苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子β1的影响 .doc

苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子1的影响 摘要目的：研究苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及转化生长因子1(TGF-1)表达的影响，阐明其抗肝纤维化的作用机制。方法：用甲基噻唑基四唑MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)比色法、HE染色及免疫细胞化学技术分别检测小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3)增殖、形态学及TGF-1的表达。结果：苦参素能明显抑制成纤维细胞增殖及TGF-1的表达，并呈剂量依赖性。结论：苦参素可通过抑制成纤维细胞增殖及TGF-1的表达而起到抗肝纤维化作用。 Affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of TGF-1 ABSTRACTAIM:To study the affect of kwoninone on fibroblastic proliferation, morphology and expression of transforming growth factor-beta (TGF-1) and elucidate its mechanism in fibrosis.METHODS: The proliferation, morphology and expression of TGF-1 of fibroblast was measured by MTT bioassay, HE dyeing and immunocytochemistry.RESULTS: The kwoninone has an could significantly inhibit fibroblastic proliferation, growth and expression of TGF-1 in concentration-dependent manner.CONCLUSION: The kwoninone anti-hepatic fibrosis effect through inhibiting fibroblastic proliferation, growth, and expression of TGF-1. KEY WORDSkwoninone; fibroblasts; transforming growth factor beta; sophora subprastrata 苦参素(k woninone)，是从中药广豆根(Sophora Subpsostarata)中分离所得生物碱类，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗肿瘤等生物学作用1。近来有研究报道，用它治疗慢性肝炎，可有效的降低ALT、改善临床症状、并使乙型肝炎及丙型肝炎病毒标志物转阴、减轻炎性细胞浸润及肝细胞坏死，另具有防治肝纤维化作用2-4。本研究以小鼠皮肤成纤维母细胞(NIH3T3)为靶细胞，从细胞及细胞因子水平研究苦参素对成纤维细胞增殖、生长及转化生长因子1(TGF-1)表达的影响，以期从细胞及细胞因子水平阐述苦参素抗肝纤维化作用机制，为临床用于肝纤维化的防治提供更多的理论基础。 材料与仪器靶细胞：NIH3T3细胞株(购于中国科学院上海细胞所)。苦参素注射液(2 mL:200 mg，批号980215，上海第一生化药业公司)，RPMI1640培养基、小牛血清、胰酶、甲基噻唑基四唑(MTT，华舜生物试剂公司)，二甲基亚砜(DMSO)，苏木精染液，伊红染液；TGF-1免疫组织化学染色试剂盒，DAB显色试剂盒。B5060EX二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司产品)，37XAZ倒置生物显微镜(上海光学仪器厂)，Olympus光学显微镜，DG-3022型酶联免疫检测仪(南京华东电子管厂)，YS-875A净化工作台。 方法 1MTT法检测不同浓度的苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响用0.25%胰蛋白酶消化单层培养NIH3T3细胞，用含10%的小牛血清RPMI1640培养液稀释为单个细胞悬液(5107个L-1)，接种于96孔培养板，每孔100 L，同时每孔加入经培养液倍比稀释的苦参素100 L，至苦参素终浓度分别为31.3，62.5，125，250，500，1000 mgL-1，每种浓度设3个复孔；并设对照孔3个，不加苦参素，而加入等量的培养液；另设空白对照孔3个，不加细胞，其他条件与前相同。同时，在相同条件下用同样方法再接种另2块96孔培养板。将培养板移入CO2孵箱中，培养48 h后，每孔加入MTT溶液(5 gL-1，PBS)20 L，37 继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 L DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，选择490 nm波长，以空白对照孔调零，检测各孔光吸收值，将所得结果进行统计学分析。 2苦参素对成纤维细胞形态学及TGF-1的影响制细胞爬片：将生长良好的NIH3T3细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为1108个L-1，接种于含盖玻片的2块培养皿中，其中一块加入苦参素使终浓度为500 mgL-1，另一块加入等量的培养液，放入CO2孵箱培养23 d，待细胞基本长成单层，取出盖玻片，95%乙醇固定。HE染色；TGF-1免疫细胞化学染色：将经苦参素处理和未处理的细胞爬片各一块，滴加适当稀释的一抗(小鼠TGF-1单抗)，37 孵育1.5 h，0.01 molL-1的PBS洗2 min，2次；滴加山羊抗小鼠IgG，37 孵育15 min，0.01 molL-1的PBS洗2 min，2次；滴加试剂APA-兔抗山羊IgG,37 ，20 min, 0.01 molL-1PBS洗5 min，4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察，照相保留结果。 3统计学方法t检验，P0.05为有显著意义。 结果 1苦参素对NIH3T3细胞增殖的影响不同浓度的苦参素作用于NIH3T3细胞48 h后，平均每孔的吸光度如表1所示，当苦参素浓度达到62.5 mgL-1时，NIH3T3细胞增殖活性受到明显抑制(P0.05)，并呈剂量依赖性。 表1MTT法检测苦参素对NI H3T3细胞增殖 的影响(n=9,s) 组别 浓度/mgL-1 吸收度(OD) 对照 0 0.4470.013 1 31.3 0.4310.020a 2 62.5 0.3380.014b 3 125 0.2720.016c 4 250 0.2210.019ce 5 500 0.1990.021c 6 1000 0.1790.020ce 各组与对照组比较经t检验：aP0.05,bP0.05,cP0.01;4,6与2组间比较经t检验：eP0.05。 2苦参素对NIH3T3细胞形态学的影响对照组细胞胞体较大，胞浆丰富，胞突多，呈多角型，胞核大，处于核分裂期细胞多。苦参素处理组NIH3T3细胞胞体较小，胞突少，多呈梭型或圆形，胞核较小，处于核分裂期细胞较少。如图1所示： 3苦参素对成纤维细胞TGF-1表达的影响经TGF-1免疫细胞化学法染色，在显微镜下可以观察到，苦参素处理组成纤维细胞胞浆内棕黄色颗粒弱、量少，呈弱阳性；而正常对照组成纤维细胞胞浆内呈强阳性，这说明苦参素能抑制成纤维细胞TGF-1的表达。结果如图2所示： 讨论肝纤维化发生的主要机制是肝细胞外基质(ECM)的过度增多和异常沉积，这一过程是不断变化的，重要的是肝脏多种细胞(如贮脂细胞)产生细胞外基质，而后者又反过来影响细胞的发生、分化、增殖、粘附和表型的表达，这种相互作用又是由多种细胞因子介导的。近年研究表明，贮脂细胞是肝纤维化细胞外基质的主要来源细胞5，在肝损伤时，贮脂细胞能合成除V型胶原外的几乎所有的ECM成分，肝细胞坏死的刺激能激活贮脂细胞并使之增殖，贮脂细胞增殖后表型发生改变，显著的表型变化使之转变为肌纤维母细胞(myofibroblasts)和成纤维细胞，后者是产生ECM的主要细胞，对肝纤维化的形成起主要作用6。 近年研究也表明TGF-1是促进肝纤维化形成的一重要细胞因子，肝纤维化时，门脉周围细胞、导管周围细胞、肝小叶中央静脉周围细胞与肝包膜间质细胞等部位TGF-1mRNA转录明显增加7。TGF-1的突出作用是促进胶原与基质的形成，同时抑制其降解。它还能促进贮脂细胞向肌成纤维细胞样细胞的转化，促进肝细胞的增殖；还可增加纤连蛋白(FN)及蛋白多糖(PG)的合成，并促进FN和胶原在细胞外基质中的沉积；此外TGF-1还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生，以及促进组织抑制因子(如金属蛋白酶，2巨球蛋白等前纤维蛋白溶酶抑制物)的分泌，来减少胶原的降解8。有研究表明肝纤维化时，肝脏间质细胞如贮脂细胞、内皮细胞、库普弗细胞(昔名枯否氏细胞)等通过自分泌或旁分泌TGF-，调节贮脂细胞及肝细胞等合成细胞外基质，促进肝纤维化形成9，10。 本实验以肝纤维化研究常用的模型细胞NIH3T3(小鼠皮肤成纤维母细胞)为靶细胞，研究苦参素对成纤维细胞增殖、形态学及TGF-1