基于光镜观察的水沟穴治疗脑梗塞的参数优化研究.doc

基于光镜观察的水沟穴治疗脑梗塞的参数优化研究 作者：李雅洁，樊小农，王舒，石学敏【摘要】 目的根据灰色系统理论，从病理形态学角度筛选“醒脑开窍”针刺法的主穴之一“水沟”穴治疗脑梗塞的最佳参数(频率、时间)。方法将72只SD大鼠随机分为12组，分别为正常组、假手术组、模型未干预组及模型干预组（包括：参数1参数9，共9组）。模型组均复制一侧大脑中动脉缺血模型，分别以9种参数针刺模型干预组的“水沟”穴，2 次/d，连续治疗3 d后，取皮层、海马及纹状体3个区域的脑组织，光镜下分别计数神经细胞、微血管、炎性细胞、阳性细胞及噬神经现象，并对统计数据进行灰色关联分析，从而筛选“水沟”穴治疗脑梗塞的最佳针刺参数。结果各针刺参数的灰色关联度排序为：参数6参数2参数5参数8参数9参数3参数4参数1参数7。结论病理形态学研究提示，参数6（即针刺频率：3 次/s；针刺时间：5 s）为手针刺”水沟”穴治疗脑梗塞的最佳参数。 【关键词】 水沟穴； 脑梗塞； 参数优化Abstract：ObjectiveTo find the optimal parameters (frequency、 time) of acupunctural point Shuigou(GV 26) on the brain ischemia treatment. Methods Seventy-two SD rats were divided into 12 groups: normal group, sham operation group, model comparison group and nine different parameter groups. The steps were: firstly make the model of the middle cerebral artery occlusion of the left brains of rats, secondly puncture the point Shuigou with nine different parameters, twice a day, 3 days. Thirdly select the brain tissues from cortex, hippocampus and corpus striatum. Fourthly count the number of nerve cells, micrangiums, inflammation cells, positive cells and neuronophage. Fifthly analyze acquired data based on the grey relation theory and choose the optimal parameters of the point Shuigou for the treatment of brain ischemia. ResultsThe grey relation grades of parameters were listed in ascending order: parameter 6parameter 2parameter 5parameter 8parameter 9parameter 3parameter 4parameter 1parameter 7.ConclusionThe study based on the pathomorphology hints: parameter 6(frequency: 3 times per second, time: five seconds) are the optimal parameters of the point Shuigou for the treatment of brain ischemia.Key words： Shuigou (GV26); Brain ischemia; Optimal parameter 针刺治疗脑梗塞疗效肯定，被广泛应用于临床，但如何在选穴正确的基础上，建立针刺参数的量化标准成为提高临床疗效、促进临床推广亟待解决的问题。石学敏院士创立的 “醒脑开窍”针刺法注重手法量学，将每个穴位的操作均进行了量化界定。如，对 “水沟”穴的量化要求以针至“患者眼球湿润或流泪”为度。为了进一步使此标准明细化，本研究从病理形态学角度，对“醒脑开窍”针刺法的主穴之一“水沟”穴在脑梗塞治疗中的不同刺激参数进行了系统研究，以期筛选最优化针刺参数，指导临床应用。现总结如下。1 材料1.1 动物分组72只正常雄性SD大鼠，体重250280 g。按随机数字表随机分为12组，分别为正常组、假手术组、模型未干预组及模型干预组（包括：参数1组、参数2组、参数3组、参数4组、参数5组、参数6组、参数7组、参数8组、参数9组）。1.2 模型复制模型组采用longa颈内动脉线栓法建立大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型。假手术组手术步骤同模型组，只是线栓不插入颈内动脉。2 方法2.1 穴位刺激2.1.1 取穴及定位 取水沟穴。依据实验针灸学1的常用实验动物针灸穴位定位，水沟穴位于唇裂鼻尖下1 mm正中处。2.1.2 操作 模型干预组大鼠于清醒状态下，一人以手固定大鼠头部及四肢，另一人进行手法操作。针刺手法为提插手法，针刺参数见表1。2次/d，连续治疗3 d。正常组、假手术组及模型未干预组不予治疗。2.2 脑组织病理形态学观察2.2.1 取材于治疗后第3天，麻醉状态下将大鼠断头取脑，迅速剥离脑组织，以生理盐水冲洗干净。为充分观察针刺“水沟” 穴后对缺血脑组织不同部位病理形态学的影响，分别取皮层、海马、纹状体3个部位的脑组织制成光镜标本。2.2.2 光镜标本制备10 %中性甲醛固定24 h ，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成5 m 石蜡切片。常规苏木-伊红（HE）染色。于400倍高倍镜下，随机选取两个视野，取均值。计数神经细胞、微血管、炎性细胞、阳性细胞及噬神经现象。2.3 灰色关联度分析结合灰色系统理论,以灰色度评价最佳针刺参数法。此方法是以灰色系统理论中的灰色关联分析为基础建立的一种评价方法。其基本思想是一种相对性的排序分析，优点在于确定了一个样本 (如最佳针刺参数)作为比较物，将待评价物（如针刺参数）与之比较，如果两事物越接近，则相应事物之间的关联度就越大，反之就越小，从而选择最佳针刺参数。此方法可克服传统数理统计方法样本量大，计算量大及有时量化结果与定性分析不一致的不足。表1 水沟穴针刺参数（略）2.3.1 运用灰色关联分析方法的主要步骤收集待分析数据，构成原始数据资料对数据进行无量纲化处理生成参考序列X0计算差序列求序列最大最小极差计算比较序列对参考序列的关联系数计算关联度排序关联度并进行结果分析。2.3.2 具体分析过程 实验采集的原始数据：包括海马区（hippocampus，以缩写“H”表示）、皮层区（cortex，以缩写“C”表示）及纹状体区（corpus striatum，以缩写“CS”表示）的神经细胞数（以1表示）、微血管数（以2表示）、炎性细胞数（以3表示）、噬神经现象数（以4表示）及阳性细胞数（以5表示）。数据见表2。 对原始数据的无量纲化处理：由于收集的数据数值差异较大，为便于进行统计计算和分析比较，要对数值进行无量纲化处理，使之化为数量级大体相近的无量纲数据。 本实验采用初值化法，即为各列的数值均除以该列的第1个数值，得到新数列。见表3。表2 不同参数针刺水沟穴后对不同脑区病理形态学影响的原始数据（略）表3 无量纲化处理后的数据（略）生成参考序列：根据正负指标，由表3各指标的数值中选出最佳数值拟构成“水沟”穴针刺参数的参考序列X0。即X0=（1.129 6，1.260 0，0.024 7，0.000 0，1.000 0，1.264 6， 1.093 8，0.037 0，0.000 0，0.775 9，1.917 1，1.489 8， 0.031 6， 0.000 0， 0.783 3）。计算差序列：按照公式 i(k)=X0(k)-Xi(k)(i=1，2，9；k=1，2，15)计算差序列。式中X0为参考序列，Xi (X1，X2， X9)为比较序列。计算结果见表4。 求序列最大最小极差，由表4得出：M3.386 0 ，m0.000 0（M为最大极差， m为最小极差）。 计算待评价针刺参数构成的比较序列Xi对参考序列X0的关联系数：公式如下：0,i=miniminkX0(k)-Xi(k)+maximaxkX0(K)-Xi(k)X0(k)-Xi(k)+maximaxkX0(K)-Xi(k)式中，0，i（k）为X0与Xi 在第k点的关联系数；为分辨系数，取值在01之间，一般取0.5。计算结果见表5。表4 差序列数据（略）表5 关联系数（略）计算关联度：根据公式nr0,i=( k)0，i(k) (i=1，2，9，k=1，2，15)k=1计算关联度。式中，( k)是各指标的权重系数，本实验视各指标的权重相同，故( k) = 1 / 15 = 0.066 7，即 W=w(1)，w(2)，w(15) =0.066 7。 关联度的计算结果为：r 0，1=0.773 5，r 0，2 =0.797 0，r 0，3=0.785 1，r0，4=0.780 9，r 0，5= 0.787 2，r0，6=0.868 5，r 0，7=0.766 7，r0，8= 0.787 7，r0，9=0.787 4。3 结果 将关联度 r0, i进行排序，结果为：r 0，6 r0，2 r0，5 r 0，8 r 0，9 r0，3 r 0，4 r 0，1 r0，7。即：参数6参数2参数5参数8参数9参数3参数4参数1参数7。 以上结果提示，手针刺“水沟”穴治疗脑梗塞的最佳参数，从病理形态学角度研究，为参数6(即针刺频率为3次/s，针刺时间为5 s)。4 讨论 脑梗塞属于中医“中风”的范畴，目前针灸临床治疗此病的首选方案为“醒脑开窍”针刺法。它是基于祖国医学对神的认识，结合现代医学的解剖生理创立的，以醒脑开窍、疏通经络为治则的针刺大法。近些年来，对“醒脑开窍”针刺法的临床及实验研究正在逐步深入，日臻完善。其研究重点也从组方到单穴逐步细化。“水沟”穴作为醒脑开窍针刺法的主穴之一，为督脉与手足阳明经的交会穴。因督脉起于胞中，上行入脑达巅，故针“水沟”穴可调督脉，开窍启闭以醒神安神2。实验研究证明，针刺“水沟”穴可以改善脑血管的机能状态，促进脑表面侧支循环3；改善缺血区的灌注状态，使开放的血管数增多，血细胞流态改善4；同时可以改善脑组织能量代谢，从而保护脑组织5。以上证据充分说明，“水沟”穴在脑梗塞的治疗中发挥着重要的作用。 “醒脑开窍”针刺法注重手法的量化研究，认为统一规范的量化标准是保证疗效、促进临床推广的前提。本研究对“水沟”穴最佳针刺参数的筛选也是出于此目的。实验从病理形态学角度提示，接近最优刺激参数的方案为参数6（即针刺频率为3次/s，针刺时间为5 s）。从表1中可以看出，在15个指标中，参数6有7个指标达到最佳值，其余指标也均在中等水平。这表明，参数6的效果最佳，其可能的原因为此参数可明显减少阳性细胞数及噬神经现象，并可增加神经细胞数及微血管数。此方案与临床观察的有效的针刺参数相吻合，即针刺“水沟”穴的临床量化标准为“针至眼球湿润或流泪为度”，而要达到此标准所需的针刺参数正是频率约3次/s，时间约为5 s。本实验从组织病理学层面分析了此参数临床有效的可能机制，为临床施治的规范化提供了理论依据。 医学多因素分析常采用的统计分析方法为相关与回归，这两种方法一般要求有典型分布的大