（草业科学专业论文）紫花苜蓿和白花草木樨细胞融合技术研究.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 利用原生质融合进行优良基因转移是一种短期而且非常有效的生物技术。 目前国内外利用此项技术对番茄、烟草、水稻等植物进行了大量的研究。现已 从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。 目前细胞融合技术已被广泛用于牧草研究的许多领域，并在紫花苜蓿和其他牧 草抗性育种、减少膨胀病危害、提高干物质消化率、生物可降解材料开发、生 物土壤改良、生物疫苗及活性制剂等方面取得了进展和突破。但是利用草木樨进 行原生质体融合的研究国内外未见报道。本实验建立了完整的紫花苜蓿、草木樨 组培体系，并对紫花苜蓿、白花草木樨原生质体融合的条件进行了初步分析，主 要结果如下： 1 以m s 为基本培养基，通过调整激素浓度等培养条件，摸索出紫花苜蓿和 草木樨组织培养体系的最佳培养基。紫花紫花苜蓿的最佳培养基：愈伤组织诱导 最佳培养为m s + 2 ，4 - d 3 o m g l - 1 + 6 一b a o 3 m g l _ 1 ；草木樨的最佳培养基：愈伤 诱导最佳培养基为m s + 2 ，4 - d 1 5 m g l - - 1 + 6 一b a o 3m g - l - 1 。 2 本研究对酶液最佳配方进行研究，得出分离紫花苜蓿原生质体酶液的组成 以2 的纤维素酶、0 2 果胶酶、0 5 离析酶为好，产量可达1 9 1 0 7 个g ；酶 解时间为l o h 时原生质体的活力最大为6 0 ；分离草木樨原生质体的酶液组成以 2 的纤维素酶、o 3 果胶酶、1 离析酶为好，产量可达4 3 1 1 0 7 个g ，酶解时 间控制在15 h 时原生质体的火力最大为6 2 5 。 3 用不同浓度的i o a 处理白花草木樨原生质体，得到以下结果：以3 t r i 0 1 m 1 i o a 处理l o m i n ，能有效地使白花草木樨原生质体失活。 4 用紫外线处理紫花苜蓿原生质原生质体，得到以下结果：以3 7 5u w c m 2 辐射量照射6 0 s ，能有效的使紫花苜蓿原生质原生质体失活。 口 5 通过p e g 诱导原生质体融合，得到紫花苜蓿和草木樨的属间体细胞杂种， 最佳融合条件为：p e g ( 6 0 0 0 ) 浓度为4 0 ，融合率为1 2 5 。 关键词：紫花苜蓿；草木樨；原生质体；组织培养；细胞融合 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 s u m m a r y - i ti sas h o t - t e r ma n de f f e c t i v eb i o t e c h n o l o g yt h a tm a k eu s eo ft h ep r o t o p l a s t f u s i o nt ot r a n s f e rt h e9 0 0 dg e n e n o wt h i s t e c h n o l o g y w a sr e s e a r c h e do n t o m a t o e s ，t o b a c c o , r i c ea n do t h e rp l a n t sa th o m ea n da b r o a d n o wm a n ys p e c i e s b e t w e e ns p e c i e sa n do t h e r so re v e nas u b f a m i l yo fs o m a t i cc e l lh y b r i da c c e s st o h y b r i dc e l ll i n e so rh y b r i dp l a n t s a tp r e s e n tc e l lf u s i o nt e c h n o l o g yh a sb e e nw i d e l y u s e df o rf o r a g ei nm a n ya r e a so fr e s e a r c ha n da l f a l f aa n do t h e rf o r a g er e s i s t a n c e b r e e d i n g ，r e d u c es w e l l i n go fh a z a r d si n c r e a s ed r ym a t t e rd i g e s t i b i l i t y ，b i o d e g r a d a b l e m a t e r i a l sd e v e l o p m e n t ，b i o l o g i c a ls o i li m p r o v e m e n t ，v a c c i n e sa n db i o l o g i c a la g e n t s s u c ha st h ea c t i v i t yh a sm a d ep r o g r e s sa n db r e a k t h r o u g h sb u tt h ep r o t o p l a s tf u s i o n r e s e a r c hh a sn o tb e e nr e p o r t e da th o m ea n da b r o a d i nt h i ss t u d y ，t h ew h o l et i s s u e c u l t i v a t i n gs y s t e r mo fa 1 f a l f aa n dm e l i l o t u ss u a v e o l e nw a se s t a b l i s h e d ，a n dt h e c o n d i t i o no fp r o t o p l a s t sf u s i o nw a sp r i m a r i l ya n a l y z e d t h er e s u l t so fo u re x p e r i m e n t w e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 m sw a su s e da st h eb a s i cc u l t i v a t i n gm e d i u m t h eo p t i m a lc u l t i v a t i n g c o n d i t i o n so fa l f a l f aa n dm e l i l o t u ss u a v e o l e nw a sf o u n dt h r o u g ha d j u s t i n gt h e v a r i e t i e sa n dc o n c e n t r a t i o no fh o r m o n e sa c c o r d i n gt ot h eo r t h o g o n a ld e s i g n t h em o s t a p p r o p r i a t ec u l t i v a t i n gm e d i u mo f a l f a l f aw a sm s + 2 ，4 d3 0 m g l + 6 - b a0 3m g c l f o rc a l l u s t h em o s ta p p r o p r i a t ec u l t i v a t i n gm e d i u mo fm e l i l o t u ss u a v e o l e nw a sm s + 2 , 4 一d1 5 m g l + 6 - b a0 3m e r e 2 t h eb e s tc o m b i n a t i o no fi s o l a t i n gp r o t o p l a s to fa l f a l f aw a se n z y m em i x t u r e c o n t a i n i n g2 c e l l u l a s er 一1 0 ，o 2 p e c t i n a s ea n do 5 m a c e r o z y m er - i o ，a n d h i g h e s ty i e l da c h i e v e dt o1 9 x1 0 7 g ，h y d r o l y s i st i m ei s 10 h ，t h ep r o t o p l a s tv i t a l i t y a c h i e v e d6 0 ；t h eb e s tc o m b i n a t i o no fi s o l a t i n gp r o t o p l a s tm e l i l o t u ss u a v e o l e nw a s e n z y m em i x t u r ec o n t a i n i n g2 c e l l u l a s er - 1 0 0 3 p e c t i n a s ea n d1 m a c e r o z y m e r - 1 0h y d r o l y s i st i m ei s1 5 h ，t h ep r o t o p l a s tv i t a l i t ya c h i e v e d6 2 5 3 t h ep r o t o p l a s to fm e l i l o t u ss u a v e o l e nw a st r e a e db yi o aw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ，t h eb e s to ft h i se x p e r i m e n tw a ss h o w na sf o l l o w s ：3 m m o l m li o aw a s u s e dt ok i l lt h ep r o t o p l a s to fm e l i l o t u ss u a v e o l e nb y t r e a t i n gt e nm i n u t e s 4 t h ep r o t o p l a s to fa l f a l f aw a st r e a e db yu v ，t h eb e s to ft h i se x p e r i m e n tw a s s h o w na sf o l l o w s ：r a d i a t i o n o fu vi s3 7 5u w c m 2w a su s e dt ok i l l l ep r o t o p l a s to f a l f a l f ab yt r e a t i n go n em i n u t e s 5h y b r i dc e l l so fa l f a l f aa n dm e l i l o t u ss u a v e o l e nw e r eo b t a i n e du s i n gp r o t o p l a s t u s i o nb yp e gm e t h o d ，t h eb e s tf u s i o nc o n d i t i o n4 0 p e g ( 6 0 0 0 ) c a no b t a i nt h e h y b r i d c e l l t h ef u s i o nr a t ei s12 5 k e yw o r d ：m e d i c a g os a t i v al ；m e l i l o t u ss u a v e o l e n ；t i s s u ec u l t u r e ；p r o t o p l a s t ； p l a n te e l lf u s i o n h 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 关于论文使用授权的说明 本人完全了解甘肃农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。同意甘肃农业大学可以用不同方式在不同的媒体上发表、传播 学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应该遵守此协议) 研究生签名： 谈办学 7 时间：多哪年舌月阳日 导师签名： 5 7 时间：年月日 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 引言 紫花苜蓿是豆科苜蓿属多年生牧草，具有一次种植常年刈割、产草量高、营养丰 富、适口性等突出特点，是优质蛋白质饲料的重要来源，被誉为“牧草之王 。 紫花苜蓿虽然种植面积比较广泛但其对水分及土壤条件的要求比较高，苜蓿是需 水较多的植物，每形成1 吨干草需水约7 0 0 8 0 0 吨。紫花苜蓿虽然喜水，但最忌积 水，水淹2 4 小时会造成植株死亡。地下水位过高，对紫花苜蓿的生长也是不利的， 一般情况下，水位应在1 米以下。紫花苜蓿适合生长在年降水量5 0 0 - - 8 0 0 毫米的地 区，不足4 0 0 毫米的地区需要灌溉，如果降雨量超过1 0 0 0 毫米则要注意排水设施配 置。因此，夏季多雨、天气湿热，不适宜紫花苜蓿的生长。土壤水份的多少也可影响 紫花苜蓿饲用品质，另外紫花首蓿不耐酸以土壤p h 7 8 为宜。当土壤处于偏酸或偏 缄时就会出现生长不两甚至死去，苜蓿只是一种轻微的耐盐植物在土壤含盐0 1 o 3 范围内能正常生长。因此不能在高盐碱地生长，这就限制了苜蓿在一些生长范围。 草木樨是豆科草木樨属( m e l i l o t u sa d a n s _ ) ，为一年生或二年生草本植物。我国 生产上常用的种类为二年生白花草木樨，主要在东北、华北、西北等地区栽培。多与 玉米、小麦间种或复种，也可在经济林木行间或山坡丘陵地种植，保持水土。草木樨 养分含量高，不仅是优良的绿肥，也是重要的饲料。草木樨具有很强的生活力和适应 性，能耐旱、耐寒、耐瘠薄、耐盐碱等。草木樨根系发达，入土深，根辐大，抗旱性 特别强，草木樨对土壤的适应性很强，在粘性土、砂土以及其它一些绿肥作物较难生 长的瘠薄土均可很好地生长。草木樨的耐盐性也很强，含盐量不超过0 3 0 时，草木 樨都能很好地生长发育。由于草木樨体内含有一种叫香豆素的物质使草木樨的适口性 下降牲口的采食需要一段时间的适应，另外草木樨的产量不不是很高只是紫花苜蓿产 量的三分之一，因此草木樨虽然耐性很强，但由于产量不是很高使其栽培范围受到了 一定的限制。 传统的有性杂交是通过雌雄配子结合，实现双亲遗传物质转移和重组的常规育种 手段。这一育种技术在植物育种工作中发挥了巨大的作用。但是，诸如远缘杂交的有 性不亲和、双亲花期不育、雌雄不育等等难以克服的障碍严重地阻碍了这一技术在 植物育种中的应用。以原生质体融合为基础的体细胞杂交技术可以克服有性杂交遇到 的前述障碍。基因工程技术虽然能定向转移少数几个基因，但目前对于控制作物的许 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 多重要农艺性状的多基因系统还无能为力。细胞融合( c y t o m i x i s ) ，亦称细胞杂交 ( c e l lf u s i o n ) ，是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种 细胞的过程。植物细胞融合可分为体细胞杂交( s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) 和配子一体细 胞杂交( g a m e t o - s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) ，前者是指不经过有性过程，而直接由体细胞 原生质体融合产生杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程，后者是指性细胞 ( 如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细 胞等) 原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出 植株的过程。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支，是一种突破物种生殖隔 离、创造远缘杂种的新途径，原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植 和外源d n a 的导入。 体细胞杂交技术虽然有其随机性的缺陷，但由于可转移细胞核中的染色体组、染 色体片段，或者细胞质中的叶绿体d n a 和线粒体d n a ，因而使可利用的基因资源十分 广泛。体细胞杂交在转移抗逆性状，进行作物改良，实现远缘重组，创造新型物种， 以及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子一体细胞杂交产生三倍体植物上显示 出重要的应用前景。 自1 9 7 2 年美国科学家c a r l s o n 等首次用硝酸钠作融合诱导剂，使两种不同的烟 草原生质体融合，得到了体细胞杂种植株，这一成果揭开了植物体细胞杂交的序幕。 许多科学家试图通过体细胞杂交把豆科植物的一些特性转移到其它植物中去。早在二 十世纪七十年代，由大豆悬浮培养细胞的原生质体与油菜叶肉原生质体n 】，以及大豆 和大麦原生质体乜3 进行融合，就形成了异核体并发展为细胞团。k a 。等口1 和钱迎倩等h 1 还分别用两种烟草( n i c o t i a n ag a u c a t a b a c u m ) 的叶肉原生质体与大豆培养细 胞的原生质体进行融合，获得了杂种愈伤组织。此后，这类远缘物种的体细胞杂交研 究己经不多。一些研究者将注意力转向进行一些豆科牧草近缘种之间的体细胞杂交研 究，以便将抗性性状从野生种转移到栽培种中。这方面的工作大多集中在苜蓿属，并 且在杂交组合中多以紫花苜( m e d i c a g os a t i v a ) 为一杂交亲本。通过有性杂交引进外 源种质对紫花苜蓿来讲还不太成功，而体细胞杂交则被认为是引进野生种质、克服受 精不育性障碍，获得有益杂交组合的最有效方法畸3 。二十世纪八十年代，d a m i a n i 等3 用电激法诱导彪s a t i v a 和彪a r b o r e a 的原生质体融合，产生9 的异核体，并发育 成愈伤组织。g i l m o u ：等口1 通过化学诱导和电激诱导使白化紫花首蓓和彪b o r e a l i s 2 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 融合，也形成杂种愈伤组织。d e a k 等哺3 由抗卡那霉素的m v a r i a 的无菌苗分离原生 质体与抗p p t ( p h o s p h y n o t r i c i n ，链霉菌产生的一种天然氨基酸类似物，可抑制谷氨 酞胺合成酶的活性) 的紫花首楷( 带一扩增的谷氨酞胺合成酶基因) 培养细胞原生质体 融合，获得了扩增的谷氨酞胺合成酶基因与n p ti i 基因( 新霉素磷酸转移酶基因) 都 得到表达的杂种细胞。以上的研究结果仅得到了杂种愈伤组织。法国的t e o u l e 1 最 先在苜蓿属的紫花苜蓿( m e d i c a g os a t i v a ) 和野苜蓿( m f a l c a t a ) 的原生质体融合中 获得再生植株。t h o m a s 等n 们将抗卡那霉素的紫花苜蓿与具潮霉素抗性的m i n t e r t e x t a 进行杂交，得到的杂种愈伤组织能分化胚状体并形成小植株。随后紫花苜 蓿与彪c o e r u l e a n l1 2 3 和彪a r b o r e a n 3 1 的融合，以及天蓝苜蓿( 膨l u p u l i n a ) 和m b o r e a l i s 的融合口制，相继得到了杂种植株。 除苜蓿属外，有关百脉根属植物的体细胞杂交也有成功的报道。a z i z 等n 5 3 用电激 融合百脉根( l o t u sc o m i c u l a t u s ) 和细叶百脉根( ( l t e n u j s ) 的原生质体。用于杂交 的l t e n u i s 是带有外源n p ti i 的转基因植株，在含卡那霉素的选择培养基上筛选 到杂种细胞，并获杂种植株，与亲本相比，杂种植株具有明显的杂种优势和高的固氮 活性。w r i g h t 等n 明将百脉根( c o r n i c u l a t u s ) 和l c o n i m b r i c e n s i s 的原生质体融 合，也获得了杂种植株。对于三叶草属，由于此属原生质体再生植株困难，因此仅获 得了t r i f o l i u mp r at e n s e ( + ) zh y b r i d u m 和zp r at e n s e ( + ) zr u b e n ，的杂交系。 1 7 虽然苜蓿是一种优良的牧草，但其耐贫瘠性远不如草木樨，因此苜蓿的栽种范围 受到了一定的影响；同样草木犀虽然耐贫瘠性比较强，但草木犀中含有香豆素物质， 由于这种物质的存在大大的降低了草木犀的适口性，因此我们想通过成熟的细胞融合 技术，将紫花苜蓿和草木樨原生质体融合，以期获得一个将紫花苜蓿和草木樨的摸索 出苜蓿和草木樨组织培养体系的培养条件、力争获得紫花苜蓿和草木樨的杂种细胞或 植株，希望能得到一种更耐贫瘠适口性更好的新品种牧草。 1 植物细胞融合 第一章文献综述 多少年来，人们一直利用亲缘关系密切的种间有性杂交改良栽培作物。但是在多 数情况下，成功的有性杂交仅局限于种内的栽培品种之间或者某一些亲缘关系相近的 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 野生种与栽培种之间的杂交。在不少情况下，种间杂交甚至栽培种内品种间杂交是不 亲和的，这就严重限制了杂交育种中野生资源的利用和亲本自由组配。 体细胞杂交( s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) 在植物中也叫植物细胞融合( p l a n tc e l l f u s i o n ) 为克服植物有性杂交不亲和性，打破物种间的生态隔离、扩大遗传变异等提 供了一种有效手段。理论上讲利用适当的物理或化学方法，可以将任何两种原生质体 融合在一起；利用适宜的培养方法，可以融合原生质体再生出杂种植株既体细胞杂种 ( s o m a t i ch y b r i d ) 。 植物原生质体( p r o t o p l a s t ) 一词始自h a n s t e i n ( 1 8 8 0 ) ，即指“通过质壁分离， 能够和细胞壁分开的那部分物质”。换言之原生质体就是除去全部细胞壁和“细 胞 ，或是一个原生质膜所包围的“裸露细胞。植物细胞脱去细胞壁形成原生质体。 对原生质体的分离要求是获得最大而又具活力的原生质体，因此原生质分离是原生质 体融合的第一步，也是非常关键的一步直接影响到融合的成功与否，植物的细胞壁由 纤维素、半纤维素、果胶质及少量蛋白质等成分组成，壁与壁之间，由胞间层黏着再 一起。欲分离原生质体，须先除去胞间层，游离出单个细胞，然后再除去各个细胞的 细胞壁，分离原生质体的方法有机械法和酶解法。 1 8 9 2 年，k l e r c k e r 把藻类细胞先放到糖液中，让细胞质壁分离，原生质体缩成 球形，然后把藻体破碎掉，当渗透压稍降低后就有少量完整的原生质体释放出来。这 是第一次用机械方法得到原生质体n 踟，这种机械法一直延续到2 0 世纪5 0 年代。由于 用这种方法分离原生质体，获得的完整原生质体数日极少，并且只能从液泡化了的薄 壁细胞或球茎类的储藏组织中分离，因此在应用上受到很大限分离植物原生质体时期 射。1 9 7 1 年，n a g a t a t 等首次由烟草原生质体得到再生植株，证明了原生质体具有的 全能性啪2 。1 9 7 2 年c a r l s o n 等人用烟草种间原生质体融合获得第一例细胞杂种。这 些结果极大的激发了研究者在原生质体培养及体细胞杂交方面的举。利用根癌农杆菌 感染由原生质体再生的细胞n 引，或将分离的t i 质粒d n a 直接导师入原生质体瞳2 删以及 用农杆菌的球质体与植物原生质体融合将t - d n a 转入植物细胞羽，获得转化植物的成 功，则促进了原生质体作为受体系统进行导入外源d n a 的试验，加上利用原生质体进 行摄取叶绿体、细胞核、根瘤菌、噬菌体的试验，使之成为利用原生质体进行遗传操 作的一个重要方面。 由于有性杂交技术不亲和性的障碍，使可利用的基因资源十分有限。基因工程技 4 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 术固然有很强的目的性，但目前对于控制作物的许多重要农艺性状的多基因系统还无 能为力。植物细胞融合技术虽然有其随机性的缺陷，但由于可转移细胞核中的染色体 组、染色体片段，或者细胞质中的叶绿体d n a 及线粒体d n a ，因而使可利用的基因资 源十分广泛。植物细胞融合配合常规育种技术，可望选育出优良材料，加之体细胞杂 种来自双亲的遗传物质并非简单的堆积；而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作 物所期望的。植物细胞融合的意义在于从细胞水平上，提供遗传物质交换的一种新方 法，通过异源原生质体的融合，广泛地重组植物界优良性状，为植物育种开辟一条全 新的途径。 原生质体融合技术中的主要步骤为：植物原生质体的制备和纯化、植物原生质体 全、杂种细胞筛选鉴定、植物原生质体的培养。关于原生质体融合技术中的四个主要 内容的研究进展概述如下。制。1 9 6 0 年，英国诺丁汉大学的e c c o c k i n g 首次用纤维 素酶从番茄幼苗的根分离得到原生质体，从此开创了用酶解法制取原生质体。 1 1 植物原生质体的制备 原生质体制备就是植物细胞脱去细胞壁形成原生质体，它是细胞融合的第一步， 同时也是非常关键的一环，原生质体的产量和活力直接影响着细胞融合的成功与否。 从理论上说，只要用适当的酶处理，就能从任何植物的任何活的组织或其培养的细胞 系都可分离得到原生质体。但对于原生质体培养来说，要得到产量高、活性强、能进 行分裂，形成愈伤组织或胚状体，最后能再生成完整植株的原生质体，则受许多因素 的影响。就影响原生质体分离时的产量与活力来说，主要应考虑到植物基因型、制取 原生质体的材料、酶的种类及其组合、酶制剂的纯度、酶液的渗透压、原生质膜的稳 定剂、酶解时间与温度、分离与纯化的方法等。 1 1 1 植物的选择 选择合适的植物种类是原生质体培养和融合成功的关键因素之一。不同种植物， 对培养基和培养条件反应有很大的差别。在相同的条件下，有的植物能够顺利地完成 原生质体游离、再生细胞持续分裂成愈伤组织及器官分化的全过程，而有的品种则不 能。因此在选择制备原生质体材料时，往往需要借鉴组织培养和细胞培养的经验和规 律，因为这些工作已对易再生的植物进行了筛选。原生质体培养的研究在这些易再生 的植物品种上取得成功之后，势必会有利于积累经验、总结规律，进一步取得全面突 5 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 破2 制。 1 1 2 制备原生质体的材料选择 选择合适的原生质体供体是原生质体培养能否成功的又一个关键因素。在以往的 双子叶植物中，游离原生质体的材料大多直接取自植物体，并多以叶片为主。这种材 料易于获得，酶处理简便，在短时间内可制备大量的原生质体。但实践证明，这种方 法在禾谷类作物中很难培养成功。禾谷类作物原生质体培养是用从幼胚或成熟胚诱导 形成的胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系来游离原生质体。虽然诱导胚性愈伤组织和胚 性悬浮细胞系要花费较长的时间和较多的人力，但从这种材料游离出的原生质体生活 力旺盛，能够在培养过程中持续地分裂并保持着较强的器官分化能力。因此，胚性愈 伤组织或胚性悬浮细胞系一旦建立起来，就可顺利地开展原生质体培养工作，且重复 性良好。这是近年来原生质体培养在禾谷类作物上获得突破的决定性因素之一。 要保持较强的胚性状态，就要通过不断地继代培养，才能用来游离原生质体和进 行原生质体培养。这类细胞在组织学上的特征是细胞的体积较小，近乎圆形，细胞质 浓厚，液泡不发达。 一般获得原生质体的材料可分为两大类：类是天然材料，包括田间栽培的或野 生的植株、温室或盆栽的植株等；另一类是人工培养的材料，包括愈伤组织、悬浮培 养组织、组织培养得来的再生植株以及种子灭菌后的在试管中萌发出来的无菌苗等。 为了能够获得原生质体培养成功，在选择材料时，应注意以下方面： a ：选择具有形态分化潜力的材料，使原生质体经培养后容易诱导器官的发生。 b ：选择经酶处理后可以得到大量原生质体的材料，使原生质体的产量维持较高水 平。 c ：经酶处理后原生质体稳定性好，不易破碎。 d ：所得到的原生质体活性高，可持续分裂。 一般而言，植物的各个器官，如根、茎、叶、子叶、下胚轴、果实、种子及其愈 伤组织和悬浮细胞等，都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得产量高、质量好， 且容易分裂的原生质体，选择合适的基因型是原生质体培养成功的关键因素之一，因 一种植物中，不同的基因型对培养基和培养条件反应有很大差别。在相同的条件下， 有的品种能够顺利地完成原生质体游离，再生细胞可持续分裂形成愈伤组织及出现器 官分化，而有的品种则不能。在选择适当品种为原生质体培养起始材料时，往往可以 6 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 借鉴组织培养和细胞培养已取得的经验和规律，因为这些工作实际上已对易再生的基 因型迸行了筛选。基因型一旦确定后，就要注意用于制备原生质体的起始材料的特性 和生理状态。茄科植物一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片分离原 生质体。天然生长植株的幼嫩叶片，是游离原生质体的好材料，取材方便，来源也比 较广泛。在适宜的条件下，可以获得大量的、活性高的原生质体。但对于木本植物须 选取幼嫩的叶片作游离原生质体的材料。d o r i o n 等( 1 9 8 3 ) 研究表明，幼嫩叶片的原 生质体产量比老叶高，并且幼嫩叶片原生质体的存活率也明显地比老叶的高。这种 “老 与“嫩 的影响，仅仅是指叶片本身，而与母体年龄无关。即使7 0 多年树龄 的山毛榉幼嫩叶片同样能获得大量有生命力的原生质体，经过培养发生了再生细胞的 分裂。以颤杨为例：在冬末春初，从成年树上切取4 0 5 0 c m 长的带有休眠芽的枝条， 这些枝条在4 条件下贮藏几个月。原生质体游离前，将枝条两端切去后插入自来水 中，保持2 2 2 4 。c 、光强3 4 0 0 一- - , 4 0 0 0 1 x 、湿度为6 0 7 0 的条件下，8 l o d 就可产生 第1 片叶。这种叶片角质层薄，无需高浓度的酶即可获得原生质体。使用这个程序， 一年当中大部分时间都可得到用来游离原生质体的幼叶，其他部位如茎、根等不适于 用来游离原生质体。 对十字花科植物，常从种子萌发4 “5 d 的无菌苗胚轴上分离原生质体，相对于其 叶片、子叶、根尖而言，具有原生质体得率高、活力强、再生频率高等特点，培养过 程中有利于高频率的植株再生。豆科植物中的大豆、蚕豆、花生、豇豆等，其未成熟 种子胚的子叶由于制备原生质体时得率高、活力强，在培养过程中表现出很强的再生 能力，已成为分离原生质体的一种好材料。无菌苗子叶也是游离原生质体的一个好材 料，其优点是无需再经表面灭菌的处理，从而避免了灭菌剂对材料的伤害。张绮文等 ( 1 9 8 1 ) 用小叶杨( p o p u l u ss i m o n i l 为材料，进行了子叶、下胚轴，嫩根、老根、嫩 叶及幼茎诱导而来的愈伤组织等原生质体的游离比较，发现在适宜的酶质量分数下 ( 1 5 纤维素酶，0 7 5 果胶酶) ，子叶在较短时间里就可获得大量原生质体，优于嫩 叶和愈伤组织。 d a v i d 等( 1 9 7 9 ) 从海岸松( p i n u sp i n a s t e r ) 子叶也游离出了大量活性高的原生质 体，并经培养后形成愈伤组织。由此可见，从子叶游离原生质体，可以满足活性、产 量及稳定性的要求。但一般植物的子叶都较小，欲得到大量原生质体则需要大量的种 子，这点是使用子叶游离原生质体的不足之处。 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 对于禾本科植物，特别要注意从幼胚、幼穗、花药( 花粉) 或成熟胚建立胚性愈 伤组织中分离原生质体，则有利于其后的再生。外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培 养物，是目前植物原生质体研究中最广泛使用的原生质体来源的原始材料。它的优点 是：材料不受外界环境的影响，试验的重复性好；原生质体的产量、活性及稳定性等 比较理想；可以借鉴组织培养中的器官培养、花粉培养及细胞培养的经验，对原生质 体的分化潜力做出初步的估价。如果运用外植体培养经愈伤组织阶段后诱导器官的发 生，那么不仅其培养基及培养条件可供原生质体培养时参考，而且从这种愈伤组织得 到的原生质体或许分化的潜力会比较高。v a r d i 等( 1 9 7 5 ) 通过早期的柑橘珠心培养获 得再生植株后，利用珠心愈伤组织分离原生质体。在木本植物中，第一个完成了从原 生质体到再生植株的实验程序。r a o 等( 1 9 8 4 ) 所做的檀香原生质体培养工作，也是利 用细胞悬浮培养物为游离原生质体的材料而获得了成功。组织培养成功并不意味着其 原生质体培养就一定能成功，如小麦的花药培养早已获得了成功，而原生质体培养则 还有很多困难。 但是，无论是愈伤组织还是细胞悬浮培养物，往往需要若干次的继代培养后才能 达到适合游离原生质体的状态，继代次数多的悬浮比继代次数少的原生质体产量高。 枸杞( l y c i u 留c h i n e n s e ) ( 孙勇如等，1 9 8 2 ) 的研究发现，从幼叶和茎诱导来的愈伤组 织，每7 d 继代一次，只有继代8 次以上的愈伤组织才适于用来游离原生质体，否则 原生质体的产量很低。这样多次的继代，有可能使材料形态分化的潜力下降。这是使 用愈伤组织和细胞悬浮培养物游离原生质体的一个令人担忧的问题。但这个问题可通 过选择诱导愈伤组织的材料来解决，如选取具有较高分裂和分化能力的幼胚来诱导愈 伤组织就是一个好办法。幼叶、子叶、愈伤组织、细胞悬浮培养物等作为原生质体游 离的原始材料，各有利弊，但后两种材料应用广泛，并已有了成功的例证。除上述材 料外，还有人用花粉或花粉母细胞来游离原生质体，这些材料使用起来程序较复杂， 并且难以大量收集，使用的人不多。究竟选取哪种材料最好，不仅要参考前人的经验， 还要看到不同的植物种类间存在的差异，具体的条件也不尽相同，应区别对待。 1 1 3 植物原生质体的酶解 植物原生体的分离制备有机械法和酶消化法。机械法分离原生质体，获得的完整 原生质体数目极少，并且只能从液泡化了的薄壁细胞或球茎类的储藏组织中分离，不 能从分生组织中分离获得原生质体因此已无人采用。 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 酶解法开始于2 0 世纪6 0 年代初，英国n o t t i n g g h a m 大学植物系的c o o k i n g 等人， 受到酶分解细胞和真菌细胞壁获得原生质体的启发，推测用真菌纤维素酶也可能从高 等植物的组织中获得原生质体。他们首次以漆斑霉产生的纤维素酶粗制剂，从番茄根 尖分离出大量的原生质体，为植物原生质体培养开创了新途径由于酶解法分离原生质 体可以获得大量而有活力的原生质体，通常1 9 鲜重可以得到1 0 6 “1 0 7 个原生质体。 用酶解法可以处理多类植物组织，如果没有液泡的分生组织或其他幼嫩组织，所以目 前在原生质体分离、培养及体细胞杂交研究中，普遍采用酶解法获得原生质体。 1 1 3 1 分离原生质体常用的酶 高等植物细胞壁主要成分为纤维素，其次为半纤维素、果胶质和蛋白质。细胞生 长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构也有差别，木质化及次生加厚的细胞壁 不容易被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体的关键。 常用的酶类有： ( 1 ) 纤维素酶 纤维素酶e a 38 6 7 ( 中国科学院上海植物生理研究所) c e l l u l a s eo n o z u k ar - 1 0 ( k i n l dy a k u l tm a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a ，j a p a n ) c e l l u l a s eo n o z u k ar s o c i n k iy a k u l tm a n u f c o l t d , n i s h i n o m i y a ，j a p a n ) m e i c e l a s ep ( m e i j is e r k ak a i s h al t d ，t o k y o ，j a p a n ) c e l l u l y s i n ( c a l b i o c h e m ，c a l i f o r m i a9 2 0 3 7u s a ) c e l l u l a s e ( s i n m ag e r m a n y ) d r i s e l a s e ( k y o w ah a k k ok o g y oc o j a p a n ) ( 2 ) 果胶酶 p e c t o l y a s ey - 2 3 ( k i k k o m a ns h o y uc o ，j a p a n ) m a c e r o z y m e r 一10 ( k i n k iy a k u l tm a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a , j a p a n ) m a c e r o z y m e ( y a k u l tb i o c h e m i c a l sc o ，j a p a n ) p e c t i n a s e ( s i g m au s a ) p a t e ( p e c t i c a c i d - a c e t y l t r a n s f e r a s e ) ( h o e c h s t ，g e r m a n y ) p e c t i n a l ( r o h ma n dh a a sc o i n d ep e n d e n c eh a l lw e s tp h i l a d e p h i a p a 19 10 5 u s a ) ( 3 ) 半纤维素酶 h e m i c e l l u l a s eh 2 1 2 5 ( s i g m au s a ) r h o z y m el i p - 15 0 ( r o h ma n dh a a sc o p h i l a d e l p h i a ，p e n n s y l u a n i a l9 10 5 u s a ) ( 4 ) 崩溃酶它是一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活力。 9 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 ( 5 ) 蜗牛酶它主要用于体细胞原生质体的制备。 在商品酶制剂中通常含有一些杂质，影响酶的活性及原生质体的质量。因此在使用前 多将酶液在4 下通过bi o g e lp 6 或s e p h a d e xg - 2 5 ( 2 0 0 4 0 0 孔) 进行脱盐纯化。酶 制剂中也常含有核糖核酸酶影响原生质体活力，因此要适当降低酶解的温度或缩短酶 解的时间，来提高原生质体活力。 1 1 3 2 分离原生质体常用的渗透压稳定剂 植物细胞壁对细胞有着良好的保护作用，除去细胞壁后如果酶液中的渗透压和细 胞内的渗透压不平衡，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗 透压应大致和原生质体内的相同或接近，一般渗透压略大些有利于原生质体的稳定， 过大会使原生质体收缩，并阻碍原生质体的启动分裂。 在配制酶液、洗液和培养液中广泛使用的渗透压调节剂主要有山梨醇、甘露醇 嘶2 6 1 ，浓度约在0 3 0 8 m o i l 。其它一些碳水化合物，如：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖都 具有相同的稳定渗透压的作用。当用非金属离子作渗透压稳定剂时，常在酶液中加入 一定量的盐。例如，加c a c l 。( 5 0 - 、l o o m m o l l ) 可以大大提高细胞膜的稳定性。葡聚糖 硫酸钾，k h 2 p 0 4 及m e s 都可以提高原生质体的稳定性和活力。另外，牛血清蛋白可减 少或防止降解细胞壁过程中细胞器的破坏。 酶液p h 也相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其p h 分别以5 4 及5 8 为 宜，混合使用时以p h 5 4 5 6 为宜。p h 降至4 8 以下时，易造成原生质体破裂，酶液 配制后需以0 2 0 4 5 p m 无菌微孔过滤器过滤除菌，不能采用加热来头菌。 1 1 4 植物原生质体的纯化 酶解后的原生质体混合液中常含有多种杂物，如未去壁的细胞、细胞团、细胞器 以及细胞碎片等，需用不锈钢网或尼龙网( 2 0 0 4 0 0 日) 滤出较大杂物，然后将含有 酶液的原生质体混合物收集在离心管中，于1 0 2 4 r r a i n - 1 ( 1 0 0 9 ) 离心机上离心5 m i n ， 使原生质体沉于管底，弃去上清液，再用洗液( 除不含酶外，其他成分和酶液相同) 反复离心洗涤3 。4 次，最后用原生质体培养液洗涤，备用。经过纯化的原生质体可以 配在一定的浓度用于培养。 1 1 5 植物原生质体产量和活力鉴定 在原生质体培养前，需对原生质体的产量和活性进行检测。无论是原生质体培养 1 0 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 还是体细胞杂交都需要一定密度的原生质体悬浊液，因此测量原生质体的产量是必不 可少的，一般测量原生质体的产量用血球记数法，对于活力的鉴定一般根据形态特征 即可判断原生质体的活力。如果把形态上完整、富含细胞质、颜色新鲜的原生质体放 入低渗透压洗涤液或培养基中，可见到分离后缩小的原生质体复原。若成为正常膨大 的，一般是有活力的原生质体。来源于叶片者，呈绿色及圆而鼓者为活原生质体；来 源于愈伤组织及悬浮细胞者，胞质内原生质体环流及布朗运动活跃者活力较高。 此外，也可采用特异的染色方法来确定。用0 1 酚番红或伊文思蓝染色，不着色 者为活原生质体，染色者为无活力原生质体。目前比较可靠而方便的是采用荧光素双 醋酸醋( f d a ) 染色法。f d a 本身无荧光，无极性，它能自由透过完整的原生质体膜， 一旦进入原生质体后，便会受到细胞内酯酶的分解，产生有荧光的极性物质一荧光素， 它不能自由透过细胞膜而滞留于原生质体中。如在显微镜下观察，有活力的原生质体 带有荧光，无活力的不产生荧光。