（生物化学与分子生物学专业论文）中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究.pdf

中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 论文题目：中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：朱瑞敏 指导教师：徐安龙教授 摘要 文昌鱼在进化上具有重要地位，为揭示免疫系统的起源和进化以及低等生物 的免疫系统的研究提供了一个很好的模型。肽聚糖识别蛋白( p g r p ) 是肽聚糖识 别蛋白是存在于昆虫、软体动物、棘皮动物、脊椎动物中的重要天然免疫分子，都 具有一个或两个的肽聚糖识别的结构域，在进化上是保守的，跟噬菌体的t 7 溶菌 酶具有同源性。昆虫有1 9 个p g r p ，分为长型和短型，起到识别、信号传导和效应 分子的作用，如活化昆虫中的t o l l 通路和i m d 通路引起下游抗菌肽的表达。哺乳 动物有4 个p g r p ，都是分泌型的，非跨膜分子，与t l r 识别并引起的细胞免疫通路 无很大的关系，而是直接识别细菌和行使着效应分子的功能其中p g l y r p - 2 行使 酰氨酶的功能，而p 6 l y r p - 1 、p 6 l y r p - 3 、p g l y r p _ 4 则可以通过与细菌细胞壁的相 互作用来起到杀菌的功能，但是直接杀菌的活性仍然在研究中。因此低等和高等 的生物类群中该蛋白的功能差异性较大，但对于该基因家族功能的进化并不是很 清楚。本文对文昌鱼肽聚糖识别蛋白进行了克隆表达、细胞定位和初步功能研究， 为肽聚糖识别蛋白功能进化提供了线索。 本论文构建了中国文昌鱼p 6 r p l 、2 、3 真核转染载体，并将其转染到哺乳动 物细胞中进行定位，对其细胞表达定位进行了分析，在转染了p e g f p n 1 一p 6 r p l 融合表达载体的h e l a 细胞中，其绿色荧光都分布在细胞核的一极，而转染 p e g f p n 1 一p 6 r p 2 、p e g f p - n 1 - p g r p 3 融合表达载体的h e l a 细胞中，绿色荧光没 有很集中且特异的细胞定位，在细胞核与细胞质中均匀弥散地分布。因此并没有 为这三个蛋白在信号通路作用方面提供明显指示性的信息。 本论文在大肠杆菌表达系统中，分别表达和纯化了中国文昌鱼p 6 e x - i 烈3 r p l 、 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 2 、3 融合蛋白和p t r x - p g r p l 融合蛋白，并对这些蛋白的功能进行了研究。本文 通过检测表达菌菌液的0 d 值、检测菌液上清中核酸物质含量以及用电镜观察表 达菌的细胞壁情况等方法，发现了中国文昌鱼p g e x - p g r p l 、p t r x p g r p l 和 p g e x - p g r p 3 融合蛋白具有不同程度的从大肠杆菌内部破坏细菌细胞壁的能力； 通过抑菌圈和测细菌生长曲线等体外实验发现，中国文昌鱼p g r p 并没有特别明 显的直接杀菌或者抑制细菌生长的功能；通过高效液相色谱、质谱等分析手段， 发现了p t r x - p g r p l 融合蛋白对金黄色葡萄球菌来源的p g n 具有切割能力，同时 也可以增强金黄色葡萄球菌来源的p g n 的水解。 本论文还探索了b a c - t o - b a c 杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达出中国 文昌鱼肽聚糖识别蛋白( p g r p 2 ) ，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。 总之，通过对三个中国文昌鱼p g r p 的细胞定位、原核表达及功能研究，为 肽聚糖识别蛋白的功能进化提供了一定的线索。同时在昆虫表达系统中表达出中 国文昌鱼p 6 r p 2 ，也为进一步进行功能蛋白的研究奠定了基础。 另外，本文对中国文昌鱼p g r p l 具有切割p g n 的酶活的活性机制和作用位点 是否与高等动物相似仍需进一步探讨。另外，因为缺乏培养文昌鱼细胞的能力， p g r p 在文昌鱼细胞中是否具有像昆虫中信号通路识别分子功能尚未确定。 关键词：文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能进化 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 t i t l e ：f u n c t i o n a ls t u d yo np g i 灌f a m i l yo fc h i n e s ea m p h i o x u s m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：r u i m i nz h u s u p e r v i s o r ：a n l o n gx u ，p r o f e s s o r a b s t r a c t t h ea m p h i o x u sh a sa ni m p o r t a n ts t a t u si nt h ee v o l u t i o n ，f r o mw h i c h w ec a nk n o wh o wt h ei m m u n es y s t e me v o l v e s p e p t i d o g l y c a nr e c o g n i t i o n p r o t e i n s ( p g r p s ) a r ei n n a t ei m u n em o l e c u l e sp r e s e n ti ni n s e c t s ，m o ll u s k s ， e c h i n o d e r m s ，a n dv e r t e b r a t e s t h e i rf u n c t i o n ，w h i c hf r o mi n s e c t st o m a m m a l ，h a v eb i g g e rd i f f e r e n c e s i n s e c t sh a v eu pt o1 9p g r p s ，w h i c h a c t i v a t et h et o l lo ri b t ds i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y m a m m a l sh a v ef o u r p g r p s ，p g l y r p 一2h y d r o l y z e sb a c t e r i a lp e p t i d o g l y c a na n dr e d u c e si t s i n f l a m m a t o r ya c t i v i t y t h et h r e er e m a i n i n gm a m m a l i a np g r p sp r o t e i n sk i l l b a c t e r i ab y i n t e r a c t i n gw i t h c e llw a llp g n i no r d e rt o s t u d yt h e f u n c t i o n a le v o l u t i o no fp g r p s ，w ee x p r e s s e dt h ea m p h i o x u sp g r p sa n d s t u d i e dt h e i rf u n c t i o n s a t f i r s t ，w ec o n s t r u c t e da m p h i o x u sp g r p se u k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o r s ，u s e dt h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i nr e p o r t e ds y s t e mt oa n a l y s e t h ec e l ll o c a t i o n t h ep g r p is e e m e dt oc l u s t e ra to n e p o l en e a rt h en u c l e a r ， w h i l et h ep g r p 2a n dp g r p 3l o c a l i z e di nb o t ht h en u c l e u sa n dc y t o p l a s m s h o w i n gad i f f u s ee x p r e s s i o np a t t e r n t h ec e l ll o c a t i o n so fp g r ph a v en o t g i v e nu si n t e r e s t i n gh i n ta b o u tt h e i rf u n c t i o n s a n dt h e n ，w ep r o d u c e dp g r p si ne c o li b yu s i n gt h ep g e x g s t e x p r e s s i o ns y s t e ma n dp e t t r xe x p r e s s i o ns y s t e m w ef o u n dt h a tt h e p r o t e i n s ( p g r p i 、3 ) c o u l dd e s t r o yt h ec e l lw a l lo fe c o l if r o mi n s i d e t h r o u g he x a m i n i n gt h en u c l e i ca c i di nb a c t e r i as u p e r n a t a n ta n do b s e r v i n g m - 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 t h eb a c t e r i ac e l lw a l lb ye l e c t r o nm i c r o s c o p e w ea l s of o u n dp g r p lw o u l d h a v et h ea b i l i t yo fc u t t i n gt h ep g n ( f r o ms a u r e u s ) a n dh e l p i n gp 6 n h y d r o l y s i s ，w h i c hs t u d i e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n d l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y b u tw eh a v en o tf o u n dt h a tt h e p r g p sh a v et h ea b i l i t yo fk i l l i n gb a c t e r i a ld i r e c t l y i no r d e rt os t u d y t h ep g r p sf u n c t i o nm o r e ，w et r i e dt ou s eb a c t o b a cb a c u l o v i r u se x p r e s s i o n s y s t e mt oe x p r e s st h ea m p h i o x u sp g r p 2i ns f 9c e l l s i nc o n c l u s i o n ，t h es t u d yo nf u n c t i o n so fa m p h i o x u sp g r p sg a v eu sm o r e e v o l u t i o ni n f o r m a t i o n w ec o u l dt e n t a t i v e l yc o n c l u d et h a tt h ea m p h i o x u s p g r p sh a v ea c t i v i e s c l o s e dt op g r p si nm a m m a l i no r d e rt os t u d ym o r e f u n c t i o n s ，p r o d u c i n gp g r p sf r o mi n s e c te x p r e s s i o ns y s t e mo ro t h e rm a m m a l e x p r e s s i o ns y s t e mm a yb en e e d e d k e yw o r d s ：a m p h i o x u s p g r pf u n c t i o ne v o l u t i o n 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 蝴j 渺7 刚乒蜀 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密的学位论文在解密后使用本规定。 导师签名 墨翌：。鼍年月了圜 中山大学硕士论文中国文昌鱼肷聚糖识别蛋白功能研究 1 1 文昌鱼概况 第一章概述 文昌鱼早在五亿多年前就已经出现，至今仍保持古代的特性及原始性状，被 认为是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，也可以说文昌鱼是脊椎动物始祖 的现存代表。文昌鱼独特的进化地位，吸引了众多生物学家的目光，被认为是研 究动物进化和动物胚胎发育的典型材料。文昌鱼最早是由德国人p s p a l l a s 于 1 7 7 8 年在英国的c o r n w a l l 发现并记载的。1 8 3 4 年，意大利人o g c o s t a 误将 触须认作鳃，命名为b r a n c h i o s t o m a ( 鳃口类) 。1 8 3 6 英国人w i l lj a m y a r r e l l 以 其形态命名为a m p h i o x u sl a n c e o l a t u s ( 尖鱼) 。 达尔文指出文昌鱼的发现是一个伟大的发现，使人们看到了5 亿年前脊椎动 物的原始祖先的模样，文昌鱼“是指示脊椎动物起源的钥匙一。黑格尔则将文昌 鱼放在其“个体发育重演系统发育理论的中心位置，认为“在所有未灭绝动物 中，唯有文昌鱼能使我们勾画出志留纪最早的脊椎动物祖先。从p a l l a s 记述 文昌鱼的2 0 0 多年以来，各国学者共发表了近3 0 0 0 篇学术论文研究文昌鱼的生 态、生理、解剖、组织和胚胎发育等方面的问题。特别是2 0 世纪6 0 年代以后， 随着文昌鱼室内产卵技术的成熟、电子显微技术和分子生物学技术的飞速发展， 再次掀起了对文昌鱼研究的新高潮。 文昌鱼( a m p h i o x u s ) 属于脊索动物门，是头索动物亚门的代表动物。其形态 上具有脊椎动物的一些特征，例如具有脊索和位于脊索背部的神经管，具有鳃裂 和体节，胚胎发育时消化管与神经管相通形成神经肠管等。但是和脊椎动物相比， 文昌鱼没有头部，只有脑泡，具有脊椎动物所没有的围鳃腔，其分泌器官为原肾， 和环节动物相似。一直以来，文昌鱼被认为是现存的和脊椎动物亲缘关系最近的 无脊椎动物，也代表了脊椎动物祖先的模型，研究文昌鱼胚胎发育对于探讨脊 中山大学硕士论文巾国文昌鱼肷聚糖识别暇自功能研究 椎动物的起源具有重要意义。尽管最近静研究表骧，文昌鱼和尾索动物海鞘的进 化地位并不符合之前一直流行的理论嘲，但是文昌鱼处于物种进化中的重要地位 是不容质疑的，文昌鱼代表了由无脊椎动物到脊椎动物的过渡类型。 1 王1 分布 文昌鱼目前所知共有2 9 个种，广泛分布在热带、亚热带的8 - 一1 6 米的近岸浅 水海域中，特别在北纬4 8 。至南纬4 0 。之闻的环形地区，如欧洲大西洋沿岸、地 中海北岸、东部佛罗里达州沿岸以及我国的青岛、厦门、湛江和北海沿岸。目前 研究得比较多的文昌鱼有美国佛罗里达州的b r a n c h i o s t o m af l o r i d a e ，欧洲的 b r a n c h j o s o m a a n c e o a t u m , 我圜的自氏文昌鱼( 产自厦门，b r a n c h i o s t o 蠕a b e c h e r i ) 和日本文昌鱼( 产自青岛，b r a n c h j o s t o m a j a p o n i c u m ) 。本文的研究 对象就是该物种，称为中国文昌鱼。其他如地中海、马来西贬、日本、北美洲海 洋边庠都有出产，但产量并不多，故视为珍品涵。 1 1 2 生活习性 文昌鱼对自然生态环境的要求十分严格和苛刻，所以在世界分布范围有限。 它要求海水透明度较高，水质洁净，有一定的酸碱度和盐度，水深在5 - 1 0 米。它 最适盐度为1 4 2 9 ，如果栖患地有大量淡水流入，文昌鱼就会因压力膨胀成 新月形而死亡。它要求酸碱度在8 i - 8 2 之间。另外，文吕鱼最适宜的水温是 1 2 - 3 0 5 摄氏度。文昌鱼只能生活在有很多粗沙和少量细沙的地方。假如粗沙少、 细沙多，便不会看到它们的踪影。原因是泥质地( 细沙中带有淤泥) 比较硬，文昌 鱼钴不进去，另外细沙还会阻碍它的呼吸。 文昌鱼不善游泳，栖息于浅海疏松的沙滩里。它经常把身体的大部分埋在沙 里，仅有前半截身体露在沙癸，自天半截身体躲在沙砾之中，依赖水流带来浮游 生物及硅、藻植物供它吃食；到了晚间才是它活跃的时刻，它离开沙窝，弹射到 水面活动，一星遇到惊扰，又游圈沙滩窝内。文昌鱼游泳时以螺旋形方式前进。 文昌鱼一年产卵3 , - - - 4 次，产卵时间在6 7 月，雌雄异体，生殖细胞成熟后， 从墨鳃腔中排到体外，在海水中受精发育，受精郛细胞分裂，很快地成为被有纤 毛的幼体，沉人海底，发生变态，3 个月以后发育为成体。文昌鱼发育1 1 个月 2 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 后即开始成熟，但在外形上雌、雄性并无明显区别，只是在生殖腺的颜色上略可 分辨；精巢呈乳白色，卵巢呈柠檬色h 1 。 1 1 3 成体生理结构 文昌鱼属于脊索动物门，头索动物亚门，是脊椎动物的“姐妹群 ( s i s t e r g r o u p ) 。其成体体长3 - 6 厘米，雌雄异体，身体橙黄到粉红色，半透明，形态结 构简单但与寒武纪早期脊椎动物化石海口虫( h a i k o u e l l a ) 高度相似( 如图1 - 1 ) 。 文昌鱼没有脊椎动物的骨质脊柱，取而代之是一条贯穿全身的作为身体支柱的背 部脊索，由柔软而有弹性的结缔组织组成，外由脊索鞘包裹，脊索在低等脊索动 物中终生存在，但在高等脊索动物即脊椎动物中仅出现在胚胎期，成年后被骨质 脊柱替代。在脊索的背部是背神经管，包含了文昌鱼的中枢神经背神经。背 神经的前端略微膨大一些，对应于脊椎动物的脑部但远为简单，故称为脑泡。除 脑泡外，前端还有眼点，能够感光。 文昌鱼它个体不大，象鱼又象虫，它还没有从躯干里分化出一个独立的头颅。 它没有脊柱，只是有了脊柱的雏型脊索。代替骨质骨骼的，便是这条纵贯全身、成 为文昌鱼身体支柱的脊索。文昌鱼的中枢神经是一条长的管状物，位于脊索下面， 故名背神经管。背神经管的前端略微大些，可认为是脑，但很不明显。而在脊椎动 物身上，这条背神经管巳经完全进化成大脑和脊髓了。然而，比较于无脊椎动物， 这种既没有脊椎又没有大脑的头索动物，毕竟往前发展了一步。 文昌鱼体表由单层表皮细胞组成，外为粘液所覆盖，背部形成背鳍，后端还 有尾鳍、肛鳍，但这些鳍只是一层皮膜物，并非脊椎动物的骨质鳍。身体两侧表 皮之下交替长有5 5 - 6 5 个半透明的v 字形肌节。身体前端下方为口腔，口腔外有 约4 0 根口须，方便觅食。口腔后端为咽，咽两侧有垂直腮裂，腮裂在胚胎期只 有8 对，之后逐步增加到1 8 0 对。文昌鱼的腮裂和脊椎动物不同，不直接开口于 体表，而是被表皮和肌肉包裹，形成“围腮腔，最后开孔于身体后端肛门之前 的“围腮腔孔 。咽部之后是消化道，直通肛门，消化道右侧连有肝盲囊，是脊 椎动物肝的前身。消化道和体表表皮之间形成一空腔，称为体腔。性腺位于“围 腮腔 内侧表皮上，左右各一排，性成熟时卵子和精子由“围腮腔孔一排出。文 昌鱼没有特化的心脏，只有一根能够搏动的腹心管，也没有特化的耳朵、鼻子等 感觉器官。而排泄器官和原口动物相似，为原肾。总的来说，文昌鱼结构简单， 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别鬣自功能研究 身体不完全对称，但是它与原始脊椎动物高度相似，而且终身保有脊椎动物的三 大特征一一脊索、背神经管和咽鳃裂，因此与脊椎动物有很近的亲缘关系。 圈卜l 寒武纪脊索动物化“海口虫h a i k o u e i i a ( a ) 和文吕鱼( b ) f ig 1 - 1d i a g r a mo ft h ec a m b r i a nc h o r d a t ef o s s i lh a i k o u e l l a ( a ) a n da m p h i o x u s ( b ) ( p h a r y n g e a ld e n t i c l e s ) 。n e r v ec o r d ，神经管；n o t o c h o r d ，脊索；b o d y - l a l im u s c l e s ，体壁肌肉； i n t e s t i n e ，肠；o r a lc i r r i ，融须；p h a r y n g e a lg i l ls l i t s ，嚼鳐裂；g o n a d ，生殖艨；a t r i a lc a v i t y ， 围鳃腔；a t r i o p o r e ，围鳃腔孔；a n u s ，肛门。 1 。1 4 进化地位 在分类学和进化上，科学家门把一类生物统称为后口动物，主要是兰个群体， 棘皮动物门、半索动物门和脊索动物门。普遍认为这三个群体来源与一个生存于 5 5 亿年前的共同祖先。在之后的进化过程中，脊索动物门又再次分化成了三个 各自独立的类群：尾索动物亚门( 主要代表为海鞘) ，头索动物亚门( 主要代表 为文吕鱼) 和我们熟悉的脊椎动物亚门。前两个亚门属于低等脊索动物，统称为 原索动物，原索动物是介于脊椎动物和无脊椎动物之闻的过渡类型。它既保留了 无脊椎动物的一些特征，又具有脊椎动物的特点。文昌鱼作为代表类型，在形态 上不仅保留了其特有的原始特征，也有与脊椎动物有相似的地方。 堇1 5 文昌鱼近年的研究热点 4 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 近年来，对文昌鱼的研究主要集中在基因组研究、发育调控基因的系统发生 和功能研究、免疫系统相关基因的研究3 个方面。文昌鱼在形态结构和身体复杂 程度上和脊椎动物更为相似，其基因组的组成形式也与之非常相似，而又简单得 多，是人类基因组的1 7 ；是尾索动物海鞘基因组的三倍，在进化过程中保留了大 量属于脊索动物祖先的性状。相反，尽管尾索动物和脊椎动物动物的亲缘关系更 近，而且发育和生理上某些方面也明显表现得和脊椎动物更相似，然而鉴于其特 化的形态结构和生活习性我们认为尾索动物实际上已经丢失脊索动物的许多祖 先性状。从基因组的水平来说，文昌鱼的基因组没有经历大规模基因丢失、大规 模复制和其它重大改变，各类基因的平均进化速度也适中，因此可被认为很好的 保留了大量脊索动物祖先基因组的特征。因此，研究文昌鱼的进化、发育生物学、 遗传学、基因组学等方面，有助于解答进化生物学中两个最激动人心的问题，这 就是脊索动物是如何从其共同的后口动物的祖先进化产生的，以及脊椎动物又是 如何从简单的脊索动物进化而来的。 目前，基因倍增的研究成为研究的热点。基因倍增是指基因通过自我复制增 加其在基因组中的拷贝数，普遍认为基因倍增或是整个基因组的倍增可以在自然 选择过程中积累大量的突变，导致新的结构和发育机制的出现。现在普遍的观点 是从脊椎动物起源到形成高等脊椎动物的进化过程中可能经历了两次的基因组 复制以及一些独立的基因倍增，第一次大约发生在脊椎动物起源时，与文昌鱼分 支之后，另外一次发生在有颌类与无颌类分支之后眨8 】。 近年来，文昌鱼基因组中的一部分基因家族被用于系统的进化分析，其中包 括h o x 和m h c 等，研究结果表明文昌鱼的这些基因的结构都保留了脊椎动物基因原 始的排列状况口j 1 。发育学一直以来就是文昌鱼研究的重点，c o n k l i n 、h o l l a n d 等人对此最了较多的研究。文昌鱼的胚胎发育从受精卵开始，经历囊胚、原肠胚、 神经胚和幼体等发育阶段。早期胚胎发育类似于棘皮动物，后期类似于脊椎动物。 前后轴、背腹轴和左右轴的建立的分子机制是发育生物学家所感兴趣的啼1 。 对于文昌鱼免疫系统的研究使得文昌鱼受到了国内外科学家们越来越多的 关注，已成为了文昌鱼研究和免疫学起源研究的热点。早期的研究由于受到材料 与方法的限制，人们对文昌鱼免疫系统的了解甚少。例如，孙晓阳等利用亲和层 析法分离出文昌鱼体液和体表的凝聚素阳1 ；张红卫等对文昌鱼超微结构的系统观 巾瘤大学顼| 圭 幺文孛嚣文墨盏默聚糖识别蛋幺凄缝研究 察证明文昌鱼具有两类免疫细胞：粒细胞和巨嗜细胞。张士璀等在文昌鱼中发现 了节胶动物中起着重要免疫作用的酚氧化酶班嬲。c a n n o n 等人发现了文昌鱼中 具有含免疫球蛋自可变区的蛋自粥盼，揭示在缺乏体液免疫的原索动文昌鱼中可 能已经存在脊椎动物体液免疫的分子基础n 3 1 。 本实验室近年来通过大规模构建c d n a 文库，获得了多个中国文吕鱼的e s t 序 列，其中包括了大量与脊椎动物中免疫相关的基因的同源序列，并对其中的一些 作了功能的注释，成为国内外具有影响力的文吕鱼研究团队。随着近年来文昌鱼 的基因全长组图谱渐渐地在我们面前打开，我们对文昌鱼及其基因组会有更全面 的了解，将会帮劲我们解开许多对于入类来说是十分关键的问题。 本实验室颜庆瑜等采用5 r a c e 和3 r a c e 的方法从中国文昌鱼e 脯a 一链中 成功雩寻到3 个p g r p 的全长序列。经过基因的同源比对，发现中国文昌鱼的三个p g r p 与多种物种都有具有很高的相似性，为研究该基因家族的演化过程提供了重要线 索。在基因组水平上，通过基因组p c r 的方法成功克隆出3 个p g r p 的基因组内 含子序列和上下游的非翻译区序列。为该基因家族的基因组演化和表达调控方式 提供了参考。通过s o u t h e r n 杂交确定了中国文昌鱼p g r p l 的拷贝数不止一个， 这些拷贝数的变化可能反映了在文鍪鱼这一物种中薪的基因功能的产生。通过实 时定量p c r 的方法，发现三个p g r p 基因在革兰氏阳性和阴性的细菌感染后都有 不同程度的上调表达，尤其是在阳性菌的感染后。提示这三个分子跟细菌的急性 感染有直接的关系。同时也发现了三个基因具有不同的组织分稚模式。通过构建 体外原核表达载体，从大肠杆菌b l 2 1 中成功表达出了中国文吕鱼p g r p i 与t r x 的融合蛋白。通过p g n 结合实验发现该蛋白与两种类型的p g n 都能结合，e l i s a 方法发现对l y s 型的p g n 亲和力更高一些，为我们做进一步的功能研究提供了重 要线索。 1 2 天然免疫识别与肽聚糖p g n 虽然有许多特征用于区分天然免疫与适应性免疫，但是识别入侵者的方式无 疑是主要标准。1 9 8 9 年，c h a r l e sj a n e w a y 提出了模式识剐的概念( p a t t e r n 6 中山太学碗论立中目文昌鱼肚聚糖m 爿蛋白功妮研究 r c o g n i t i o n ) ，这一模型已经成为了研究天然免疫的最流行的一个。天然免疫 分子识别微生物依赖于识别微生物上特有的分子，而这些是不存在于高等真核细 胞中的。这些分子被称为病原体相关分子模式( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n sp k m p s ) 。例如，革兰氏阴性细菌上独有的脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e l p s ) 、细菌都有的肽聚糖( p e p t i d o g l y c a np g n ) 、细菌鞭毛上的鞭毛蛋白 ( f l a g e l l i n ) 、革兰氏阳性菌独有的脂磷壁酸( 1 i p o t e i c h o i ca c i dl t a ) 、非 甲基化的c p g 以及真菌的酵母多糖( z y m o s a n ) 等等。天然免疫通过在进化中保守 的一系列模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，p r r ，o rp a t t e r n r e c o g n i t i o nm o l e c u l e p r m ) 识别微生物的保守分子模式，在抵抗入侵病原体的 第一防线中发挥关键作用。常见的p 雕有t l r 、l e c t i n 、i n t e g r i n s 、l i p o p o l y s a c c h a r i c e b i n d i n gp r o t e i n 、l e u c i n e r i c hp r o t e i n 等等，它们在细胞表面， 胞内组分表达或分泌到血液及组织液中去，刺激细胞分泌出炎症细胞因子及化学 因子，引起调理、活化补体与凝集、吞噬、活化前免疫信号通路以及引起凋亡等 作用。在高等的动物中，它们还参与了活化适应性免疫，刺激抗原呈递细胞分泌 出共刺激因子。天然免疫系统在进化中既是保守的又是多样化的“+ ”1 。 l v s - t y p e p j p g r p 始砌帆。 1 7i ”o z y m e 姑2 l 。 d a p - t y p e 。j - 。 l y s o z y m bo n - a c e t y l m u r a m k ：a c i d 作为重要的p a 肝，肽聚糖( p e p t i d o g l y c a np g n ) 是几乎所有细菌的细胞壁 的主要成分之一，尤其富含于革兰氏阳性菌中。它是由8 ( 1 - 4 ) n - 乙酰葡萄糖 胺( n a c e t y l g h c o s a m i n eg l c n a c ) 和n 一乙酰胞壁酸( n a c e t y l m u r a m i ca c i d 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 m u r n a c ) 组成主要糖链，以连接在n 一乙酰胞壁酰的短肽键连接起来的大分子。根 据短肽第三位上的氨基酸的不同，可以分为m 一二氨基庚二酸( m d a p ) 类p g n ，主 要存在与所有的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的杆菌中，这种细胞壁上的p g n 是单层的，埋藏在l p s 之下。另外一种类型是l 一赖氨酸型，这类分子上还有一个 内肽桥，变化多端，主要存在于革兰氏阳性菌中，这种细胞壁上的p g n 是多层的， 也就是细胞壁的主要组成部分。 p g n 是常见炎症刺激因子，在哺乳动物中会引起严重的败血反应，例如会引 起低血压、炎症、败血、嗜睡、关节炎和厌食等。p g n 会作用于单核细胞、巨噬 细胞、嗜中性粒细胞和表皮细胞，使其活化，产生出女n t n fq 、i l 一1 、i l 一6 等细 胞因子。因此，p g n 是真核生物免疫系统识别的理想靶标。 在昆虫中，天然免疫识别分子主要有四个免疫机制对对付入侵的微生物病原 体。细胞吞噬、血细胞凝集、酚氧化级联系统和分泌抗菌小肽，许多分子在感染 后参与了免疫的应答反应n9 1 。以果蝇为例，目前在果蝇中发现至少3 4 种抗菌肽， 主要是c e c r o p i n s 、d r o s o m y c i n 、d e f e n s i n s 、a t t a c i n 和d i p t e r i c i n 等等，这些 抗菌肽是两亲性分子，可以攻击细胞膜使细菌的细胞膜穿孔，杀死细菌或真菌。 产生这这些抗菌肽的通路主要有两条。其中一条是类似于哺乳动物中的t l r i l r 通路的t o l l 通路，它不仅在发育的背腹决定中起作用，而且在免疫中起着对付真 菌和革兰氏阳性细菌的作用。t o l l 是个跨膜受体，在信号识别分子识别了革兰氏 阳性细菌的肽聚糖以后，激活一系列丝氨酸蛋白酶啪1 ，水解了t o l l 的配体s p a z l e ， s p a z l e 结合至u t o l l 以后，通过一系列的接头分子，女h m y d 8 8 、t u b e 和p e l l e 等，活 化了c a c t u s 分子，这个分子类似于哺乳动物的工k b ，是个抑制分子，它活化后， 释放出转录因子家族r e l 的成员d i f ，从而转录出d r o s o m y c i n 为主要的抗菌肽分 子，来对抗对应的细菌。另外一条通路是i m d 通路，类似于哺乳动物的t n f 通路， 主要是识别革兰氏阴性菌的。这条通路主要是信号识别分子识别了阴性菌的肽聚 糖以后，信号传导给了i m d 蛋白，i m d 蛋白具有d e a t h 结构域，它通过与一系列的 接头分子通过磷酸化信号放大，例女i j f a d d 、d e r d d 、i k k 等，活化转录因子r e l i s h ， 转到核内从而转录出一系列的抗菌肽来对付阴性菌，其中d i p t e r i c i n 最具代表 性。下面提到的肽聚糖识别蛋白在这两条通路中主要起着识别分子和效应分子的 作用2 1 删。 8 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别蛋白功能研究 哺乳动物识别肽聚糖采用的是另外一套分子。在哺乳动物中，负责识别p g n 的主要分子有t l r 2 、c d l 4 、n o d l ( n u c l e o t i d e b i n g d i n go l i g o m e r i z a t i o nd o m a i n ) 和n o d 2 、c r y o p y r i n 、清道夫受体( s c a v e n g e r sr e c e p t o r ) 、溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 以及将要提到的肽聚糖识别蛋白( p g r p ) 。它们有些分布在细胞膜上，如t l r 2 ， 有些在细胞质中，如n o d l 和n o d 2 ，识别了p g n 的完整结构或是降解了的小片段， 然后，激活通路，引起n f - kb 等的转录因子，从而启动了一系列免疫机制。而溶 菌酶就直接在皮肤黏膜上表达维持着皮肤表面的菌落生态平衡n 2 2 4 。剐。 1 3p g r p 研究现状 1 9 9 6 年，y o s h i d a 等人在家蚕中发现并命名的第一个肽聚糖识别蛋白( p e p t i d o g l y c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n p g r p ) 。这个p g r p 被发现活化昆虫中独有的酚 氧化酶原级联反应啪j 。接着在蛾、果蝇、蚊等昆虫，以及哺乳动物中的小鼠、 大鼠、人、牛、猪、骆驼等动物中也相继被发现并命名。后来，在软体动物中也 有报道，在棘皮动物，两栖动物和鱼类也有了网上的序列资源，但是在较低等的 动物如线虫和植物中没有找到。在已经发现的这类蛋白都具有一个或两个的肽聚 糖识别的结构域，说明这类蛋白在进化上是保守的。这个家族跟噬菌体的t 7 溶菌 酶具有同源性。 目前，国际上研究p g r p 研究得比较多和深入的是美国的r o m a nd z i a r s k i 为首 的研究小组和瑞典的h a k a n s t e i n e r 为首的研究小组n 8 j 2 1 等，而国内也有少量的报 道矧。 1 3 1 昆虫的p g r p 昆虫有多个p g r p ，包括识别，信号传导和效应分子，在天然免疫中起着重要 的抗菌作用。它们主要表达在免疫器官中，例如脂肪体、肠和血淋巴中。受菌或 是p g n 感染后，会上调表达m 3 嗣。果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 有13 个p g r p 基因，被转录成至少1 7 个蛋白，包括7 个s 和1 0 个l 。蚊子( t n o p h e l e s g a 嘲b j a e ) 有7 个基因，转录成至少9 个基因。其余如家蚕( b o m b y xm o r i ) 咖j 1 1 、蛾 9 中山大学硕士论文中国文昌鱼肽聚糖识别瑕白功能研究 ( t r i c h o p u s i a 厕) 澜、蜜蜂( 1 1 0 1 0 t r i c h i ad i o s p h a l i a ) 弱 、黄粉甲虫( t e n e b r i o m o h t o r ) 侧等也有发现。根据分子的大小，可以将昆虫的p g r p 分成两类：短型 p g r p - s ，及长型p g r p - l ，前者约1 9 - 2 0 k d a ，最先被发现并分泌到胞外，后者有更 长的转录本，或在胞内或跨膜铂。昆虫的p g r p 最有代表性的是果蝇的，以果蝇为 代表，已经发现了p g r p 的几个已知功能。 1 3 1 1 活化t o i l 通路和吞噬 三个小的p g r p ，p g r 卜s a 、p g r p - s d 和p g r p s e l ，识别了细菌的肽聚糖i 以后， 活化降解s p a e z l e 蛋白酶，从而活化了t o l l 通路( 图1 - 3 a ) 。t o l l 活化是专一对 l y s 型p g n 有反疲，对d a p 型p g n 有弱得多的反应嘲。其中，p g r p _ s a 其实对这两种 p g n 都识别田1 ，但是p g r p - s a 对后者有羧肽酶活，降解了后者，丽对前者只有识 别的作用。p g r p - s a 作为一个信号识别分子参与识别革兰氏阳性菌，还需要与另 外一个模式识别分子g n b p - 1 结合后共同作用，结合以后，通过一系列的丝氨酸蛋 白酶汹，水解s p a z l e ，活化t o l l 通路嘲。g n b p - l 水解p g n 产生自由的m u r n a c 末端， 再被p g r p - s a 识别。p g r p - s d 与p g r p s c l 等也被发现活化这条t o l l 通路1 j 2 1 。但 是s d 是非必需的，但是可以加强作用。p g r 卜s c l 与p g r p _ s a 还发现参与细菌的吞 噬作用嘲。0 8 年，l i h u iw a n g 等报道了p g r p s d 可以与g n b p l 相互作用，并增强 g n b p i 与p g r p s a 之间的相互作用，从而阐述了在果蝇中不同种类的p g r p 之间可以 通过发生相互作用来应对自然界多样化的革兰氏阳性菌的肽聚糖3 。 1 3 ，l 。2 活纯i m d 通路 i m d 通路不依赖于t o l l 通路，主要识别革兰氏阴性菌和阳性中的杆菌( d a p 型踅n ) 。果蝇的跨膜蛋白悠r p - 在这条通路中起着信号识别的跨膜模式识别受 体的作用( 图1 - 3 b ) 。p g r p - l c x 是i m d 通路的主要信号识别分子，它主要识别革 兰氏阴性细菌上i 搀d a p 型p 6 n ，焉多聚他的l y s 型p g n 也有弱的结合力，活化信号转 导，然后导致r e l i s h 转录汹4 町。d a p 型p g n 被p g r p - l c 识别的两个特征是，有d a p 存 在，以及楚乙酰胞壁酰胺的量，6 脱水形式，因为此形式可以使c l 碳原予处于稳定 的b 构象中h 7 】。p g r p - l c 还参与了对大肠杆菌等的阴性菌的吞噬，但是对金黄色 葡萄球簧等阳性蓥无反疲，具体机制仍不清楚渊。类似地，p g r p - l e 也发现健于 表皮组织激活i m d 通路诱导抗菌肽。对于e c o l i 和杆菌的感染，l e 位予l c 上游或 1 0 中m 大学磋论文中国文昌鱼肚聚糖识别蛋白功能研究 并列于l c ，激活i m d 通路。p g r p l e 也被发现激活酚氧化酶级联通路1 。p g r pl e 结合上t c t 以后会引起头尾相接的多聚化，也提示了多聚化的d a p 型p g n 被多个 p g r p _ l c x 结台引起i m d 通路的结构机理。此外，t a k a s h i 等人最近还发现， p g r pi 正还有长短两种转录形式；其中全长形式不依赖p g r p 【c ，而依赖i m d 蛋白， 引起d i p t e r i c i n 上调表达，但是与t c t 引起的d i p t e r i c i n 上调表达无关：而非全 长型p g r p l e 类似于c d l 4 对t l r 一样，与p g r p l c 相瓦作用，参与t t c t ；i 起的 d i p t e r i c l n 上调表逃”。 削卜3 昆虫蹦k p 功能示意崮1 。 f i g 卜3f u n c t i o n so f i n s e clp g r pp r o t e i n s 2 0 0 7 年，t a k a h i r ot a n j i 等阐述了粜蝇中t o l la n di m