（环境工程专业论文）高效絮凝剂产生菌的筛选及特性研究.pdf

a b s t r a c t mt h ef i e l do fw a t e rp r e l i m i n a r yt r e a t m e n ts y s t e m 。i n t e r e s t sa r ef o c u s e do n b i o f l o c c u l a n t , s i n c ei ti sn o n p o i s o n o u s ，n o n h a r m f u l ，a n db i o - d e g r a d e a b l ee a s i l y ，a n dt h e r e i sn os e c o n d a r yp o l l u t i o np r o d u c e d b i o f l o c c u l a n th a sb e e nu s e dw i d e l yi nt h ew o r l da n d i t sg o o df l o c c u l a t i n ge f f e c th a sb e e np r o v e d t h eb i o f l o c c u l a n tp r o d u c i n gb a c t e r i a ls t r a i n s h a v e b e e ni s o l a t e da n ds t u d i e di nt h i st h e s i s ( 1 ) 1 4 1s t r a i n sf r o m3 0s o i ls a m p l e sa n da c t i v es l u d g ew e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e d , a n d o n eh i g he f f e c t i v eb i o f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i n , n a m e di - 3 ，w a ss c r e e n e d i - 3w a s i d e n t i f i e da se n t e r o b a c t e rs p ，a n dh a sn e v e rb e e nr e p o r t e db e f o r e ( 2 ) b i o f i o c e u l a n tp r o d u c e db yi - 3w a sd e t e r m i n e d ；t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b i o f l o c c u l a n tw a ss e c r e t e do u to ft h eb a c t e r i a t h eg r o w t hc u r v eo fi - 3a n dt h e b i o f l o c c u l a n tp r o d u c i n gd y n a m i c si n d i c a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo ff l o c c u l a t i n gi n c r e a s e dw i t h i - 3g r o w i n g w h e nc u l t i v a t e d2 4 - 3 0h o u r s ，t h ef l o c c u l a t i n gr a t eo fb i o f l o c c u l a n tg o tt ot h e h i g h e s t ，a n dt h ef l o c c u l a t i n gr a t ew a s9 9 。 ( 3 ) c h e a p ，c o n v e n i e n c ec u l t u r em a t e r i au s e dt of e r m e n ts t r a i ni - 3l a a sb e e ns t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ff l o c c u l a n tp r o d u c t i o no fs t r a i ni - 3w a sd e t e r m i n e dt h r o u g h o r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e - 1 5 0 9 l s w e e tp o t a t oa sc a r b o ns o u r c e ，1 5 9 lu aa sn i l r o g e n $ 0 1 1 r c e ，t h ef l o c c u l a t i n gr a t ew a s a b o u t9 1 ；m e a n w h i l e ，t h eo p t i m u m c u l t i v a t i n gc o n d i t i o n sw a s ：o r i g i n a lc u l t u r ep h w a s9 ， t h ec u l t u r ec a p a c i t yw a s3 0 m l ，a n dr o t a t es p e e dw a s1 8 0 r m i n ，a n dt h ef l o c c u l a t i n gr a t e w a s9 5 5 t h eo p t i m u mf l o c c u l a t i n gc o n d i t i o n sw a s ：a d d i n g1 0m l lo ff l o c c u l a n tf e r m e n t l i q u i d , k e e p i n gk a o l i ns o l u t i o np h8 t h e nt h ef l o c c u l a t i n gr a t er e a c h e dt o9 8 1 m e t a l i o n ss u c ha sn a + 、c a 2 + 、f e 3 + s o l u t i o nd i d n th a v ea n ye f f e c to nf l o c c u l a t i n g f u r t h e r m o r e , i - 3s t r a i nc o u l du s ed o m e s t i ca n i m a lw a s t e w a t e rt op r o d u c eb i o f l o c c u l a n t , a n d 也er a t eo f f l o c c u l a t i n g r a t ew a s7 1 5 ：w h e na d d i n g 0 5 9s u g a r i n t ot h ed o m e s t i ca n i m a lw a s t e w a t e r , t h ef l o c c u l a t i n gr a t ew a s8 7 ，5 ( 4 ) t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no f b i o f l o c c u l a n tw a sa n a l y z e dp r e l i m i n a r i l y ；t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eb i o f l o c c u l a n tw a sc o n s i s t e do fp o l y s a c c h a r i d e s ( 6 4 9 ) ，al i t t l ea m o u n to f p r o t e i n s ( 9 1 ) ；a n dt h eo t h e rc o m p o n e n t s ( 2 6 ) w a sn o tc l e a r ( 5 ) t h eb i o f l o c c u l a n tu s e d t ot r e a tr o c km a t e r i a lw a s t e w a t e r , d o m e s t i ca n i m a l w a s t e w a t e ra n dt h ef l o o d w a t e rt or e m o v et h es u s p e n d e ds u b s t a n c e sw a ss t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tf l o c c u l a n t i n gr a t ew a s9 8 4 ，3 9 a n d9 9 ，r e p e c t i v e l y ；w h i c h s u g g e s t e dt h a tb i o f l o c c u l a n th a v eg o o df l o c c u l a t i n ge f f e c t , a n dt h ef l o c c u l a n t i n gc o u r s e w a s f a s t ；h e n c e ，t h eb i o f l o c c u l a n tw i l lh a v eb r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t si np r a c t i c e k e yw o r d s ：b i o f l o c c u l a n t ；c u l t u r em e d i a ；c u l t i v a t i n gc o n d i t i o n ；c h e m i c a lc o m p o n e n t ； f l o c c u l a t i n gd y n a m i c s 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材科。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 铲 乏匕，劬 勿矽年f 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：乏戈 导师值，铭 切。7 年钿 日 研卑易r 1 文献综述 1 1 前言 从世界范围来看，水资源与水环境中出现的矛盾越来越突出。中国人口基数大， 水资源缺乏，人均占有水量只有2 6 3 0m 3 ，为世界人均水量的1 4 。为保证水资源的可 持续利用，解决水环境污染问题，国内外在水处理方面做了大量工作。开发多种水处 理工艺，如絮凝沉淀法、生化法、离子交换法、吸附法、化学氧化法、电渗析法和污 水生态处理技术等。目前，絮凝沉淀法应用广泛，在废水一级处理中占有重要地位， 而絮凝剂在絮凝沉淀法中起着最重要的作用。 。 絮凝剂是一类可使液体中不易沉降的固体悬浮颡粒凝聚、沉淀的物质。 通常可将絮凝剂分为有机高分子絮凝剂( 如聚丙烯酰胺等) 、无机絮凝剂( 如铝盐、 铁盐等) 及微生物絮凝剂三类。前二类絮凝剂多作为澄清剂用于以活性污泥法等处理 废水领域和土木疏浚施工等方面。此外，在上水道、中水道的造水领域，发酵工业中 发酵液与培养菌体的分离等下游处理工程乃至食品工业等许多领域中絮凝剂可望得 到广泛应用。近2 0 年来，是絮凝剂和混凝技术发展的高峰时期。据报道，美国1 9 6 7 年实际使用的絮凝剂品种约有9 个，到2 0 世纪7 0 年代初则迅速增至1 3 4 种，其中以无机 的聚合氯化铝和有机合成的聚丙烯酰胺最为广泛。2 0 世纪8 0 年代，日本这类絮凝剂年 产量己达2 4 。0 0 0 吨，可见应用之多。我国从2 0 世纪6 0 年代开始，也己经研制和应用无 机和有机合成高分子絮凝剂，迄今为止，我国生产聚铝的厂家达5 0 多家，年产量3 5 万吨；聚丙烯酰胺的生产厂家约3 0 家，生产能力超过万吨。无机和有机合成高分子絮 凝剂的生产和应用虽然已经取得了长足的进步，但它们在使用过程中的不安全性和给 环境造成二次污染的危险性不得不引起人们的重视。研究表明，铝与老年痴呆症有关， 聚丙烯酰胺虽然在完全聚合态没有多大问题，但其聚合单体丙烯酰胺却具有强烈的神 经毒性，并且还是强致癌剂，所以聚合过程中单体的残留是一个令人十分担忧的问题。 现在许多领域已禁止或限量使用这些絮凝剂【1 】。 因此开发安全无毒、絮凝活性高，无二次污染的新型絮凝剂对物质产品的生产工 艺改进、人类的健康和环境的保护都有很重要的现实意义。自2 0 世纪8 0 年代后期起， 伴随生物技术的发展，第三类絮凝剂生物絮凝剂应运而生。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 微生物絮凝剂 微生物产生的具有除了酶和抗体以外的某种特异机能的生物体高分子定义为微 生物聚合体，如机能性蛋白质，机能性多糖类等。微生物在生长过程中，常分泌一些 聚合物到胞外，能够使其它物质发生絮凝沉淀，具有絮凝特性的聚合物被称为微生物 絮凝剂。由于是利用生物技术，通过微生物发酵、抽提、精制而得到的种具有生物 分解性和安全性的新型、高效、无毒的廉价的水处理剂，因此，微生物絮凝剂的开发， 日益引人注目。 1 2 1 1 微生物絮凝剂特点 微生物絮凝剂是一种新型、高效、廉价、无毒和无二次污染的水处理剂，它不仅 能快速絮凝各种颗粒状物质，尤其在废水脱色、高浓度有机物去除等方面有独特效果。 ( 1 ) 微生物具有比表面积大、转化能力强、繁殖速度快、易变异和分布广等特点，且 生物絮凝剂沉淀的来源广，生产周期短且效率高。( 2 ) 高效。同等用量下，与现在常 用的各类絮凝剂铁盐、铝盐、聚丙烯酰胺相比，微生物絮凝剂对活性污泥的絮凝速度 快，且絮凝沉淀容易过滤。( 3 ) 无毒。( 4 ) 可消除二次污染。到目前为止，已报道的微 生物产生的絮凝物质为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等高分子物质，可被 生物降解，因而可消除絮凝后带来的二次污染。( 5 ) 絮凝广泛。微生物絮凝剂絮凝处 理的对象较广，可用于活性污泥、粉煤灰、果汁、饮用水、河底沉积物、细菌、酵母 菌以及各神生产废水。 1 2 1 2 产生絮凝剂的微生物类群 f j b u t t e r f i c l d 从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌以来，已筛选获得了许多絮凝剂 产生菌，有霉菌、细菌、放线菌和酵母，具体种类见表l 【2 圳。 1 2 2 微生物絮凝剂的研究与应用 最早发现的絮凝剂产生菌是美国科学家b u t t e r - f i e l d ，他于1 9 3 5 年从活性污泥中筛 选出了菌胶团产生菌。2 0 世纪8 0 年代后期，日本在微生物絮凝剂开发上取得了引人注 目的成果。仓根隆一郎等从土壤中筛选到红平红球菌的s 1 菌株，并制成了 n o c 1 微生 物絮凝剂。此后，美国、英国、德国、日本、葡萄牙、以色列、韩国、朝鲜、伊朗等 国的科学工作者对絮凝剂产生菌和微生物絮凝剂进行了大量的研究工作，并已取得了 一系列的研究成果闸。 表1 产絮凝剂的微生物 t a b b i o f l c c u l a n t - p r o d u c m gs t r a i n s 塑堕f 旦! ! 鲤生 a g r o b a c t e r i u msppseudomonus s m = e n a l c a 堙e n l a t u s p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a c o r y n e b a t e r i u m p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s c o r y n e b a c 把n u n p h k f m e t h y l o b a c t e r i u m m y c o b a c t e r i u m p h l e i l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u m p s e u d o m o n a ss d b a c i l l u ss p p s e 口d o m o l l a $ f a e c l i s t h o d e s i a n u m r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s b r e v i b a c t e r i u m a l c a l i g e n e sc u p i d us t a p h y l o c o c c u sa u r e u s h y d r o c a r b o n c a l a s t u s k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s d e m a t i u ms p f i a v o b a c t e n u ms p p s e u d o m o n a s i n s e c l z p h i l u m k l u y v e r ac r f l o c r e s c e n $z o o g o l e as p 垫垡鱼坠鲤婴! 坠竺! 堕! n o c a r d i aa m a r a en o c a r d i ar e s l r i c t a n o c a r d i ac a & a r e a n o c a r d i ar h o 幽“ s t r e p t o m y c e sv i n a c e us t r e p t o m y c e sg r 西e u s 塞堕i 里坚鲤 e u p e n i c i l l i u mc r u s m c e u s c i r c i n e l l as y d o w i m o n a s c u sa n 幻g e o t r i c h u mc a n d i d u r n s o r d a r i a f i m i c o l ap a p c f l o m y c e ss p a s p e r g i f u ss o j a e a p e r g i l l u so c h r a c e u s a s p e r g i l i u s p a r a s i t i c u s h a n a e n u i aa n o m a l a s a c c h a r o m y c e sc e r e v 缸i n e 蔓耋坠! g ! 堂 p h o r i m i d i u ms p a n a b a e n o p s i sc w c u l a r i s c h l a m y d o m o n a sm e x i c a n a c a l o t h r i xd e s e r s c a 1 9 7 6 军r k u r a n e 等人苁红平红球菌【6 1 僻幻d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s ) 、诺卡氏菌属 ( n o c a r d i a ) 、棒状杆菌属( c d ，) 川e 蚰c 细 “m ) 、分枝杆菌属( 砂c d 6 口细f f “m ) 、芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 筛选出1 4 种具有絮凝效果的菌种，其中，絮凝 效果最好的是红平红球菌。 2 0 世纪8 0 年代后期，日本的仓根隆一郎等从日本的旱田土壤中分离筛选出具有良 好絮凝效果的红平红球菌s 1 俾e r y t h r o p o l i s s 一1 ) 菌株，并将由该菌命名为n o c 一1 n o c 1 微生物絮凝剂是到目前为止发现的絮凝效果最好的生物絮凝剂，它对畜产废 水、膨胀污泥、瓦厂废水和脱色废水等均具有良好的絮凝除浊效果。1 9 9 4 年，k u r a n e 等报道分离出一组能够产生大量粘液的r - 3 的混合菌株，在液体培养中能高效产生 a p r - 3 絮凝剂。1 9 9 9 年，m w a t a n a b e 和y s u z u k i 等发现海洋光合细菌r h o d o v u l u m s p p s 8 8 的胞外聚合物( e p s ) 具有絮凝性能，通过与常用絮凝剂的比较，该聚合物不适 合于大规模污水处理，但可用于食品加工废水处理。朝鲜、伊朗和日本就研究发现了 一些新的絮凝剂产生菌 7 捌，其产生的微生物絮凝剂有p y 9 0 、a s 1 0 1 、a 9 9 、d p 一1 5 2 ， 其中比较有代表性的是1 9 9 7 年s u h h h 等人发现的d p 1 5 2 絮凝剂，其首次发现杆状 细菌也能产生絮凝剂。2 0 0 1 年，s h i l l ，i l 等再次发现了一株杆状细菌c c r c l 2 8 2 6 可产絮凝剂，并指出该絮凝剂的分子量达2 x 1 0 6 ，最适环境为中性。2 0 0 3 年，新加坡 国立大学的s d e n t t “1 等从土壤中分离出一株粘质杆状细菌，其研究了该菌产生的m b f a 9 的组成特性，其用于处理淀粉废水可使s s 和c o d c r 分别降低8 5 5 和6 8 5 。1 9 9 9 年，关于糖类以外微生物絮凝剂生产用碳源的第一篇报道【垃1 。来自日本国家人类与生 物科学技术研究工业科技机构，他们发现乙醇比葡萄耱和果糖可更有效地产生红平红 球菌s 一1 絮凝剂。一一 有文献表明【2 】细菌和酵母菌为c 5 h 8 0 2 n ，霉菌的化学组成为c 1 2 h 1 8 0 t n ，可见在微 生物生长所需的6 大营养要素( 碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水) 中，除水 外，碳源、氮源的需要量相对较大，特别是碳源的需要量大，并且普通培养基中的碳 源、氮源的成本高。因此，国外和国内的研究者大都从寻找替代碳源、氮源的目的出 发，筛选廉价的培养基或利用含碳、含氮丰富的高浓度有机废水培养微生物。 k u r a n e 等人于1 9 9 4 3 - 4 ，1 3 , “1 开始进行这方面的研究并申请了日本专利，他们在实 验中发现多种物质可以作为红平红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) 产生絮凝剂的替代 培养基，如乙醇、罐头制品厂的鱼血废物可以作为替代碳源，麦芽根、水产加工废水、 豆饼等可以作为替代氮源，使用替代培养基后，培养基的价格下降j 2 3 以i - t ”1 6 1 。 国外微生物絮凝剂的商业化生产始于2 0 世纪9 0 年代。我国对于絮凝剂产生菌及微 生物絮凝剂的研究起步较晚，从2 0 世纪9 0 年代起，国内有关絮凝剂产生菌及微生物絮 凝剂的报道日渐多起来了，特别是近几年来我国科学工作者己筛选分离出一些絮凝剂 产生菌，有的还进行了培养基、微生物絮凝剂的制备和应用方面的研究。但迄今为止， 还没有微生物絮凝剂成品出售，基本上仍停留在实验室阶段，并且多数集中在絮凝剂 产生菌的筛选研究方面。 国内较早研究中，台湾的邓德丰等从废水处理场的废水中分离得到具有絮凝作用 的c 一6 2 细菌菌株，并用该菌株产生的生物絮凝剂处理猪粪尿废水和红豆加工场废水， 4 取得了良好的絮凝效果。张本兰用从活性污泥中筛选出的微生物菌株p a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 所产生的絮凝剂对纸浆黑液和氯霉素等有色废水进行脱色处理，其脱 色率分别达9 5 和9 8 以上。邓述波等用从土壤中分离得到的a 一9 菌株所产生的絮凝 剂对淀粉厂废水进行处理，该菌株所产生的絮凝剂对淀粉废水有着良好的絮凝除浊 效果，经絮凝沉降处理后，废水的s s 和c o d c r 的去除率分别达8 5 5 和6 8 5 ，处理 效果明显优于常用的化学絮凝剂。 张永波用微生物絮凝剂普鲁兰和聚铝复合使用，处理低浓度城市污水，在最 佳絮凝条件下，对浊度和c o d c r 的去除率分别达9 5 和5 2 6 8 。胡筱敏等利用从 土壤中分离出的芽孢杆菌a - 9 所产生的生物絮凝剂m b f a 9 处理含泥河水、硫化染料废 水和淀粉黄浆废水对悬浮物和c o d 的去除率均明显高于聚丙烯酰胺等传统的化学絮 凝剂。 近三年的研究主要有：程金平等 1 7 】得出了絮凝剂d t j m ，1 的最佳絮凝条件；江南大 学的h en i n g ( f f 宁) t ”】从土壤中分离出一株谷氨酸棒杆菌属( c c t cm 2 0 1 0 0 5 ) ，其产生 的m b f 分子量为1 0 5 d a ；陈欢【1 9 1 发现了种产生胞外多糖絮凝剂s c 0 6 的纤维堆囊菌 s p o r a n g i u mc e l l u l o s u mn u s t 0 0 ，s c 0 6 由葡萄、甘露糖和葡萄糖醛酸组成，其比例 约为5 ：3 ：l ，絮凝活性依赖于阳离子存在，在p h 2 9 范围内絮凝活性稳定；湛雪辉等【2 0 1 从污水中筛选出菌株x h 1 ，其微生物絮凝剂絮凝率近8 6 ，最适p h 6 5 7 5 、最适温度 为3 0 c ；时红【2 1 】利用筛选株t j 3 产生的微生物絮凝剂处理高岭土悬浊液絮凝率达9 2 ，4 。另外我国科学工作者在对絮凝基因和转基因的研究方面也做了大量的工作，如中 科院微生物研究所的张博润1 2 2 就对酵母絮凝机理研究概况做论述、何秀萍f 2 3 对絮凝 基 虱f l o i g 的序列作了测定和分析、江南大学的李寅、何宁等【2 4 1 研究新型蛋白聚糖类 生物絮凝剂r e a 1 1 的合成途径。 徐斌等利用鱼粉废水培养假单胞菌( 风甜d d m d n 础s p ) g x 4 1 产絮凝剂，对高岭 土悬液、土壤悬液、细活性碳粉末悬液和电瓷厂污水均有较好的絮凝作用。尹华等【2 6 】 利用味精废水和少量葡萄糖( 1 0g l ) 培养固氮菌j - 2 5 产生絮凝剂，对高岭土悬浮液的絮 凝率达至1 j 9 0 以上，对石化废水c o d 、s s 和色度的去除率分别为6 6 7 、9 8 3 和 9 3 7 ：菌种经过一段时间的驯化后，即使在不加碳源的废水培养基中仍能迅速繁殖， 其培养液的絮凝率可达9 8 。 目前，国内外对有关微生物利用畜禽养殖废水产生微生物絮凝剂的研究报道甚 少。如何既有效地处理畜禽废水又充分利用其中有用成分己成为一项重要的研究内 容。 1 2 2 1 微生物絮凝剂的主要成分 己知的微生物絮凝剂有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等。尽管性质各 异，却都是分子量高于1 0 5 以上的生物大分子。这就决定了微生物絮凝剂具有生物可 分解性的独特性质，而且对环境和人类具有无毒无害等安全性。产生絮凝剂的微生物 绝大多数来自与人类关系十分密切的土壤中，在分离这些微生物和生产微生物絮凝剂 的过程中，对人类不会造成不良后果。 微生物絮凝剂化学成分的研究方法通常有以下三种： ( 1 ) 因子破坏法，即测定纤维素酶、蛋白酶( 如链酶蛋白酶) 、金属阳离子鳌合剂( 如e d t a ) 和加热等处理对微生物絮凝剂絮凝能力的破坏，以判断絮凝剂的化学组成2 叭。 ( 2 ) 化学分析法。化学分析法能够有效地证明微生物絮凝剂的生化组成，包括多糖的 单体成分、蛋白质的氨基酸构成等。 ( 3 ) 再形成法，就是将与絮凝剂形成有关的成份分别提取出来，再把它们加在一起， 如果可以形成絮凝物，絮凝剂的组成便得到证实【2 7 1 。实际研究中通常将上述三种方法 结合起来综合考虑，以获得确凿的结论。 采用上述方法，很多研究者对微生物絮凝剂的化学组成进行了研究口9 46 1 。微生物 絮凝剂按化学组成分类，主要有蛋白质、多糖、脂类和d n a 类等大分子物质。a s p s o j a e a j - 7 0 0 2 瞰1 合成的絮凝剂的主要成分是蛋白质和已糖胺。另外，k u r a n e 报道n o c 1 的主要成分是蛋白质，而且分子中含有较多的疏水氨基酸，包括丙氨酸、甘氨酸、谷 氨酸、天冬氨酸等等。细菌f l a v o b a c t e r i “hs p 口9 1 ，放线菌n a m a a o 【删以及真菌 h a n s e n “l ad n o a t 4 1 1 分泌的微生物絮凝剂的主要成分也都是蛋白质。h a n t u l a 2 8 1 发现 活性污泥中分离的微生物絮凝剂中存在蛋白质成份。f u m i o 4 2 1 ， s e o0 9 分离到的微 生物所产生的微生物絮凝剂也是蛋白质( 或多肽) 。 多糖类的微生物絮凝剂有很多种阳删，有些是由一种糖单体组成，有些是由多 种糖单体构成的杂多聚糖。z o o g o l e as p 1 4 习产生的絮凝剂含氨基多糖。p s e u d o m o n a s s p 【4 6 1 产生的絮凝剂的主要成分是粘多糖。b a r o r y 【4 7 1 发现真菌p h o r i m i d i u ms p 产生 的絮凝剂的主要成份是连结了脂肪酸和蛋白质的磺酸异多糖。其多糖的基本骨架是氨 基酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖等。a n a b a e n o p s i s c ir c u l a r i s 删和a l c a h g e n e sc u p i d u s 4 9 1 产生的絮凝剂的主要成分都是酸性聚多糖。s a l e h i z a d e h 等【划发现胞外聚多糖积累和细 菌絮凝存在一定的关系，进而从活性污泥中分离出不含细胞的絮凝剂，其化学本质是 6 碳水化合物。值得指出的是，并非细菌合成的所有多糖均具有絮凝活性。k r u a n e 【h j 在研罗翻l c a l i g e n e sl a t u s 的絮凝过程时发现只有1 0 的多糖发挥了作用。 目前发现的唯一的脂类微生物絮凝剂是1 9 9 4 年k u r a n e 从r e r y t h r o p o l i ss - l 的培养 液中分离出来的微生物絮凝剂。其分子中含有葡萄糖单霉酸酯( g m ) ，海藻糖单霉酸 酷( t h d ，海藻糖二霉酸酯( 1 1 ) 岣三种组分。p s e u d o m o n a $ s t r a i nc 一1 2 0 【5 2 1 菌体细胞凝 集的直接原因来自相对分子质量很高的天然双链d n a ：w a t a n a b e 分离的光合细菌 r h o d o v u l u ms p p s8 8 ，其絮凝活性与该菌分泌到胞外的d n a 有着直接关系。 此外，一些絮凝剂中还含有无机金属离子，如c a 2 + 、m 矿、a 1 3 十和f e ”等。 综上所述，微生物絮凝剂的主要成分是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等， 相对分子质量一般高于1 0 5 ，尽管性质各异，但均能快速絮凝各种颗粒物质，有的还 具有独特的脱色效果。 1 2 2 2 影响絮凝剂产生的因子 ( 1 ) 碳源和氮源 众多学者对微生物絮凝剂产生菌的培养条件的研究结果表明，絮凝剂的产生和碳 源有较大的关系。k u r a n e 等盼奠1 以果糖为碳源培养4 f c 如酽月船肠m ，的絮凝剂的产量 超过其他所有受试碳源，使用葡萄糖、半乳糖和果糖比用淀粉和麦芽糖对a l c a l i g e n e s c u p i d e u s 分泌絮凝剂更为有效。k u r a n e 5 5 1 在足约积，印d 如培养中，以0 。5 的葡萄糖和 o 5 的蔗糖为碳源时，絮凝剂的产量要高于以1 蔗糖和8 废糖浆( 含果糖，蔗糖和葡 萄糖) 为碳源时的产量。k u r a n e 5 6 1 研究了各种碳源对微生物絮凝剂产生的影响，发现 用乙醇做红萍红球菌的唯一碳源，絮凝活性的最大值和使用葡萄糖十果糖作为碳源的 最大值一致，且产出时r 相同。程树培等的研究表明麦芽糖是球形红假单胞菌的最 适碳源。 在氮源中，k u r a n e f 5 8 】研究发现尿素和硫酸铵对微生物絮凝剂的产生和细菌的繁殖 最为有利。此外，硝酸铵和氯化铵也可以促进增长，但絮凝活性只相当于用尿素的 6 0 7 0 。王猛掣5 9 1 也发现以尿素和硫酸按为无机氮源，酵母膏和酪蛋白水解物为有 机氮源可以促进r e r y t h r o p o l i s 菌体细胞的生长和絮凝剂的分泌。采用氯化铵和硝酸铵 也可刺激菌的生长，但絮凝剂的产量却只有以尿素和硫酸铵为氮源时的6 0 7 0 。 t e z u k a 5 8 1 认为碳氮比对于絮凝剂的合成也有影响，葡萄糖浓度在2 5 e , l 时，降低 碳氮比( c 咖能够使zr a m i g e r a 絮凝剂产量增加。y o s h i t a k a 4 6 l 的研究也发现在c n 为 6 0 一1 1 4 时，z o o g o l e as p 的絮凝活性较好，大于或小于此值时絮凝活性便迅速下降。 ( 2 ) 无机盐 无机盐的添加对絮凝剂的产生也有一定的影响，影响作用的大小因絮凝剂产生菌 的不同而不同。s t a h l f 6 0 发现二价离子如c a 2 + 能够促进s a c c e r e v i s l a e c 合成絮凝剂，但 用e d t a 将金属离子去除后，絮凝活性受到抑制。t a k a g i 与h a k a k u n o 烈3 研究也发现c a 2 + 能促j 控p a e c i l o m y c e ss p 的生长和絮凝剂的合成，f c 2 + 、c u 2 + 则有抑制作用。c a 2 + 、 m n 2 + 、b a 2 + 能够促i 拉f l a v o b a c t r t i u 所s p 合成絮凝剂，但m 9 2 + 却有相反效果1 6 2 。低浓 度的c a 2 + 能显著增加正c w d c r 甜鲫s 产絮凝剂的絮凝活性；但当培养基中不含c a 2 + 时， 絮凝剂的合成即停止陋6 卦。 ( 3 ) 微量生长 在培养基中加入微量生长因子，如络蛋白氨基酸、蛋白陈、酵母膏、络蛋白、丙 氨酸和谷氨酸等，可以促进絮凝剂的产生噼，5 6 1 。在4 ，s o j a e 【6 5 3 的培养基中加入酪蛋白、 酵母膏、蛋白陈和一些氨基酸等，其所产生絮凝剂将增多。一些有机酸，包括2 葡萄 糖酮酸、5 葡萄糖酮酸和葡萄糖酸等可以较好地促进彳s o j a 。合成絮凝剂，其中2 一葡 萄糖酮酸的效果最好。在该培养基中加入糖将降低培养液的p h 并阻止絮凝剂的分泌 累积，加入有机酸如2 一酮基葡萄糖酸则可增加其絮凝活性。 s a i t o 等0 6 1 研究发现一些有机酸，包括2 一葡糖酮酸、5 葡糖酮酸和葡糖酸等可以较 好地促进，4 s o j a 。合成絮凝剂，其中2 葡糖酮酸的效果最好。h a n t u t a 等在1 9 9 1 年也发 现培养基中的其他物质，如e d t a 、苹果酸、柠檬酸、多聚赖氨酸、小牛血清蛋白等 对微生物絮凝剂的形成也有不同的影响。这些物质影响微生物絮凝活性表现的原因主 要有两个方面：一是通过调节絮凝基因的表达；二是对微生物产生的絮凝剂进行了物 理或化学修饰。因而采用营养培养基时微生物絮凝剂的产量要高于使用合成培养基时 的产量。 ( 4 ) p h 任何絮凝剂产生菌都存在产絮凝剂的最适p h 值范围，过高或过低均不利于絮凝 剂的产生，菌产絮凝剂的最适p h 值与其生长所需的最适p h 值略有差异。e n d o 鲫的研 究表明，如一直控制p h 值为6 时，a 5 咖p 菌丝生长旺盛，但根本不表现出絮凝活性。 cx e r o s i s 只有在酸性条件下才能产生絮凝剂【拥。 k u r a n e 等1 5 4 】筛选出的r e r y t h r o p o l i s 在碱性环境中能够合成更多的絮凝剂，产絮凝剂的最适p h 值为8 0 9 5 。y o k o i t6 8 】研究 表明，在培养e n t e r o b a c t e rs p 的过程中，p h 值处于一个动态变化的过程。 ( 5 ) 培养温度 培养温度对微生物产絮凝剂有明显的影响，不同絮凝剂产生菌有不同的最适培养 温度，最适温度一般在2 5 3 5 c 2 _ n 。如k u r a n e l 6 9 1 筛选的n o c 1 、尹华等筛选的菌 种、程金平等筛选的d f j m 1 菌株均以3 0 为最佳。在3 0 - 3 4 范围内，a $ o j a e 【6 5 】可 产生效果最好的微生物絮凝剂。对某些细菌来讲，絮凝剂合成的最佳温度与菌体生长 的最适温度不同。例如，a s o j a e 【6 习于2 5 培养时菌体生长最快，而3 0 - 3 4 c 絮凝剂产 量最高。 ( 6 ) 其他因素 通气量大小会影响微生物絮凝剂的产生，通气量不应太大或太小，否则都会影响 其产量。在研究通气量对r ，e r y t h r o p o l i ss - l 菌体生长以及絮凝剂合成的影响时发现， 发酵过程中，停止通气，仅仅维持搅拌时，菌体的絮凝率比通气时有所提高【5 5 1 。王镇 【7 2 1 报道通气量对其所筛选的四株菌均有影响，培养初期大通气量既可阻止菌体絮凝成 较大的凝集体，又有利于菌合成絮凝剂；在培养后期，各菌对通气量要求不同，减少 通气量有利于多糖类絮凝剂的产生。培养方式也会影响絮凝剂的产生。k u r a n e 7 3 1 ：f f 5 l 发酵罐中验证了n o c _ 一l 进行连续生产的可行性。首先进行间隙培养，当絮凝活性增 ；k n 3 ( i o d 5 5 0 ) 以上时开始向连续培养过渡，如此连续培养2 6 0 h 【7 3 】，与间歇培养相比， 连续培养时絮凝剂生产速率是前者的2 5 倍。 微生物絮凝剂的用量也对絮凝活性也有一定的影响。一般情况下，絮凝效果随着 絮凝剂的用量增加而提高，絮凝剂的用量达到一定值时，出现峰值，再增加用量，絮 凝效果反而下降，因此使用时有一个最佳效果的用量。叶晶菁等7 4 报道絮凝效果并不 与加样量成正比，而是存在一个有效范围，1 0 0 m l 高岭土悬浊液中加x 2 m l 发i 酵液时， 絮凝效果最佳。t h 6 的培养液7 5 1 的用量对絮凝效果有一定的影响，2 0 0 m l 高岭土悬浊 液中加入量为l m l 时絮凝率达到9 0 。 1 2 2 3 微生物絮凝剂的絮凝机理 絮凝剂的絮凝机理主要有三种：桥联作用、中和作用和卷扫作用p 6 - 7 7 1 。微生物絮 凝剂是带电荷的生物大分子，絮凝机理主要是前两种。l e v i n e 等提出了生物絮凝剂对 胶体颗粒的絮凝机理： ( 1 ) 桥连作用 如果从颗粒表面到聚合物的延伸距离大于颗粒间排斥作用范围，该聚合物能吸附 到另个粒子上，由此桥连这两个颗粒。微生物絮凝剂大多为分子量大于l o 询直链 或支链大分子，这种分子结构非常适合以桥连方式聚集颗粒物。 9 ( 2 ) 电荷中和作用 相反电荷的聚合电解质能减少颗粒表面电荷密度，压缩双电层，以至颗粒可以彼 此充分紧密接近，从而使吸引力变得有效。微生物絮凝剂的主要成分中都含有亲水的 活性基团，如氨基、羟基、羧基等，这些基团能和颗粒表面的电荷发生电荷中和作用， 使形成的絮体更为牢固。 研究表明，一些微生物絮凝剂是通过化学桥联作用将被絮凝物集聚在一起，所以 其絮凝作用是广谱的。不受微生物个体和颗粒物表面特性影响，能被絮凝的物质包括 多种细菌、放线菌和真菌的纯培养物，活性污泥、微囊藻、泥浆、土壤固体悬液、底 泥、煤灰、血细胞、活性碳粉末、硅胶粉末、氧化锟、高岭土和纤维素粉等。另一方 面，微生物絮凝剂絮凝能力的大小受被絮凝物质的极大影响，絮凝机理也各异p 射。 1 ，2 2 4 微生物絮凝剂的遗传基础和生理意义 一些微生物只在特定的生长阶段产生絮凝剂，因此有的研究者推测微生物絮凝剂 性状表达受遗传基因的严格调控。而己有的实验结果也确实证明了微生物分泌絮凝剂 的能力是受遗传基因控制的。 近年来，还在s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中发现了絮凝基因，其中f l 0 5 号絮凝基因 是最主要的。尽管微生物絮凝的基因调控还远未为人们清楚地了解，但上述试验充分 证明了微生物絮凝剂的遗传基础，因此一些研究者己在着手应用遗传工程的方法，将 絮凝基因转入活性污泥和其他广泛应用在发酵工程中的微生物中，从而获得生物活性 和絮凝能力均佳的优良微生物日本的研究表明，微生物絮凝物的破坏对微生物的生长 有一定的促进作用，这可能是因为游离细胞与培养液中营养物接触面积增加的缘故。 这种现象说明，微生物絮凝物的形成对于这些微生物的生命活动并不是必须的。絮凝 剂真正的生理意义并不在于使微生物产生絮凝，而是微生物的荚膜多糖的组成分，微 生物絮凝性也许只是一种伴生性状。 微生物絮凝剂的相对分子质量大小对絮凝剂的絮凝活性至关重要。一般说来，相 对分子质量越大，吸附位点越多，携带的电荷越多，中和能力越强，桥联作用和卷扫 作用越有利，絮凝效果越好。目前己分离纯化的微生物絮凝剂都是多聚糖和蛋白质之 类的生物大分子，相对分