（环境工程专业论文）高效纤维素降解菌株的筛选及其复合系菌剂在秸秆堆肥中的应用.pdf

a b s t r a c t 2 9 3c e l l u l o s ed e g r a d i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e da n ds c r e e n e d 拍掇t h es o i l sa n d c o m p o s t s ，w h i c hc o n s i s t e do f7 9b a c t e r i a , 1 2 1a c t i n o m y c e t e sa n d9 3f u n g i t e nh i g h c e l l u l o s e d e g r a d i n gs t r a i n si n c l u d i n g 4b a c t e r i a s ( b 6 0 ，b 6 2 ，b 6 6 ，b 6 8 ) ，4 a c t i n o m y c e t e s ( s 2 8 ，s 9 6 ，s 9 8 ，s 9 9 ，s 1 0 6 ) a n d2f u n g i ( f 2 9 ，f 5 3 ) w e r es e l e c t e db yc o n g or e da g a ra n dg r o w t h s p e e d t h er e s u l t so fi d e n t i f i c a t i o ns h o w e dt h a tf o u rb a c t e r i as t r a i n sb e l o n g e dt od i f f e r e n t g e n u s ，b 6 0w a sg e n u so fc e l l u l o m o n a s ，b 6 2w a sg e n u so fp s e u d o m o n a s ，b 6 6a n db 6 8w e r e g e n u so fb a c i l l u s 。s 9 6 , s 9 8a n ds 9 9b e l o n g e dt og e n u so fs t e r p t o m y c e s ，s 1 0 6b e l o n g e dt o g e n u so fm i c r o m o n o s p o r a f 2 9b e l o n g e dt og e n u so f a s p e r g i l l u sa n df 5 3b e l o n g e dt og e n u s o ft r i c h o d e r m a b yt h em e a n so fo r t h o g o n a lt e s tw i t h1 0s c r e e n e ds t r a i n sa n d1s t r a i n so fa s p e r g i l l u s n i g e r ，1s t r a i n so fc e l l u l o m o n a sc a r a t e ，2s t r a i n so fa z o t o b a c t e ra n dt h ec o m m e r c i a l p r o d u c te m ，3h i g h l ye f f e c t i v ec o m b i n a t i o n sw e r eo b t a i n e d t h ed e g r a d a t i o nr a t ef o rf i l t e r p a p e rw e r ec o m b i n a t i o n1 2 c o m b i n a t i o n8 c o m b i n a t i o n5 c o m b i n a t i o n1 2w a su s e dt o s t u d yi t sa d a p t a b i l i t yt os o m ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h el i q u i dm e d i u m i ts h o w e dt h a t t h eo p t i m a lc a r b o ns o u r o ow a sm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s ea n dc a r o x y m e t h yc e l l u l o s e s o d i u ms a l t ，t h ea p p r o p r i a t en i t r o g e ns o u r c ew a sp e p t o n ea n dy e a s te x t r a c t ，w h i l et h e o p t i m a lm e d i u mp ha n dc u l t u r et e m p e r a t u r ew e r e6 5a n d3 0 c ，r e s p e c t i v e l y a n dt h e o p t i m a li n c u b a t i o nt i m ew a s6d a y s t h ee n z y m ec h a r a c t e r i s t c so fc e l l u l a s eo fg r o u p1 2s h o w e dt h a tt h ek mf o rc m c - n s w a s0 。3 2 如v 酲w a so 1 5 m g ( m i n 。m 1 ) i nt h ec o n d i t i o no f6 0 ，p h6 0 t h em o l e c u l a r w e i g h t so fo u 豁i d ec e l lc e l l u l a s eo fg r o u p1 2w e r e9 8 。5 k da n d6 1 。3 k dr e v e a l e db y s d s 尹：a g e 。 t h ee x p e r i m e n t sw e r es e tu pt h r e et r e a t m e n t sf o ra e r o b i cc o m p o s tt e x tw i t hc r o p s t r a wi n c l u d i n gn o - i n o c u l a n t ( c k 0 ，p u r c h a s e dm i c r o b i a li n o c u l a n t s ( c k 2 ) ，s e l f - i n o c u l a n t i o no fm i c r o b i a lg r o u p l 2 0 r e a t m e n td 1 1i n d i c a t o r sw e r et r a c k e db yt e m p e r a t u r e ，w a t e r c o n t e n t ，p h ，c nr a t i o ，a s hc o n t e n t ，c o a r s ef i b e rc o n t e n t ，s o u r ，s e e dg e r m i n a t i o ni n d e x ， t h er e s u l ts h o w e dt h a tc k 2a n dt r e a t m e n tt a v e r a g ec nr a t i oi s1 9 2 7 ，a v e r a g ec o a r s ef i b e r c o n t e n ti s2 1 2 5 ，a v e r a g es o u ri s0 0 3 5m g0 2 ( g h v s ) ，a v e r a g es e e dg e r m i n a t i o n i n d e xi s1 0 1 3 t h r o u g ht h ef o u rc o m p o s | m a t u r i t yi n d i c a t o r so fv a r i a n c ea n a l y s i s ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h e r ei sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ec k la n dc k 2 , c k la n d t r e a t m e n tto ft h ec nr a t i oa n dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nc k 2 a n dt r e a t m e n t 鼍 a n do t h e rt h r e ei n d i c a t o r sh a v en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gc k l ，c k 2a n dt r e a t m e n tt k e yw o r d s ：c e l l u l o s ed e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m s ，c o m p o s i t em i c r o b i a li n o c u l a n t s ，a e r o b i c c o m p o s t , m a t u r i t yi n d e x e so fc o m p o s l 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个入在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成采，也不包含为获得鞠川农泣大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的阏志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中佟了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名川眚 跏够鲁阜岳甓害9 稻 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四j l l 农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 屈方式在不同媒体上发表、传按学位论文豹全部或部分内容。 黜魏郴 导师签名： 7 节子 珏l 荔钐扩年多胃萝汐隧 溯口考辱6 疑事眵鼹 1 文献综述 1 1 概述 我国是农业大圜，每年产生的秸秆6 亿t 以上哆2 0 世纪9 0 年代后期以来，随 着农作物单产提高，秸秆总量迅速增加，广大农民为赶农时、抢播种、图省事，多数 地区就开始集中出现秸秆焚烧现象。大面积焚烧秸秆的现象不仅造成了极大的环境污 染，而且浪费了宝贵的生物资源。 秸秆露天焚烧已成为社会关注的公害，主要体现在以下三个方面：( 1 ) 焚烧后产 生大量的烟雾、烟尘、一氧化碳、二氧化碳、二氧化硫等污染物质，使局部大气环境 质量恶化，诱发呼吸道、肺部疾病等 2 , 3 1 ；( 2 ) 露天焚烧秸秆影响交通安全。焚烧秸 秆产生的大量烟雾，使空气能见度下降，影响飞机正常起降和车辆行驶安全，诱发交 通事故；( 3 ) 影响公共设施安全。在通讯线路、高压输电线路附近焚烧秸秆，容易造 成线路损坏且易诱发火灾事故。 环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点，应用微生物 学方法腐解处理秸秆具有其他物理化学方法不可替代的优点，应用前景广阔。秸秆中 纤维素结构极其复杂，单一微生物对纤维素的分解能力非常弱。所以充分利用自然界 多种微生物的协同关系，人工筛选构建能够产生多种纤维素酶的高效稳定菌株复合 系，是解决秸秆焚烧闻题的关键。 本课题拟在前入研究的基础之上放不同的样品中分离获得高效纤维素降解菌组 合成最优菌株复合系，再通过稚秆的好氧堆肥试验，优化好氧堆肥工艺参数，提高秸 秆腐熟后有机肥的养分，开发出具有商业价值的微生物菌剂。 1 2 秸秆产生及利用现状分析 1 2 。1 我国作物秸秆产生的数量及分布 我国主要作物秸秆就有近2 0 种，且数量大，初步估算年产近6 亿t 以上( 表1 1 ) 。 在不同省区，秸秆产量与种类有明显差距，具体见表1 2 。例如山东、四川、河南、 江苏、河北、湖北等省份数量大，而西藏、海南、宁夏如有些省份则很少【4 1 。 袭1 - 1 我黧2 0 0 2 年农佟耪蘩释产鬟历0 t a b 1 1c r o ps t r a wo u r p u to fc h i n ai n2 0 0 2 ( 1 0 4 t ) 1 2 2 秸秆的处理处置方法 秸秆是一种可以被利用的生物资源，如果将它进行生物的处理，一方面减少了因 随意焚烧带来的污染物质的排放，对环境保护起到了很大的作用；另一方面，使废弃 的物质与能量得到了最大程度的回收与利用【5 l 。 2 。2 。 秸秆的肥料他和饲料化处理技术 ( 1 ) 肥料化 肥料化就是将秸秆与畜禽粪便按一定比例进行混合，剩用细菌、真菌、放线莹等 微生物的分解作用经过分解、发酵，将大分子长链的有机物转化为小分子的葡萄糖、 氨基酸、脂肪酸等，著最终转纯为c 0 2 、黻3 、h 2 0 及无机盐类等，有效的促进秸秆 中的可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程 6 - - s l 。秸秆肥料化的产 品成为堆肥，可以用来生产食用蘸，也可以将秸秆堆肥经过工厂纯粉碎、传输、配料 2 烘干、包装等工序，就可生产出优质有机肥料作为商品出售。 ( 饲料化 作物秸秆经过微生物的厌氧发酵使其营养物质得以保存，并使秸秆中的纤维素得 到一定的分解成为一种优质饲料【9 ，删。熬前通过微生物添加剂制作的青贮饲料相对予 传统的氨化法具有工艺简单，能量和养分损失小，贮存期长等特点，已经广泛应用予 畜牧养殖业。 1 。2 2 2 秸秆的热解处理技术 热解( p y r o l y s i s ) 技术是指将有机物在无氧或缺氧状态下进行加热蒸馏，使有机物 产生裂解，经过冷却后形成的各种新的气态、液态、固态有机物，从中提取出燃料油 和燃料气的技术1 1 1 , 1 2 。目前，嗣内外已经相继开发出多种快速热解技术和工艺方法。 杨昌炎等就利用组合蒸汽汽曝、固态发酵对秸秆分级处理快速热解技术，获待了木糖、 乙醇和燃烧气。 1 2 2 3 秸秆生产可降解材料技术 墨前，不少地方采用新的技术利用稿秆代替零材和塑料，以秸秆孛的纤维素兔基 本原料，开发出许多新型可生物降解的高分子材料，制造出纤维扳、包装箱、建材用 板、降解膜和快餐饭盒等产晶，既减轻了污染，又缓和了木材供应的压力，并逐步成 为个具有发展方向和较大潜力的朝阳产业。此外，利用穗秆降解技术还可以制造乙 醇、淀粉、醋酸纤维素等化工业的原料1 1 鲥霹。 1 。2 。2 4 秸秆厌氧发酵制沼气技术 秸秆等生物质在厌氧环境条件下，可以遥过细菌的作用转化成可燃的气体混合 物，沼气的主要成分是甲烷( 体积分数为5 5 。6 5 ) ，因此称为沼气技术l 翊。沼气可 以壹接燃烧，在农村地区应该大力推广。沼气技术处理可以用来生产具有熊源用途的 涩气终，灌液、沼渣也是优质的肥料与饲料，可以用于还翻或是淡水养殖1 1 默。我国是 世界上沼气利用开展得最多的国家，农村小型的沼气池可以解决单个农户家庭生活燃 料闽题，因此沼气技术在农村地区发挥出巨大的环境效益和生态效益。 1 。3 秸秆腐熟菌剂的研究进展 1 。3 。1 纤维素和纤维素酶的降解机理 纤维素是地球上最丰富、数量最大的可再生资源，通常能占到植物干重的 堇胁l 乃，广泛存在予自然界孛，据估计每年光合作翔产生的纤维素在1 0 0 0 亿吨以上。 3 纤维素分子是由吡喃型d 葡萄糖残基以1 3 1 , 4 糖苷键相连接而构成的具有复杂结构 的结晶分子。纤维素分子的聚合度变化很大，一般为8 0 0 0 - 1 0 0 0 0 个葡萄糖残基。这 种结晶分子先由基本单元构成直链的分子，经折叠形成具有高结晶度的纤维素基本单 位，再由这种基本单位集中构成微小的结构单位，最后由很多的微小结构单位构成不 同类型、长度、大小的纤维素。纤维素链之间通过氢键的作用形成纤维束，在密度大 的地方平行排列，定向良好，形成纤维素的结晶区；密度小的地方定向排列变差，形 成纤维素的无定形区1 1 9 1 。 纤维素酶是一种多组分的酶系，是能降解1 3 1 , 4 糖苷键的一类酶的总称，是一个 由多种水解酶组成复杂酶系i 加2 1 1 。根据酶的功能不同主要分为三类：葡聚糖内切酶 e c 3 2 1 4 ，e n d o 1 ，4 - b d g l u c a n a s e ，也称c x 酶；外切葡聚糖纤维二糖水解酶e c 3 2 1 9 1 ，e x o 1 ，4 - b d g l u c a n a s e ，也称c 1 酶；纤维二糖酶e c 3 2 1 2 1 ，b 1 , 4 - g l u c o s i d a s e ，简称b g 。纤维素酶对纤维素的降解过程是：c x 先作用于纤维素分 子内部的非结晶区，随机水解6 1 , 4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非 还原性末端的小分子纤维素；在通过c 1 酶作用于线性纤维素分子末端，水解1 3 1 , 4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后纤维二糖酶将纤维二糖水解为葡萄糖分子。 纤维素酶的每一个组分又由若干亚基组成，在将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中， 必须依靠三种组分的协同作用才能完成将纤维素彻底降解为葡萄糖【2 2 2 3 1 。 1 3 2 降解纤维素的微生物 自然界中很多细菌、真菌和放线菌都能降解堆肥中的纤维素。主要有以下几种微 生物：细菌。细菌通常是单细胞的，大小为0 5 3 o um ，由于体积小，同时又具有 较大的比表面积，所以细菌能使物质快速进入细胞，因此堆肥中细菌往往比真菌多得 多。大量研究证明，对纤维素具有分解能力的细菌有：芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、假单 胞菌属( p s e u d o m o n a s ) ，纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) ，瘤胃球菌属( r u m i n o c o c c u s ) 等， 最适生长p h 为中性或偏碱性，一般生长温度在3 0 - 4 0 ( 2 2 4 ，2 5 】。真菌。真菌对木质 纤维的分解起着重要作用。真菌一般可分为嗜温真菌和高温真菌，大多数的真菌属于 嗜温真菌，在5 3 7 下生长良好，最佳温度范围是2 5 3 0 * ( 2 。真菌对纤维素、半纤 维素和木质素有很强的分解作用。因为真菌不仅能分泌胞外酶，而且其菌丝具有机械 穿插作用，共同降解堆肥中难降解的纤维素和木质素【2 6 ，2 7 】。典型的代表有意大利青霉 ( p e n i c i l l i u mi t a l y ) 、绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 、 4 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 。 放线菌。尽管放线菌繁殖慢且降解纤维素和木质索的能 力不及真菌，但因为在不利的条件下，放线菌能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各 种酸碱度，所以在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。放线菌可 以从自然界中许多地方分离出来，如沙子、成熟堆肥、马粪和果园土中。典型代表包 括：诺卡氏菌：= - 禹( n o c a r d i a ) ，节杆菌属( a r t h r o b u c t e r ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) ，高温 放线菌属( t h e r m o a c t i n o m y c e s ) ，小单胞菌属( m i c r o n o m o s p o r a ) 。 1 3 3 秸秆腐熟菌剂的开发研究 微生物是秸秆堆肥化处理的工作主体，但各种微生物对不同物质分解能力和分解 速率是不尽相同的，不同温度条件下堆肥过程中出现的微生物种群和数量也截然不 同，因此堆肥处理是一个复杂的微生物混合种群生态系统的变化过程l 凋。只有掌握微 生物的基本生理特性、分离筛选、培育出高效优势菌种，才能获得较好的处理效果。 在堆肥处理中添加单一或者人工组合的微生物种群能有效加快纤维素的分解，缩短发 酵周期，提高堆肥制品的质量1 6 1 。 1 3 3 1 单一微生物菌株接种 早在1 9 3 6 1 9 3 8 年，彭家元和陈禹平就从堆肥中分离筛选出好热性纤维素分解细 菌，并扩大培养后制成菌剂，作为堆肥接种剂应用。新中国成立后，前东北农业科学 研究所推广的菌剂，是从马粪中分离出来的好热性纤维素分解芽孢杆菌，可以用于马 粪的堆腮f 冽。汪恒英等【蚓采用室於堆肥的方法，接种嗜热球杆菌在猪粪堆肥中，考 察了接种荆的作用及对腐熟度的影响。 1 3 3 2 复台微生物菌剂 大量研究表明，堆肥中微生物群落中各个菌种之间的协同作用、相互依赖和各菌 种对环境的苛刻要求等原因，在自然界中的微生物有大部分都是无法通过实验室的培 养基上进行分离培养的，常规的培养基分离培养的方法往往只能得到很小一部分的微 生物阁。在堆肥微生物菌剂的研究方面，有不少学者选择了对些菌株进行组合从而 得到有针对性的微生物菌裁的研究方法。研究者就可以按照自己的意图配置有一定功 能，对堆肥有针对性的微生物菌剂。由于所使用的微生物不少是从堆肥中分离，且微 生物菌株在使用前都经过了反复的驯化和培养，而且都具有一些有益于堆肥进程的生 理生化功能，能够较好的参与堆肥的进程，与其他微生物发挥协同作用，对堆肥的环 境有较好的适应性。所以这种微生物菌剂均能在堆肥中发挥积极的作用f 3 2 捌。接种复 s 合微生物菌粼键进堆肥进程的枫理有1 3 4 捌：( 1 ) 提离堆照初期的微生物群体，增强微 生物的降解活性；( 2 ) 缩短达到高温的时间；( 3 ) 促进难降解有机物向腐殖质的转化 过程。 目前，国内外对于复合微生物菌剂的研究已经有了较大的进展，相比于传统的自 然堆肥甓要缩短了堆鼹露闻，提燕了发酵瀑度，蓑够杀死大量的寄生虫辩和病暴微生 物。刘悦秋【3 6 】用中温菌和高温菌制成丁微生物菌剂。邱向阳【3 7 1 等在秸秆堆肥体系中， ；| ：乏纤维素荑难一碳漂筛选到一蹴具有较高纤维素降解熊力酶微生物菌裁，拐步统计有 3 2 种表型，其中7 种为真菌，2 5 种细菌。通过进步的试验，得到了4 组高效组合 菌翔，能在箱逡快速扇动滤纸条降解，并痒为花卉秸释高效堆腮的复合降解徽生物 菌剂。黄得扬等【湖以滇池流域典型的蔬菜废物和花卉秸秆作为堆肥原料，以自己筛选、 保存酶1 7 株纤维素降解蔼耩l 椿购买的产黄纤维单施壤为复合接瓣裁进行了研究。 黄丹莲等1 3 9 1 对接种臼腐麓堆肥处理含木质素垃圾做了系统研究。李秀艳纠删接种适 用于7 0 8 0 c 高温环境懿高皴微生物蔼裁，进行中试规模的城市生活垃圾高温好氧 堆肥处理试验研究。 酵素菌是由西本微生物专家岛本觉也先生予世纪籀年彳弋研究开发，黼年代 目渐成熟并广泛应用于种植业，环保等方面的微生物技术。酵素菌是由细荫、真菌和 放线菌3 类微生物2 4 种益菌组成，它们在生理活动和新陈代谢中产生多种酶和活性 物质。因此，在分解难溶矿物质、纤维素等时能力增强，从而提高了这些物质的转化 率和利用率，是快速堆制高质量农肥的催腐荆f 4 n 。西本科学家比嘉照夫教授 4 2 , 4 3 1 研究 了包括自麓荣、纤维素降解裁、凰氮菌等的复会菌剂e m 菌剂的威用与堆肥已取得了 相当的成功。 席北斗等在堆肥接种刹上进行了一系列研究。首先通过测定堆肥过程中总菌数、 温度、有机物、c n 等，较系统地研究了高效复合微生物菌群在生活垃圾、污泥混合 堆肥系统串的作用l 蝴。其次研究了以复合微生物菌剂为接种剂，堆腮中的h 2 s 气体 浓度均低予1 0 m g m 3 ，而对照最高浓度达5 0 m g m 3 以上，可见添加接种剂不仅加快堆 照的反建速率，箍且可以控制h 2 s 等恶臭气体的产生，改善堆肥环境l 嫂。另外还研 究了纤维素分解菌和e m 菌协同作用在有机废弃物堆肥中的应用f 搠。 。4 秸秆堆肥他的原理及研究进展 1 41 堆肥的基本原理 6 堆肥化( c o m p o s t i n g ) ：是在人工控制的条件下，将要堆沤的秸秆等有机固体废弃 物原料按一定的比例混合，在一定温度、水分和通风等条件下在微生物作用产生的高 温条件下分解有机物，形成类似腐殖质的物质，从而达到原料的无害化和资源化的技 术方法【鼬7 删。堆肥化的产物成为堆j e ( c o m p o s t ) 。它是经过堆肥纯过程所形成的像腐 殖质一样的棕黑色、具有壤气味熬疏松物质，可用作肥料提高植物的产量和壤改 良剂。它不含危害人类及植物的病原菌及寄生虫卵，不吸引滋生蚊虫，可以无害化操 作及贮藏【4 9 1 。 在堆肥过程中，可溶性有机物质可透过微生物细胞壁和细胞膜被微生物直接吸 收；而不溶的胶体物质，先被吸附在微生物体外，依靠微生物分泌的胞外酶分解为可 溶性物质，在渗入细胞。微生物通过自身的生命代谢活动，进行分解代谢和合成代谢， 把一部分吸收的有机物氧化成简单的无视物，并释放出供微生物生长活动所需要的能 量，再把另一部分有机物转化合成叛的细胞物质，使微生物继续生长繁殖，产生更多 的生物体。 根据堆肥微生物生长的环境差异，可以将堆肥化分为好氧堆肥和厌氧堆肥两种。 厌氧堆肥化是在无氧条件下，厌氧微生物对废物中的有机物进行分解转化的过程。因 为厌氧微生物对有机物分解速度缓慢，处理效率低，容易产生恶臭，其工艺条件也较 难控制，因此利用较少。好氧堆肥是将要堆腐的有机物料与填充料按一定比例混合， 品讨 在适宜条件下堆腐，使微生物繁殖并降解有橇质，高温杀死其中的病菌，从悉使固体 有机废弃物达到稳定化。由于好氧堆肥堆体温度高( 一般在5 0 6 5 ) ，敖又称为高 温好氧堆肥。通常所说的堆肥化一般是指好氧堆肥化。好氧堆肥中堆肥温度较高，堆 肥微生物活性强，有机物分解速度快，降解更彻底：而且在堆肥过程中，经过高温的 灭菌作用，能够杀死固体废物中的病原菌、寄生虫卵等，提高堆肥的安全性能【刊。 1 4 2 堆肥过程 好氧高温堆肥从物料的堆积到腐熟，微生物的生化过程比较复杂，根据堆肥过程 中温度的变化，可将其分为三个阶段。其内部微生物群落由于生境的改变，不断进行 着囊我调整，发生生态位的分离，实现蒸落的演替【3 3 5 1 创。 ( 羔) 中温阶段 好氧高温堆肥过程中温度的升高是由于好氧微生物在分解有机物过程中释放出 的热量造成的。堆肥初期，堆层基本呈中温，嗜温性微生物较为活跃，并利用堆肥中 7 可溶性有机物质( 单糖、脂肪、和碳水纯合物) 旺盛繁殖。它们在转换和利用化学能 的过程中，有部分变成热能，由于堆料有保温作用，温度不断上升。 ( 2 ) 高温阶段 当堆肥温度上升到4 5 以上时，即进入高温阶段。此时，嗜温性微生物受到抑 制甚至死亡，取而代之的是一系列嗜热性微生物。堆肥中一些难分解的有机物( 半纤 维素、纤维素和本质素等) 也开始分解，腐殖质开始形成，堆肥物质进入稳定状态。 高温阶段，各种嗜热性微生物的最适温度也是不相同的，在堆肥温度上升过程中，嗜 热性微生物的类群和种类是相互接替的，般在5 0 左右进行活动的主要是嗜热性 真菌和放线菌；温度上升到6 0 时，真菌几乎完全停止活动，仅有嗜热性敖线菌和 细菌在活动；温度上升到7 0 以上时，堆大多数嗜热性微生物已不适宜，微生物大 量死亡或进入休眠状态，除一些孢子外，所有的病原微生物都会在几小时内死亡。 ( 3 ) 腐熟阶段 经过高温阶段，堆肥中的有机物基本降解完，只剩下部分较难分解及难分解的有 机物和新形成的腐殖质，嗜热微生物由于缺乏适当的营养物质丽停止生长，生物活性 下降，发热量减少，堆肥温度会嘲于散热而逐渐下降。在此阶段，中温微生物又开始 活跃起来，重新成为优势菌，对残余较难分解的有机物进一步分解，腐殖质不峨增多， 且稳定化。 1 。4 3 堆肥的影响因素 堆肥过程是可降解有机物在微生物作用下的分解、稳定化的过程，该过程与微生 物的生殖繁衍及堆料成分有直接的关系。影响堆肥生物降解纯过程( 特别是主发酵) 的因素有很多，对于好氧发酵堆肥工艺来说，堆料温度、含水率、通风供氧是最主要 的发酵条件，其他的还存有机质含量，颗粒度、c n 比、p 弑等。通过合理调控这些 因素，可以改变好氧堆肥中有机物的降解速率和最终堆肥产品的品质。 ( 1 ) 温度 温度是影响微生物生长与繁殖的最显著因子，对堆肥的反应速率起着决定性的作 用。通常情况下可将温度作为堆料中生物生化活动的宏观指标。不同的堆料、不同的 配料比例出现不同的堆体最高温度、保持高温的时间以及在堆体不同空间位置温度的 分布。微生物活性的最佳范围为3 5 - 5 0 1 2 ，在4 9 5 时微生物的多样性相似，当温 度大于6 0 ( 2 时，多样性显著减少【5 5 l 。工程上要求堆肥温度控制在微生物活性的最佳 8 范围上限，即5 0 一6 0 。 ( 2 ) 含水率 堆料中适当的水分可以为微生物供给用来溶解养分的溶剂，所以堆料中要保持一 定的含水率。僵求分过高，将会影响堆料的气体输送，造成某些区域接近厌氧，严重 影响了微生物的好氧代谢过程，造成了恶臭；水分过低，会影响微生物的生长代谢， 导致堆体温度难以上升，从覆降低反应速度。众多研究表吲5 6 1 ：初始含水率5 0 - - 6 0 为最佳，在整个堆肥化过程中水分含量也不应超出这个范围。 3 ) 透风供氧 众研究表吲5 7 9 1 ：堆料中氧含量为1 0 时，就能保证微生物代谢的需要。在供 氧量充分及其他条件适宜的情况下，微生物迅速分解有机物质，阐时产生大量的代谢 热，导致堆体温度上升，如果没有采取增加鼓风量或翻堆等措施，就会容易造成堆体 温度过高，抑制有机物的生物降解，进丽影响堆肥佬进程。目前，国内外通常采用控 1 ： 制堆体温度方法，将堆体温度设定在某个极限温度下，当堆体温度接近这个温度时， 鼓风量将增加，以带走过多的热量，馒雄体温度下降。 ( 4 ) p h 值 p h 值是一个可以对微生物环境律为评价的参数，对微生物的生长也是重要因素 之一i 印6 。p h 过高或过低，都不利于微生物的生长和繁殖，进而就不能最大的发挥 降解有机物质的能力，一般认为p h 在7 5 书5 时为最好。不同的堆肥原料有不同的 初始p h ，可以用添加调理剂的措施加以改善。 ( 5 ) c n 比 秸秆堆肥要求用畜禽粪便调节其碳氮比达到合适的水平，以利于微生物的作用。 微生物能够生长良好并保持较高的代谢速率与堆肥物料的c n 比有密切关系。有机 物被微生物分解速度随c n 比丽变，一般认为初始的c n 值在2 5 ：l 旬0 ：1 或者3 0 ： l 5 ：1 较为适宜 6 2 - 6 5 1 。 1 5 堆肥腐熟度评价指标的研究现状 1 5 1 腐熟度的概念 腐熬度( m a t u r i t y ) 就是堆肥腐熟的程度，郎堆肥中的有机质经过矿纯、腐殖化 过程后达到稳定的程度【6 l 。腐熟度作为衡量堆肥产品的质量指标早就被提出来了，它 的基本含义是：通过微生物的作用，壤肥产品要达到稳定化、无害化，亦即不对环 9 境产生不良影响；堆肥产品使用不影响作物的成长和土壤耕作能力。腐熟度是国际 上公认的衡量堆肥反应进行程度的一个概念性参数。 1 5 2 腐熟度的评价指标 完全腐熟的堆肥中含有有机质、p 、k 等多种植物所需的养分，施入土壤后，不 仅可以提高农林等产品的产量，而且可以明显改善土壤结构，提高土壤肥力。但堆肥 没有完全腐熟就施入土壤，会造成植物缺n ，影响植物的生长；所有未腐熟的堆肥施 入土壤后，会引起微生物的剧烈活动导致氧的缺乏，从而产生厌氧环境，影响根系的 生长；同时，未腐熟的堆肥在这种条件下还会产生大量中间代谢产物有机酸( 如 丁酸、戊酸、己酸、庚酸) 及还原条件下产生n h 3 、h 2 s 等有害气体，这些物质严重 毒害植物的根系，影响作物的正常生长；另外，未腐熟的堆肥散发的臭味给利用也带 来了很大的不便。为了避免这些问题，并保证堆肥的腐熟度是堆肥工艺和堆肥产品的 质量控制的重要内容，多年来，国内外许多研究人员对腐熟度进行了多方面的研究和 探讨，提出了许多评价腐熟度的方法或指标( 表1 3 ) 。但由于堆肥产品本身成分的 复杂性和多样性，在众多的工艺和化学参数中，究竟以哪一个参数作为统一的腐熟度 评价标准，至今仍没有一个权威的论断。 表1 - 3 评价堆肥腐熟度的方法和指标1 6 6 i t a b 1 3m e a s u r e sa n di n d e x so fm a t u r i t ya c e s s m e n t 方法名称参数、指标或项目 物理方法 化学方法 生物活性 植物毒性分析 1 温度 2 气味 3 颜色 4 残余浊度和水电导率 1 碳氮比( 洲) 2 氮化合物( t n 、n h g - n 、n 0 3 - n 、n o n - n ) 3 阳离子交换量( c e c ) 4 有机化合物( 水溶形有机碳、还原糖、脂类等化合物、纤维素、半纤维素、淀粉等) 5 腐殖质( 腐殖质指数、腐殖质总量和功能基团) 1 呼吸作用 2 微生物种群和数量 3 酶学分析( 脱氢酶、b 葡萄糖苷酶、碱性磷酸脂酶、尿酶等) 1 种子发芽实验 2 植物生长实验 1 0 1 5 3 腐熟度的综合评价体系 由于堆肥过程中有机物降解的复杂性，单一指标无法全面反映实际的堆肥的腐熟 度。所以近年来，很多学者采用多个指标从不同侧面来综合评价堆肥的腐熟度。陈志 强l 明等通过试验对c n 、温度、耗氧速率、氧化还原电位等参数的研究，提出了以耗 氧速率和c n 比作为堆肥腐熟度指标。s w i t z e n b a u m 6 s l 等在研究堆肥的稳定性评价中， 建议采用c 0 2 产生率或耗氧速率连同自升温方法来评价。美国加利福尼亚堆肥质量 协会提爨了自己的c c q c 腐熟度评价指标嘲，这个指标由三部分组成：先将c n r 2 5 作为强制性指标，再从a ，b 组中至少选择一个参数来评价。a 组参数包括：c 0 2 产生率、耗氧速率和自升温检测；b 组参数包括：臣+ n 、n 0 3 。n 、n 0 2 n 浓度、 挥发性有机酸浓度和植物生长试验。稳定化特征。同时，学者们将数学的方法应用于 堆肥腐熟度的评价中采用了单指数法、灰色关联法f 7 d 1 、模糊数学f 7 1 删、灰色聚类法吧】、 神经网络i 鼬蚓等综合分析方法。 1 6 本论文研究的目的意义 本课题拟在前入研究的基础之上从不同的样品中分离获得高效纤维索降解菌，并 筛选出最优蓥株复合系，再通过秸秆的好氧堆肥试验，优化好氧堆肥工艺参数，提高 秸秆腐熟后有帆肥的养分，最终为解决成都平原地区秸秆露天焚烧现象严重的情况开 发如具有商业价值的微生物菌剂。同时采用多个参数利用综合评价方法来判断堆肥的 腐熟程度，为秸秆秸秆堆肥的腐熟度判断提供判断依据。 2 材料与方法 2 。材料 2 1 1 样品 ( 1 ) 纤维素降解菌分离样品有：牛粪、猪粪、水稻、小麦秸秆等的自然堆肥及肥沃 土壤，2 0 0 6 年5 月采集予四川省成都市邛崃基地，样品采集后，剔出石块等杂物， 带回实验室后置于冰箱4 保存，及时分离。 ( 2 ) 处理的有机固体废弃物 小麦和水稻秸秆取自成都市近郊农田，牛粪取自洪雅奶牛养殖场。 2 。1 。2 培养基 ( 1 ) 基础培养基牛肉膏蛋白胨、高氏一号、p d a 删。 ( 2 ) 发酵培养基c m c - n a5 0 9 ：蛋盘胨5 0 9 ：酵母粉1 0 9 ；k h 2 p 0 40 5 9 ；m g s 瓯 0 2 5 9 ；水1 0 0 0 m l tp h7 0 i s 4 矧。 ( 3 ) 检测培养基必纤维素刚果红培养基。其配置方法为：微器纾维素王。8 踺，刚果红 0 2 9 ，明胶2 0 9 ，琼脂2 0 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 。 4 ) 在发酵培养基中放入一根1 0 c r u x 5 。0 c r n 的滤纸条作为底物降解试验的终观指 标。 2 。2 方法 2 2 1 好氧纤维素降勰菌的分离、筛选与纯化 好氧纤维素降解菌的分离、筛选与纯化方法参照文献f 繇】瞵1 ，具体操作方法如下： ( 1 ) 将采集的样品稀释到一定的程度，吸取l m l 稀释液放入无菌培养艇中，倒入纤 维素刚果红培养基作混菌平板，置于2 8 0 培养，挑选出在平板上生长快且水解圈大 的培养物。 ( 2 ) 将采集的样品点接予纤维素琼脂平板上，置于2 8 恒温培养箱中培养，挑选出 在乎板上生长快、透明圈大的培养物。 ( 3 ) 将挑取出的培养物在羧甲基纤维素培养基上反复划线和用稀释平板法筛选出单 个菌落，结合显微镜镜检，直至纯纯得到纯蔼株。另接种斜丽保存以备用。 2 2 2 高效秸秆降解菌的筛选 参考叶姜瑜的纤维素刚果红平板透明圈筛选法 8 7 1 。纤维素刚果红平板透明圈直径 ( 聊与菌落直径( d ) 的比值( d d ) f i 用于初步判断纤维素降解菌酶活力的大小，其大小直 接反映了纤维素酶浓度的相对高低 绷。 2 2 。3 菌种鉴定 2 。2 。3 。 细菌的鉴定 形态观察和生理生化特性的测定按一般细菌常用鉴定方法眇l 和常见细菌系 统鉴定手册【如1 。细菌的鉴定项目：革兰氏染色、菌体大小、芽孢有无、运动性、需 氧性、接触酶、碳源利用( 产酸、产气) 、柠檬酸盐利用、酒石酸盐利用、耐盐性、 淀粉水解、硝酸盐还原、产氨试验、明胶液化试验、纤维素分解、色氨酸脱氢酶、牛 奶分解试验等。 2 2 。3 2 真菌的鉴定 真慧鉴定主要依据真菌鉴定手册【9 玎，以菌落特征和形态特征为主。 2 。2 。3 ，3 放线菌的鉴定 放线菌鉴定按链霉菌鉴定手册【9 2 l 和放线菌研究应用【9 3 l 。以形态和培养 特征为主，培养特征主要有孢子丝与孢予的颜色、气生菌丝的颜色、基内菌丝的颜色、 可溶性色素以及菌落特征等。 2 2 4 纤维素降解菌复合系的构建 2 2 4 1 菌株问的拮抗关系试验 将筛选出的高效纤维素降解菌株作接抗试验。操作方法为：将两种不同的菌株在 羧甲基纤维素培养基平板上划线但不相交，观察生长过程中是否有拮抗、抑制孢子的 生成等现象。 2 2 4 2 纤维素降解菌复合系的构建 挑选经过刚果红培养基检测具有较高纤维素酶的1 2 个菌株、2 株自身固氮菌以 及e m 菌裁进行正交实验，将各种菌株和e m 菌荆按正交表分别接种到装有1 0 0 m l 液体发酵培养基的2 5 0 m l 三惫瓶中，置于3 0 恒溢摇床，1 2 0 r r a i n 下振荡培养，嚣 测各瓶液体培养基中滤纸条溃烂的情况，以确定高效降解纤维素的最优菌种复合系。 2 2 。5 纤维素降解菌复合系的产酶条件研究 2 。2 。5 。l 纤维素酶活测定方法 纤维素降解菌酶活力的复测参考王琳【9 6 l 的方法，采用d n s 法测定纤维素c m c 酶活力。每分钟产生1l lg 葡萄糖定义为1 个酶活力单位( u ) 。 2 。2 。5 2 培养起始洲对复合系产酶的影响 在2 5 0 m l 三焦瓶中装入1 0 0 m l 液体发酵培养基，将液体培养基的起始p h 分别调 到5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 ，在3 0 ，1 2 0 r m i n 下振荡培养4 d 后，测定c m c 酶活。 2 2 5 3 培养温度对复合系产酶的影响 将接种过的1 0 0 m l 液体发酵培养基分别至于2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 下， 1 2 0 r m i n 振荡培养钳后，测定其c m c 酶活。 2 。2 5 。毒培养时闫对复合系产酶的影响 将接穗好的1 0 0 m l 液体培养基( p h6 。5 ) 置于恒温振荡培养箱中，3 0 c ，1 2 0 r r a i n 下连续培养，每2 4 h 测定一次c m e 酶活 2 2 5 。5 碳源对复合系产酶的影响 在2 5 0 m l 三角瓶中装入1 0 0 m l 液体发酵培养基，加入不同的o 5 可溶性碳源或 l 不可溶性碳源，于3 0 ，1 2 0 r m i n 下振荡培养4 d ，测定c m c 酶活。试验选用的 碳源物质( 或组合) 有8 种分别为：c m c - n a ；葡萄糖；甘露醇；微晶纤维素；蔗糖； c 磁c i + 徽晶纤维素；葡萄糖+ 微晶纤维素；葡萄糖+ c m c - n a 。 2 2 。5 。6 氮源对复合系产酶的影响 在2 5 0 m l 三兔瓶中装入1 0 0 m l 液体发酵培养基，加入不同的氮源，含量为0 4 ， 于3 0 ，1 2 0 r m i n 下振荡培养4 d ，测定c m c 酶活。氮源物质( 或组合) 有8 种分 别为：n h 4 n 0 3 ：n h 4 c i ：2 s 0 4 ；酵母膏蛋白胨；酵母膏+ 蛋白胨；k n 0 3 ；尿 素。 2 2 5 7 设计正交试验 以复合碳源、复合氮源、k h 2 p 0 4 和m g s 0 4 四个试验因素，按芷交表k ( 2 3 ) 设 计正交试验。复合碳源：c m c - n a + 微晶纤维素( 2 ) 1 ：2 、1 ：3 、1 ：4 ，复合氮源：蛋 白胨+ 酵母浸粉( 0 。4 ) 3 ：1 、2 ：1 、1 ：1 ，k h 2 p 0 4 ：0 1 5 、0 3 0 、0 4