（环境工程专业论文）食品企业污水中细菌的基因芯片快速检测技术.pdf

卜海大学硕士学位论文菌具有良好的重现性。用实验制备的基因芯片对模拟水样检测的结果与疾控中心配制的菌液相比较，准确率】0 0 ，说明该基因芯片对目的细菌特征基因的检测结果是可靠的，并用陔方法对从实际水样中分离的细菌进行了检测，具有高准确率。该项技术的建立为今后更大规模的检测研究奠定了基础。关键词：食品企业污水；基因芯片；细菌；p c r 反应；杂交a b s t r a c tt h e r ea r ea l lk i n d se lo r g a n i ca n di n o r g a n i cc o n t a m i n a t i o n si nw a s t ew a t e ro ff o o de n t e r p r i s e a tt h es a m et i m e ，t h e r ea r el o t so fb a c t e r i ai ni ts u c ha se s c h e r i c h i ac e l l 、p a t h o g e n i cb a c t e r i t i mt h a tm a ye x i s ta n do t h e rb a c t e r i a ，s o - t h ew a t e ri sn m d d ya n dd i r t ym e a n w h i l e ，b e c a u s et h es e w a g ed i s p o s a le f f i c i e n c yi sl o w ( o n l ya b o u t2 0 3 0 ) ，n l o s to ft h e md i r e c t l yo ri n d i r e c t l ye n t e rt h ew a t e rw i t h o u td e a l i n gc a r e f u l l yw i t h t h ew a s t e w a t e rw i l lw o r s e nw a t e rq u a l i t ya n dp o l l u t et h ee n v i r o m n e n ta n dt h ep a t h o g e n sc o n t a i n e di ni tc a nr e s u l ti ne p i d e m i cd i s e a s e sw h i c hw i l lt h r e a t e nt h eh u m a nh e a l t hs e r i o u s l y t od e t e c tt h eb a c t e r i u mi nw a s t ew a t e ro ff o o de n t e r p r i s eq u i c k l ya n da c c u r a t e l y ,ar a p i dp r o d u c eb a s e do nt h eg e n c c h i pt e c h n o l o g yw a ss e tt i pw es e p a r a t e da n dp u r e b r e d l yi n c u b a t e dt h eb a c t e r i aa f t e rg a t h e r i n gt h ew a t e rs a m p l e sf r o ms o m ef o o de n t e r p r i s e si ns h a n g h a i w eg o t3 8p u r e b r e db a c t e r i af r o mt h ef i r s tb a t c ha n d2 0p u r e b r e db a c t e r i af r o mt h es e c o n db a t c h a f t e ri d e n t i f i c a t i o n ，v eg o t12p u r e b r e db a c t e r i at o t l y m o s tb a c t e r i ag o tf o r mt h ee x p e r i m e n tw e r eg r a mn e g a t i v eb a c i l l u sa n dm o s to f t h e mw e r eo b l i g a t ea e r o b e ，t h eo t h e r sw e r ef a c u l t a t i v ea e r o b ea n dt h e r ew a s n ta n ya n a e r o b ei nt h ee x p e r i m e n ti nt h ee x p e r i r n e n t ，e i g h tp a i r so fs p e c i a lp r i m e r sw e r ed e s i g h e da n dw es u c c e s s f u l l yd i v i d e dt h e mi n t ot w os e t st op e r f o r mt i mm u l t i p c re f f e c t i v e l y ：p r i m e ri ( k p + h l y a + i n v a + i p a h ) ，p r i m e ri i ( c a d c + o p r i + e n t + 2 3 s r r n a )t h r o u g ho u re x p e r i m e n t ，t h es u i t a b l ep c rr o t a t i o nn u m b e r sw a s3 5c y c l e sa n dn l es u i t a b l eh y b r i d i z a t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 8 。cw ea l s of o u n dt h a tt h eb e s tl o t i o nw a sl o t i o naa n dl o t i o nb a m o n gs e v e nk i n d so fb a c t e r i at h a ti n v o l v e si nt h i se x p e r i m e n t ，e l5 7 ：h 7e s c h e r i c h i ac e l l sa n ds a h n o n e l l a sm e a s u r i n gd e n s i t yw e r e10 - 3 1 1 t g m l ，w h i c hr e a c h e dt h ep gg r a d ei nt h ee n t i r l ya m p l i f i c a t i o ns y s t e m ，a n de v e nt h ek l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 、p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s c t 、e n t e r o c o c c z t sa n ds h i g e l l at h a th a v evr e l a t i v e l yl o ws e n s i t i v e n e s st h e i l m e a s u r i n gl i m i t a t i o nw e r e10 u g m lt h es e n s i t i v e n e s st h a tt h eg e n e c h i pm a d ei nt h ee x p e r i m e n to nt h ep u r p o s eb a c t e r i ai sh i g hw ec h o o s e dk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 、e s c h e r i c h i ac e l la n ds a b n o f t e l l aa tr a n d o ma st h er e p r e s e n t a t i v e st oc a r r yo nt h er e p e a t e dm e a s u r i n ge x p e r i m e n to ft h eg e n e c h i p t h e n ，a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so ft h ep c rr e a c t i o na n dt h eg e n e c h i ph y b r i d i z a t i o n ，w ec a nv e r il yt h er e p e t i t i v e n e s so ft h eg e n e c h i pm e a s u r er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e c h i pp r e p a r e di nt h ee x p e r i m e n th a v eg o o dr e p e t i t i v e n e s sw h jl eu s e dt on l e a s u r ea b o v e m e n t i o n e dt h r e ek i n d so f b a c t e r i a i nt h es i m u l a t i o nd e t e c t i o n ，t h ec o r r e c t i o no fo u rg e n e c h i pw a s1 0 0 ，w h i c hm e a n st h a tt h ed e t e c t i o nr e s u l t so fo u rg e n e c h i pw e r er e l i a b l e w h e nu s e di nm e a s u r ew a s t ew a t e ro ff o o de n t e r p r i s e ，i ts h o w sh i g hc o r r e c t i o nt h es e t t i n g u po ft h i st e c h n o l o g yh a se s t a b l i s h e dt h ef o u n d a t i o nf o rm o r ee x t e n s i v em e a s u r i n gr e s e a r c hi nt h ef t l r l l j r ek e yw o r d s ：w a s t ew a t e ro ff o o de n t e r p r i s e ；g e n e c h i p ；b a c t e r i u m ；p c rr e a c t i o nh y b r i d i z a t i o nv原创性声明本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰写过的研究成果。参与同工作的其他同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：生日盘堡日期：主型：! ：曼本论文使用授权说明本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)魏越铷虢鞯蹦l 海大学硕：h 学位论文第一章前言1 1 概述食品企业污水中含有各种无机污物和有机污物，同时还含有很多细菌，包括大肠杆菌、可能存在的致病细菌 如肉类3 n _ - 1 2 污水中可能含有粪大肠杆菌( f e c a lc o l i f o r m ) 、粪链球菌( s t r e p t o c o c c u sf a e c a l i s ) 、葡萄球菌( s t a p 砂l o c o c c u sm 埘) 、志贺氏菌( s h i g e l l ad y s e n t e r i a e ) 干d 沙门氏菌( s a l m o n e l l a ) 等 和杂菌等( 叶祝年等，2 0 0 0 ： 二颂明，2 0 0 2 ) ，因此水质混浊而脏臭。同时，由于污水处理效率低( 估计仅为2 0 3 0 ) ，大部分污水未经妥善处理就直接或间接排入水体，恶化水质，污染环境，其中夹带的致病菌，将导致多种疾病的爆发和流行，严重威胁着人类的健康( j o o nm y o n gs o n g ，2 0 0 4 ；l e v e n t eb o d r o s s y ，2 0 0 4 ) 。1 2 食品企业污水处理方法概述现行的食品企业污水处理方法主要有s b r 法( 序批式活性污泥法) 、a b 法( 吸附一生物降解工艺) 、生物膜法、生物滤池、生物转盘、生物流化床、u a s b法( 升流式厌氧污泥床) 等方法。上述方法对处理水中的重金属、氮、磷、硫等污染物各有作用，实际使用中通常是将几种方法结合起来，以获得更有效的处理结果。但是现行的处理方法使用了大量活性污泥和生物转盘等方法，虽然出水的c o d 。，、b o d 5 等指标都有了很大的降低，达到甚至远远低于国家或地区标准，但是出水中的细菌群落还是大量存在，而其中更有不少除大肠杆菌以外的致病菌；同时也不能够排除活性污泥本身孳生的细菌排放到出水中去的情况。1 3 污水综合排放标准及其不足当前，中华人民共和国国家标准一一污水综合排放标准( i n t e g r a t e dw a s t e w a t e rd i s c h a r g es t a n d a r d ) g b 8 9 7 8 1 9 9 6 中对于污水的定义是“指在生产与生活活动中排放的水的总称”，而其中明确标注的5 6 类污染物中涉及细菌群落的只有“粪大肠菌群数”，其余的大部分都是详细的具体污染物类型或指标( 例如：p h 、色度、悬浮物、b o d 5 、c o d 、硫化物、氨氮等等) ，而且对于“粪大上海大学坝： 学位论文肠菌群数”也仅限于针对5 0 个床位以上的医院、兽医院及医疗机构含病原体污水或传染病、结核病医院污水，其他工业污水中的细菌群落并没有详细涉及到。另外，在参考了上海市地方标准污水综合排放标准d b 3 1 1 9 9 1 9 9 7 后，可以看到，对于大肠杆菌数的测定方法为发酵法，而且并没有注明测定标准，只能够执行g b 8 9 7 8 1 9 9 6 中对于数量的界定。然而，目前通用大肠菌群作为水体受致病菌污染的指标是有一定缺陷的。事实上，其中的大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，有些菌株如0 1 5 7 ：h 7 型大肠杆菌是极毒菌株( 陈纯，2 0 0 4 ) ，在日本、美国曾多次由0 1 5 7 ：h 7 型大肠杆菌引起爆发性传染病。而且有时测总大肠菌群呈阴性，却不能确切证明无致病菌。同时，对出厂水，由于灭活各类细菌要求的温度不同，大肠菌群符合标准不等于就是安全出厂水。据1 9 9 1 年美国的一项流行病调查，肠道病的3 5 是由于水污染引起的( w e iy ，2 0 0 1 ) 。细菌尤其是致病菌的实际风险比有毒有害物质高得多，为了控制致病菌风险，美国制订了多项规则和标准，目的是把主要致病菌的风险降到每年每万人发生1 个病例( gr a m s a y , 2 0 0 0 ) 。1 4 传统细菌检测方法及其缺陷若想有效控制食品企业污水对水体环境的污染，快速而准确地检测食品企业污水中细菌是关键的技术基础之一。传统的细菌分离、培养鉴定技术，操作烦琐且耗时睦，并且由于培养技术的局限使得一些细菌难以培养和检测，因此灵敏度很差：传统的一些分子生物学技术也存在着弊端，如免疫学方法和探针杂交技术存在特异性或敏感性的问题，常规p c r 方法一次也只能检出一种微生物( 马立人，蒋中华2 0 0 1 ；e c k m a n nl “a l2 0 0 0 ) 。因此，本课题尝试利用基因芯片技术来快速检测食品企业污水中的常见细菌。1 5 基因芯片的相关概念、原理和分类1 5 1 基因芯片的概念和原理基因芯片( g e n e c h i p ) 又称d n a 芯片( d n a c h i p ) ，或d n a 阵列( d n a a r r a y )( f o d o rs p a ，j9 9 1 ) ，是生物芯片研究中最先实现商品化的产品，它是在基因探针的基础上研制出的。所谓基因芯片是指利用大规模集成电路的手段控制固相上海大学硕= 匕学位论文合成的成千上万个寡核营酸探针，并把它们密集、规律地排列在1 c m 2 大小的硅片或玻璃晶片上，其容量可达2 0 4 0 万个基因探针( 王剑霓等、2 0 0 5 ；1 c h i k a w aj k ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。然后将荧光标记的d n a 或c d n a 样品在芯片上与探针杂交，经激光共聚焦显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所需的信息，这比常规方法快几十到几千倍( c a m p a sm 2 0 0 4 ；文4 旭光2 0 0 5 ) 。1 5 2 基因芯片的分类1 5 2 1 按照载体材料分类按照载体材料的不同，基因芯片可分为玻璃、硅片、陶瓷和尼龙膜芯片等。1 5 2 2 按照制作方法分类按照芯片制备方法的不同，基因芯片分为两大类，即原位合成芯片和直接点样芯片。前者是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针：后者是指将已经合成好的探针固定在芯片上。1 5 2 3 按照载体上所点d n a 种类分类按照载体上所点d n a 种类的不同，基因芯片可分为c d n a 芯片和寡核昔酸芯片两种。前者可以提供待测组织的基因表达谱，即组织中基因整体的表达情况：后者则主要是通过检测疾病相关基因突变或者表达改变等信号来诊断疾病的发生。目前，将基因芯片技术应用于临床医学研究，正成为基因芯片研究领域的热点课题( 口：卟军，2 0 0 4 ；顾明亮，2 0 0 3 ； - 3 永强，2 0 0 0 ) 。1 5 2 4 根据d n a 芯片的性能及用途分类可分为两类：第一类是以硅或玻璃作承载基片，通过微加工技术，在其上刻出微米级宽度的通道，在电场的作用下形成微芯片毛细管电泳体系，也可在芯片上刻蚀出微型反应池进行p c r 等反应，此为毛细管型微j 占片；第二类芯片是用硅、玻璃、多孔硅、聚丙烯等材料作承载基片，经化学方法在其上“挂”满密集的寡核苷酸阵列，此即为基因探针型微芯片( 陈弧利、1 9 9 8 ) 。1 6 基因芯片技术在国内外的研究发展动态1 9 9 1 年a f f y m e t r i x 公司f o d o r 领导的小组对原位合成制备的d n a 芯片作上海大学顺：f = 学位论文了首次报道( f o d o rs p a ，“a 19 9 1 ) 。他 f i l 币t l 用光刻技术与光化学合成技术相结合制作了检测多肽和寡聚核苷酸的微阵列( m i c r o a r r a y ) 芯片。用该方法制作的d n a 芯片可用于药理基因组学研究与基因重复测序工作。这一突破性的进展使生物芯片技术在世界范围内开始得到重视。第一篇成熟的d n aj 卷片检测技术论文发表在1 9 9 5 年的s c i e n c e 杂志上( s c h e n a m 。e la t ，1 9 9 5 ) 。用d n a 芯片技术还成功地检测了酵母菌的全部c d n a和1 0 6 4 个人类基因r s c h e n am ，1 9 9 6 ) 。在d n a 芯片的研究过程中，很多公司都开发了具有自身特色的技术。最早涉足该领域的a f f y m e t r i x 公司已开发了多种基因j 卷片，部分芯片己投入商业应用，如用于检测h i v 基因与p 5 3 肿瘤基因突变的芯片，还有用于研究药物新陈代谢时基因变化的细胞色素p 4 5 0 芯片。c a l l 等( c a l ld r ，e ta l ，2 0 0 1 1 用基因芯片和确定大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 基因分型敏感性和特异性的实验结果表明，基因芯片的敏感性是凝胶电泳的3 2 倍以上，并提示用玻璃基片的基因芯片检测多重p c r 产物是一种相对简单，但又快速、敏感的新方法。c h o 等( c h oj c ，e ta l ，2 0 0 1 ) 发展了一科堪于随机基因组片段的d n a 芯片技术方法，将四种参考荧光假单胞菌种的基因组d n a 均打碎成6 0 - 9 6 k b 的基因组片段，点到芯片上。然后将1 2 株已鉴定的荧光假单胞菌株的基因标记和上述d n a 芯片进行杂交，结果显示此d n a 芯片能将被检测细菌区分到种水平，表明此方法在鉴定细菌和确定细菌之间遗传学距离方面都很有效。由于基因芯片技术的广阔应用前景和可能产：生的巨大的经济效益，目前美国、英国、日本的一些国家实验室及公司都争相加入这个领域的研究和开发。1 9 9 8 年，美国由n i h ( 国立卫生研究院) 、n c b i ( 美国国家生物技术信息中心)等国立研究院制订了d n a 芯片开发计划。1 9 9 8 年1 2 月，a f f y m e t f i x 公司和m o l e c u l a rd y n a m i c s 公司宣布成立基因分析协会( g e n e t i ca n a l y s i st e c h n o l o g yc o n s o r t i u m ) 以建立一个统一的技术平台，生产更有效而价廉的设备( h a c i ajg 1 9 9 6 ) 。英国的a m e r s h c e mp h a r m a c i a b i o t e c h n o l o g y 公司也宣布将提供部分已掌握的技术以推动这项技术的应用。以基因芯片技术为核心的各相关产业正在上海大学硕：l 学位论文全球崛起，世界工业发达国家已开始有计划、大投入地对该领域的知识产权进行保护( 王业甯，2 0 0 3 ) 。我国刺基因芯片技术也非常重视，党和国家领导人专门听取生物芯片技术的专题报告，科技部把生物芯片开发作为重点资助项目。目前有一些科研院所和大学如清华大学、复旦大学、军事医学科学院、中科院上海细胞所等，一些公司如上海博道、深圳益生堂等已经着手进行生物芯片的研究和设计。虽然我国该技术的研究起步较晚，但经过近几年的发展，也取得了一定的成绩，例如以复旦大学为技术依托的上海博道基因技术有限公司在国际上已有的以玻璃为载体，双荧光检测为特征的基因芯片技术基础上，优化了一套独特的基因芯片制备与分析检测技术，制备了含有4 0 0 0 种全长新基因共计8 0 0 0 个点的研究基因表达谱的：i j ! ；：片，用于新基因组织表达差异的分析，已经取得较大的进展( 白东亭，2 0 0 0 ) 。我国从二十世纪末开始生物芯片技术方面的研究，在芯片结构设计、基片修饰、探针设计、探针固定、样品采集、杂交和检测等方面都有较大的进展，已研制出有一定实用意义的基因芯片及其检测仪样机。目前，从公开的专利文献上可查到的相关专利申请中，一些技术内容大体相似，基本上是引进了国外现有专利技术的思路。少数专利申请有一定的创新，反映了我国生物j 舂片技术目前的发展水平( 王业富，2 0 0 3 ；徐炳森，2 0 0 0 ) 。1 7 本课题的科学技术价值和创新点在现有技术中，污水中细菌的检测主要是利用传统微生物学方法、生物化学方法、血清学方法和p c r 方法( s a n t i a g of g o n z a l e z ，e la 1 2 0 0 4 ；c a l l ，d ，2 0 0 3 ) 。这些方法有一些限制：( 1 ) 由于需要培养，所需时间长；( 2 ) 不能区别亲缘关系相近的细菌；( 3 ) 不能鉴定未知的细菌；( 4 ) 交差反应和其他假阳性；( 5 ) 灵敏度问题( 假阴性) 。而利用基因芯片技术快速检测细菌对环境、人体、动植物的污染和危害，可高效地探测到由细菌引起的污染，还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。我们都知道，环境的变化会引起细胞发生基因表达水平的变化，基因芯片是高效的监测基因表达变化的手段。所以，国外许多实验室纷纷探索用d n a 微阵列技术监测环境污染和提高环境保上海大学砸二b 学位论文护技术水平。与传统方法相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：( 1 ) 基因j i ! ! ；片可以对污水中细菌实现高通量、并行检测，一次实验即可得出多个结果；能提高测试样品数量5 1 0 倍，另外测试成本能下降约1 0 倍；( 2 ) 操作简便、快速，整个检测在数小时内可以完成，而传统的方法一般需要4 7 天的时间；( 3 ) 特异性强、敏感性高，可以检测污水中常见的致病菌；( 4 ) 可以区分到细菌的属和种( 翟俊精：等2 0 0 3 ) 。本课题是上海市科委重点攻关项目“水中微生物的快速临测技术”f 0 4 2 3 1 2 0 0 9 ) 课题中的一个部分，通过研制基因芯片( g e n e c h i p ) 用于食品企业污水中细菌( 致病菌) 的快速检测，以上海市主要食品企业污水为主要检测对象，达到快速检测的目的，形成具有自主知识产权的污水中细菌快速检测产品，可以替代现有常规复杂的检测技术和产品，服务于环境监测，造福于社会。上海大学硕：l 学位论文第二章材料与方法2 1 实验材料2 1 1 水样来源从上海绿苑淀粉有限公司( 代号d ) 、上海梅林食品有限公司( 代号m ) 、上海冠生园华光酿酒药业江湾药酒厂( 代号g ) 等三家企业取得生产污水处理前后水样各两份( 包括1 2 月份冬季水样和3 月份春季水样) ，分别命名为水样d i 、d o 、m i 、m o 、g i 、g o ，放入4 c 的冰箱冷藏室待用。2 1 2 菌株来源选取食品企业污水中常见的肺炎克雷白菌、大肠杆菌、荧光绿脓杆菌、肠球菌、0 1 5 7 ：h 7 型大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌共计7 个菌种作为本实验研究的对象。其中肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌和肠球菌为我们从部分食品企业现场采集的污水水样中培养分离出的纯种菌株，其余菌株由上海生物芯片国家工程研究中心提供。2 1 3 主要试剂和仪器设备2 1 3 1 主要试剂氯化钠( n a c i ) ：上海化学试剂有限公司a r牛肉浸膏( b e e f e x t r a c t ) ：上海化学试剂公司b r蛋白胨( p e p t o n e ) ：上海东海制药厂b r琼脂( a g a r o p h y t e ) ：福建泉州市泉港化工厂裂解液：取异硫氰酸胍( c h s n 3 c h n s ) 4 7 2 6 4 9 ，醋酸钠( c 2 h 3 0 z n a 3 h 2 0 )1 3 6 9 ，n - l a u r o y l s a r o s i n e s o d i u ms a l t ( 一种市售去污剂) 0 2 9 ，异丙醇( c 3 h 8 0 ) 1 7 m l ，以双蒸水定容至1 0 0 m l 。、3 mn a a c ( p h 5 2 ) ：称4 0 8 9n a a c 3 h 2 0 置于1 0 0 2 0 0 m l 的烧杯中，加入上海大学硕二卜学位论文约4 0 m l 的去离子水搅拌。加入冰醋酸调节p h 至5 2 ，定容至1 0 0 m l ，高温高压灭菌，室温保存。2 0 x s s c ：称柠檬酸钠( c 6 h 5 n a 3 0 7 2 h 2 0 ) 8 8 2 9 ，n a a e1 7 53 9 ，a n x 约8 0 0 m l水，充分搅拌溶解，调节p h 为7 0 后，加双蒸水定容至1 l ，高温高压灭菌。1 0 s d s ：称1 0 9s d s ( c i 2 h 2 5 n a 0 4 s ) 于1 0 0 2 0 0 m l 烧杯中加入约8 0 m l去离子水，6 8 。c ) j h 热溶解。滴加数滴盐酸调节p l i 至72 ，定容至1 0 0 m l ，室温保存。d n a 杂交液：取2 0 xs s c3 0 m l ，5 0 x d e n h a r t s1 0 m l ，1 0 s d s5 m l ，1 0 m m ls a l m o nd n al m l ，去离子水5 4 m l ，充分混匀后，用0 4 5 u m 滤膜去杂质后备用。洗液a ：o 1 s d s ，2 s s c ( 1 0 s d so 5 m l ，2 0 x s s c5 m l ，用去离子水定容至5 0 0 m 1 )洗液b ：2 xs s c ( 2 0 x s s c5 m l ，用去离子水定容至5 0 0 m 1 )p c r 试剂t a k a r a 公司产品c y 3a m e r s h a m 公司产品其余实验室常用试剂来自上海试剂厂2 1 3 2 主要仪器设备可调节移液枪德国e p p e n d o r f 公司产品芯片上海生物芯片有限公司产品台式高速冷冻离心机d 一3 7 5 2 0o s t e r o d e德国h e r a e u s 公司产品恒温培养摇床h w y z l l上海智诚仪器公司产品水平电泳上海医用分析仪器厂产品p c r 仪t 3 t e r m o c y c l e rb i o m e t r a 公司产品针式接触点样仪g e n em a c h i n eg e n e m i cl n s t r u m e n t a i t o ns e r v i c e i n c 扫描仪s c a n a r r a y 4 0 0 0p a r k a r d 公司产品上海大学颂士学位论文2 2 实验方法2 2 1 对部分食品企业污水中致病细菌的检测，鉴定为了了解目前本市食品企业污水中细菌的现状以及经过传统处理后污水中致病菌的情况，对部分食品企业的污水进行采样、细菌纯种分离、培养和鉴定。2 2 1 1 采样。水样来源：分别从d 、m 、g 三家企业取得生产污水处理前后水样各两份( 包括1 2 月份冬季水样和3 月份春季水样) ，分别命名为水样d i 、d o 、m i 、m o 、g i 、g o ，放入4 。c 的冰箱冷藏室待用。2 2 1 2 培养基的制作和灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏o 7 5 克，蛋白胨1 5 克，氯化钠o7 5 克，琼脂3 克，蒸馏水1 5 0 m l ，p h 76 。取3 0 0 m l 的烧杯个，装1 5 0 m l 的蒸馏水。在药物天平上依次称取上述配方中的各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融化后停止加热，补充蒸发损失的水量。用1 0 的n a o h 调整p h 值为7 6 。将培养基分装5 只试管中，其余的全部倒入2 5 0 m l 的锥形瓶中，分别塞上棉塞，包上报纸待灭菌。配置无菌稀释水：取2 5 0 m l 的锥形瓶装9 0 m l 的蒸馏水，放3 0 颗玻璃珠，塞棉塞，包扎，待灭菌。本实验中使用高压灭菌锅进行灭菌：将需消毒灭菌的物品放入加好水的高压灭菌锅中，旋紧锅盖，通电，关上安全阀，打开放气阀。待冷空气放出后，关上放气阀，维持气压在1 0 5 k g c m 2 ( 约1 2 6 c ) 3 0 r a i n 后，关电源，放气，打开盖子取出己灭菌物品放入无菌室内。无菌室内紫外灯打开照射3 0 r a i n 灭菌，以下操作均在无菌室中进行。2 2 1 _ 3 污水中细菌纯种分离和培养取1 0 m l 水样，按梯度稀释后，选择适当的稀释度分别在培养基上涂平板( 每一梯度3 皿) ，再置于3 0 v 的培养箱中培养。2 4 小时后挑取不同类型的单个菌落，在培养基平板上连续纯化，从而得到纯培养，于4 保存于培养基斜上海大学硕：卜学位论文面上待用周群英等，2 0 0 0 ：何池金等，1 9 9 7 ) ( 菌种分离结果见表3 一l 表3 4 ) 。根据选取菌种的来源、序号、分离次数为依据，对菌种进行命名，其中来源为各个水样的代号( d i 、d o 、m i 、m o 、g i 、g o ) ，序号以大写英文字母标号，分离次数用阿拉伯数字表示，三个代号中间以“一”连接。如果某个培养皿中分离出多个菌种，则在原有序号后再补充一位。例如：g i 一从一3 ，表示g i 水样第a 个分离培养皿中又分离出来的a 菌种，分离次数达到3 次。以上命名原则仅作为菌种标号参考，存在同一种菌种由于来自不同样品而有不同的名称可能性。2 2 1 4 菌种鉴定1 ) 细菌涂片的制作涂片：取干净的载玻片于实验台上，在正面边角编号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后按编号从平面培养基挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。干燥：最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。固定：将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2 3 次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。2 ) 革兰氏染色法基本原理及操作( l ) 基本原理：革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法，是1 8 8 4 年由丹麦病理学家c h r i s t a i ng r a i n 创立的，它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。其简单操作是：先用初染色剂进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇( 或丙酮) 脱色，最后用复染剂( 番红) 。经此方法染色后，细胞保留初染色剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色( 红色) ，该菌属于革兰氏阴性菌。上海火学预= 卜学位论文革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞细胞壁的结构和组成不同决定的。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，由于这两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂质含量低，用乙醇( 或丙酮) 脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量较高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇( 或丙酮) 溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗出来，用复染剂复染后，细胞容易染上复染剂的红色( 周群英等，2 0 0 0 ) 。( 2 ) 仪器和材料：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、9 5 乙醇、番红染液( 3 ) 革兰氏染色操作步骤：制片：取菌种培养物常规涂片、干燥，固定。( 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色：涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜) 。初染：滴加结晶紫( 以刚好将菌膜覆盖为宜) 染色l m i n ，水洗。媒染：用革兰氏碘液冲去残水，并用革兰氏碘液覆盖约1 m i n ，水洗。脱色：用滤纸吸去纸上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加9 5 的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗。( 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。) 脱色时问一般为2 0 3 0 s 。复染：用番红染液复染l m i n ，水洗。上海大学砸：l 学位论文镜检：干燥后，用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。综上所述，染色的基本程序如下：制片一固定一媒染一染色一脱色一复染一水洗一二f 燥一镜检( 染色结果见图3 - 2 、图3 - 3 ，以及表3 5 表3 8 ) 。3 ) 葡萄糖氧化发酵法在细菌的分类鉴定中，糖发酵产酸是一项重要依据。后来发现细菌从糖类产酸并不都是发酵产酸，并不都是不需要分子氧作为最终受氢体。以分子氧作为最终受氢体的那些菌产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的氨所中和，而不表现产酸。为此，休和利夫森( h u g h 和l e i f s o n )二氏提出一含有低有机氮的培养基，用以鉴别细菌从糖类产酸是氧化性产酸还是发酵性产酸。这一实验广泛用于细菌分类鉴定，一般用葡萄糖最为糖类代表。也可利用这一基础培养基测定细菌从其它糖或糖醇类产酸的特性。休和利夫森二氏培养基中仍有少量蛋白胨，对产酸弱但利用葡萄糖生长的细菌所产的酸仍表现不出来。博得和霍尔丁( b o a r d 和h o l d i n g ) 二氏改用无机氮修改了休和利夫森二氏的培养基。后一培养基可以把产酸和生氏一致起来。文献中使用休和利夫森二氏培养者较多( 东秀珠等编著，2 0 0 1 ) 。( 1 ) 培养基：休和利夫森( h u g h 和l e i f s o n ) 二氏培养基n h 4 h 2 p 0 40 , 5 9 、k 2 h p 0 40 5 9 、酵母膏o 5 9 、葡萄糖1 0 o 卧琼脂5 6 9 、溴百里酚蓝( 溴麝香草酚蓝) 1 水溶液3 m l ( 先用少量9 5 乙醇溶解后，再配成1 的水溶液) 、蒸馏水1 0 0 0 m l 。9 堕7 0 7 2 ，分装试管，培养基高度约4 5 c m ，1 1 5 蒸汽灭菌2 0 r a i n 。以上两种培养基中所用的糖类，严格醴应配成1 0 水溶液，过滤灭菌后，用无菌操作将糖液加到试管中，使培养基中糖浓度达到1 。然后在沸水中使培养基融化，将糖液摇匀，放冷后备用。实践证明，把葡萄糖直接加入培养基中，用1 1 5 蒸汽灭菌2 0 m i n ，对大部分常见异养菌也还是可行的。( 2 ) 接种：i 以1 8 2 4 h 幼龄菌作为种子，穿刺接种，每株4 支。上海大学硕：l 学位论文m 穿刺接种：穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法( 见图2 1 ) 。图2 - i 穿刺接种f i g2 - ip u n c t u r ei n o c u l a t i n g用接种针( 必须挺直) 挑取少量菌种，将接种针自培养基中心垂直的刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针缓慢地抽出，塞上棉塞，烧红接种针，则接种完毕。m 其中2 只用灭菌的凡士林石蜡油( 熔化的2 3 凡士林中加入l 3 液体石蜡，高压灭菌) 封盖，约o 5 1 c m 厚，以隔绝空气为闭管。另2 支不封油为开管，同时还要有不接种的闭管和开管作为对照。j v 将所有的试管直立于试管架上，于3 0 。c 生化培养箱内培养l 、2 、4 、6天观察结果。( 3 ) 结果检查：只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵性。本实验可同时观察细菌的运动性，观察运动形式琼脂软硬必须合适，我们实验中所用的琼脂( 乘风牌琼脂条1 0 0 9 装) 以0 5 0 6 为宜，其它牌号的琼脂则需经实验决定使用浓度。琼脂的浓度以放倒试管不流动，轻轻敲打则琼脂柱一i z 海大学顺：卜学位论文破碎为宜。如培养基制好后，在温度较低的地方存放，在使用前应在沸水中溶化，并用冷水速凝后立即使用，否则溶于培养基中的空气会干扰观察发酵产酸的结果。4 ) 运动性检查半固体琼脂穿刺法根据有鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游动却不能任意游走的现象，观察细菌生长情况，判定是严峻是否有具有运动性。可试用试验菌能良好生长的培养基，在其中加入0 3 0 6 的琼脂，( 所用的琼脂可因牌号不同而异) 一般半固体培养基应是放倒试管不流动，而在手上轻轻敲打时琼脂即破裂为宜。对一般常见细菌可结合葡萄糖氧化发酵试验观察运动性。用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内，适温培养。细菌的运动型可用投射光目测。如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性。对生长快的细菌应培养1 天后观察。如第一天不能判定可在第2 3 天再观察。如2 3 天时仍不能判定是否有动性，可延迟5 - 6 天再观察一次。因为游动力弱的细菌，在半固体培养基中第1 2 天中尚不能从穿刺线游开，故需多培养几天观察。如试验菌在半固体培养基中产气，气泡会将穿刺线上的生长物扩散，不可误将不运动的细菌判为有运动性。如试验菌是好氧细菌，穿刺线上生长物很少，可检查从培养基表面向下渗入的生长物情况( 结果见表3 - 9 表3 1 1 ) 。5 ) 纯化菌种送检由于本实验室内设备和技术有限，具体的菌种名称必须外出送检才可获得，此次实验选定上海疾病预防与控制中心进行鉴定( 鉴定结果见表3 1 2 、表3 1 3 ) 。2 2 1 5 菌种保留技术斜面接种是从生长好的菌种斜面( 或平板培养基) 上挑取少量菌种移植至另一只新鲜斜面培养基上的一种方法。作为实验室最常用的- - ；f 0 0 保藏方法，适于保藏细菌。具体操作如下：1 ) 贴标签：接种前在使试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2 3 c m 的位置( 若用记号笔记则不需标签) 。上海大学硕= | 二学位论文2 ) 点燃酒精灯3 ) 接种：用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下：手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其它四指握在左手中，并试中指位于两试管之间的部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。旋松管塞：先用右手松动棉塞或塑料管塞，以边接种时拔出。取接种环：右手拿接种环( 如握钢笔一样) ，在火焰上将环端灼烧灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分均匀灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓国货灭菌( t j j 勿烧得过烫) 。接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先是环节出没有张军的培养基部分，使其冷却。取菌：带接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸