v o g e l ， 1 9 9 8 ) 。位于h a 蛋白头部的禽流感病毒的受体结合部位呈浅口袋状。受体结合 部位的氨基酸组成在不同亚型病毒h a 蛋白中高度保守。h a 蛋白头部有5 个抗 原位点，分别为a 、b 、c 、d 和e ( f e n n e re ta 1 ，1 9 8 7 ；p h i l p o o te ta 1 1 9 8 9 ) 。 利用单抗可以测得h a 蛋白只有a 、b 两个位点具有血凝性( 图1 3 ) ，而其它 3 个位点( c 、d 和e ) 无血凝性。构成a i v 囊膜纤突的主要蛋白是h a ，它也 是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原，病毒的变异、毒力和宿主特异性主 要由h a 决定。h a 的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因( w i l e y e t a l ， 1 9 8 7 ) 。一个复制周期中h a 核苷酸的变异率可达2 9 , m 。很多实验证明，不同 亚型禽流感病毒同时感染同一宿主时，病毒基因组可发生节段变换，从而产生由 新的基因组组成的新病毒株，它们的抗原性和致病性也随之发生较大的变化( 吴 仁蔚，2 0 0 4 ) 。 决定禽流感病毒有无感染性的先决条件是h a 分子水解为h a l 和h a 2 两条 多肽链。各亚型病毒h a 蛋白裂解位点的氨基酸组成不同，而另外一些病毒的 h a 蛋白，特别是禽流感病毒h a 蛋白的裂解位点则有数个碱性氨基酸。禽流感 9 华中农业大学2 0 10 届硕士学位论文 病毒的致病力是各基因产物共同作用的结果，但其中起最重要作用的是h a 切割 位点的氨基酸序列。h a 易于切割，则毒株的致病性较高。反之，则致病力较低。 研究还发现，影响流感病毒毒力的另一个重要因素是h a 上的糖基化位点 ( w a l k e re ta 1 1 9 9 3 ；m a t r o s o v i c he ta 1 ，1 9 9 9 ) 。如果h a 的切割位点插入宿主细 胞的多肽序列，蛋白酶对切割位点的敏感性大大提高，病毒的毒力也相应增强 ( p e r d u ee ta 1 1 9 9 5 ) 。h a 切割位点附近的空间构型发生变化，也影响病毒的 致病性( p e r d u ee ta 1 ，2 0 0 0 ；s u a r z ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 s i t eb 容易发生基因 般的r n a 病 和致病性很大 酸酶。这两种 抗原漂移和抗 建立禽流感h 5 抗体胶体金免疫层析快速检测方法 抗原漂移是由编码h a 和或n a 蛋白的基因发生点突变引起的，是在免疫 群体中筛选变异体的反应，是h a 和或n a 的次要抗原变化，属于量变，它可 引起中小型流行和致病性更强病毒的出现。 抗原转变是当细胞感染两种不同禽流感病毒时，病毒基因组片段的特性允许 发生片段重组，从而引起突变。可能产生2 5 6 种遗传学上不同的毒力各异的子代 病毒，是h a 和或n a 的主要抗原变化，变异幅度大，属于质变，会引起大型 流行。 1 3 3h a 在致病机理中的作用 禽流感病毒要具有侵染性，必须经过两个过程：第一阶段为宿主蛋白酶将 h a 裂解为h a l 和h a 2 ，暴露融合肽段，才能通主细胞而启动感染，这个裂解 过程是由宿主蛋白酶来完成的( r o t t ，1 9 9 2 ) ；第过受体介导的胞吞作用进入宿 二阶段为裂解后的h a 2 暴露出疏水区并与宿主细胞膜脂双层相互结合。禽流感 病毒h a 裂解为h a l 和h a 2 是其致病的重要因素，在病毒入侵细胞及决定病毒 致病力方面起着关键作用( k a w a o k ae ta 1 ，1 9 8 8 ) 。低致病力禽流感病毒在h a 裂解位点上只有一个或两个碱性氨基酸精氨酸，这种结构只能被存在于呼吸 道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解，因此，低致病力禽流感病毒感染 一般只在呼吸道和消化道内局部繁殖。而高致病力禽流感病毒在h a 裂解位点具 有多个碱性氨基酸( w o o de ta 1 ，1 9 9 3 ；s e n n ee ta 1 ，1 9 9 6 ；陈化兰等，1 9 9 9 ) ，可 被机体大多数组织细胞内的蛋白酶识别并裂解，具有广泛的嗜细胞性，所以一旦 高致病力禽流感病毒进入机体就会迅速全身扩散，导致全身多个组织发病并死 亡。 1 4 禽流感的流行病学 1 4 1 发病季节 禽流感一年四季均可发生，多爆发于气候变化剧烈的冬春季节，尤其是秋冬 交界、冬春交界气候变化大的时间，刮风对于此病的传播也有促进作用，原因之 一是刮风对鸡群的应激大，造成鸡群抗病力降低，之二是刮风有利于病毒扩散传 播。 1 4 2 传染源 禽流感的自然感染过程复杂，传染来源较多( l v o v , 1 9 7 8 ；h i n s h a we ta 1 ，1 9 8 1 ； a l e x a n d e r , 1 9 9 9 ；a l e x a n d e r , 2 0 0 1 ；e s f a ，2 0 0 5 ) 。一是来自其他种类的家禽，如鸭、 鹅。二是来自野外野生鸟类。家禽流感的暴发，野生鸟类的传播被认为是最有可 能的感染来源。特别是迁徙性的水禽带毒、排毒非常普遍。三是来自其他动物。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 有证据表明，火鸡的流感可能为猪源的流感病毒所致。从鸟类中分出的病毒也有 感染其他动物尤其是哺乳动物的潜在能力。 据介绍，再次感染和传播也经常发生。病毒通过病禽的分泌物、排泄物( 特 别是粪便) 和尸体等污染饲料、饮水及其他物体，通过直接接触和间接接触发生 感染，呼吸道和消化道是