（环境科学与工程专业论文）高效富油去除氨氮微藻的选育及其特性研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文 ii screening of efficient degradation of ammonia oil-rich microalgae and its characteristics abstract with the rapid development of world economy, biodiesel, as the alternative energy of petroleum diesel ,caught the attention.however,the supply of raw material,the prices of raw material and the imperfect policy ,become the key constraint which restrict the development of bio-diesel, especially ,the supply of raw materials has become the bottleneck of the development of bio-diesel. among many raw materials of biodiesel, the alga, due to its advantages of high biomass, short growth cycle, easy to train, and the high lipid, becomes an ideal material for biodiesel, and it has a broad prospect of development. simultaneously, using waste water to plant oil-rich microalgae, not only reduces the cost of microalgae production, but also restores water pollution, so it becomes the feasible solution to the inadequate supply of biodiesel raw materials and the problems of raw material prices. the subject based on the screening of oil-rich algae species. combined the culture of algae with the treatment of water pollution.taking use of oil-rich microalgae to reduce the n, p and other nutrients, change them into its own composition, promote the growth of algae, by controlling the culture conditions, to improve the oil content of algae cells, to look forward to obtaining an oil-rich algae which can removal ammonia and nitrogen efficiently.the main experimental results are as follows: (1)select high oil content algae named z-4 from natural eutrophic water,and determine the best medium chu no.10 medium; (2)culture medium with different concentrations of nutrients will affect the growth of algae z-4, single factor test results show that: the best carbon source is10g/l sucrose, the best source is 0.0625g / l urea, the best concentration of k2hpo4 is 0.04g/l, and the best initial ph is 9.5.through orthogonal test, obtained the best algal culture conditions is: 7.5g/l sucrose, 0.0625g/l urea, 0.04g/l k2hpo4, initial ph 9.5. (3)culture medium with different concentrations of nutrients will also affect the oil content within the algae cells.single factor test results show that the oil content of 福建农林大学硕士学位论文 iii algal cells increase to the maximum when the medium contains 20g/l sucrose, 0.375g/l of urea,0.01g/l k2hpo4, initial ph of 6.5.through orthogonal test,obtained the best culture conditions when the oil content of algal cells increase to the maximum is:15g/l sucrose, 0.1563g/l urea, 0.08g/lk2hpo4 , initial ph 7.5. (4)growing the algal by swine wastewater, we can found that low concentrations of swine wastewater is suitable for the growth of algae,and under conditions of low concentration,the degradation of ammonia is good,the treated waste water is lower than the standards of breeding industry sources.the results show that it will help algae cells increased fat content when we mix 0.04 g/l na2co3 and 1mla5 solution into the concentration of 40% of the wastewater. keywords：biodiesel； oil-rich algae；chu no. 10 medium；removal of ammonia； the fat 独创性声明独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士学位论文 1 第一章第一章 前言前言 1.1 生物柴油概述生物柴油概述 随着全球经济一体化的不断发展， 石油作为战略资源已成为世界各国能源经 济的主要内容。近几年，世界原油产量持续减少，预计到 2018 年将下降至 75 亿 桶年，仅相当于 1950 年的原油产量1, 2，同时伴随着全球范围内不断增加的能 源需求、石油价格飙升以及日益严格的环保要求，发展替代能源成了世界各国保 障能源安全的重大战略举措。近年来生物柴油作为化石能源的替代燃料，已成为 国际上发展最快、应用最广的环保可再生能源。 生物柴油（biodiesel）是指由大豆油，蓖麻油以及工程微藻等水生植物油脂 或者动物脂肪等油脂类物质与短链醇(如甲醇、乙醇等)，经过酯交换反应而得到 的有机脂肪酸酯类物质。生物柴油作为一种可再生替代能源，其生产成本和使用 性能都与现代石化柴油基本相当，且具有来源广泛、可再生、燃烧充分等优点， 其环境友好性和可再生性使其具有很强的竞争力2。 1.1.1 生物柴油性质生物柴油性质 与石化柴油相比，生物柴油具有以下多方面的性质，同时这也是生物柴油的 优点 1,3,5,6： 1、具有良好的环保特性。生物柴油含硫极低，且不含对环境造成污染的芳 香烃，因此排除的有害气体比石化柴油低 40%70%。表 1-1 为 20%混合生物柴 油、 100%生物柴油与标准柴油尾气排放比较变化数据4。 使用生物柴油的发动机 不仅满足目前的欧标准，甚至满足更加严格的欧标准。 表 1-1 tailpipe emission change with biodiesel fuels emission b100 b20 carbon monoxide -43.2% -12.6% hydrocarbons -56.3% -11.0% particulates -55.4% -18.0% nitrogen oxides +5.8% +1.2% air toxics -60% to -90% -12% to -20% mutagenicity -80% to -90% -20% carbon dioxide* -78.3% -15.7% 2、生物柴油的闪点较石化柴油高，有利于安全运输和储存；十六烷值高， 一般大于 50，抗爆性能优于石化柴油； 3、在生物柴油燃烧后排出的废气中，微粒子、碳氢化合物和一氧化碳含量 福建农林大学硕士学位论文 2 少，且对人畜无毒性，具有环境友好性，生物分解性良好（98%可分解）。 4、与其他替代燃料如二甲醚、氢燃料和压缩天然气等相比，使用生物柴油 的系统投资少，不需添加或者改动设备即可直接添加使用。 5、既可作为添加剂促进燃烧效果，又是燃料，具有双重效果。 6、生物柴油比石化柴油具有相对较高的运动黏度，这使得生物柴油在不影 响燃油雾化的情况下，更容易在汽缸内壁形成一层油膜，从而提高运动机件润滑 性，降低机件磨损。 生物柴油正是具有了上述的优良特性， 使得其作为一种新型可再生能源成为 当今各国的研究重点，若能实现大规模产业化生产和销售，将具有极大的市场发 展空间。 1.1.2 生物柴油发展现状生物柴油发展现状 近年来，生物柴油作为新兴的产业在世界各国得到大力推广，尤其是在欧美 等发达国家得到了高速的发展。 （一）国外发展的情况 欧盟国家和美国政府纷纷制定优惠政策，鼓励本国企业发展生物柴油产业， 使得生物柴油价格与石化柴油相当，具有较强的市场竞争力，因此发展势头十分 强劲。其中，欧盟是全世界发展生物柴油最快的地区7，据欧洲生物柴油委员会 公布的数据，2002 年欧盟生物柴油生产总量为 106.5 万吨，2003 年达到 143.4 万 吨，增加了 35%，2006 年达到 450 万吨，2010 年预计可达 1350 万吨，生物柴油 在柴油市场中的份额将达到 5.75%，2020 年预计可达到 20%。德国是目前生产 生物柴油最成功的国家之一，也是全球最大的生物柴油生产国，主要以纯态生物 柴油（b100）作为车用燃料，其国内享受免征燃油税政策。法国政府对生物柴 油执行零利率政策，并在排放控制严格的地区允许 b30 生物柴油作为公共交通 燃料。意大利是目前欧洲生物柴油使用最广的国家，生物柴油主要用于柴油车辆 和农业机械方面，基本上使用纯态生物柴油作为车用燃料。美国自 20 世纪 90 年 代初就开始将生物柴油投入商业应用， 目前生物柴油已成为该国增长最快的石油 替代燃油，美国主要使用 b20 生物柴油。另外，亚洲一些国家和地区也逐渐开 始重视生物柴油的开发和使用。 如印度通过大规模种植麻风树等非食用油料作物 开发生物柴油；菲律宾利用椰子油生产生物柴油；马来西亚采用棕榈油和废油生 产生物柴油。 （二）国内发展情况现状 我国生物柴油的研究和开发起步比较晚，但发展速度很快。早在 20 世纪 80 年代已有用菜籽油、棉籽油等植物油生产生物柴油的试验研究，各科研机构和高 福建农林大学硕士学位论文 3 校如中国科学院、 中国农业工程研究设计院、 中国科技大学、 辽宁省能源研究所、 河南科学陆军化学所、 湖南省林业科学院和长沙市新技术研究所等单位对生物柴 油做了不同程度的研究。鉴于开发生物柴油的重大意义和发展潜力，我国相关行 业和各地政府对此都给予高度重视，湖北、广东、四川、贵州、福建、海南等许 多地区都把发展生物柴油作为近期科技攻关项目和发展规划。从 2002 年起，生 物柴油在我国发展迅速。2005 年我国生物柴油生产能力约为 8.5 万吨，2006 年 有 40 多家工厂投入生产或者扩建。其中海南正和生物能源公司的生产能力为 3 万吨/年，古衫集团公司生产能力为 4 万吨/年，福建卓越新能源发展公司生产能 力为 3 万吨/年，而且现均已拥有自主知识产权的技术。据统计82006 年我国生 物柴油总产量约为 20 万吨，2007 年生物柴油总生产能力达到上百万吨。同时自 2006 年 1 月 1 日起，可再生能源法在我国开始实行，且 2007 年 5 月我国出 台了第一部生物柴油国家标准柴油机燃料调和生物柴油,这些法规的制定很 大程度上规范了生物柴油市场。但是，与国外相比我国在发展生物柴油方面还有 相当大的差距，长期徘徊在初级研究阶段，未能形成生物柴油的大规模产业化生 产和营销；政府尚未提出一套扶植、优惠和鼓励的政策办法。因此，在面对经济 高速发展造成的能源短缺和环境保护双重压力下， 加快生物柴油的产业化进程就 显得更为迫切了。 1.1.3 生物柴油研究进展生物柴油研究进展 目前对生物柴油的研究主要集中在生物柴油生产工艺和生物柴油生产原料 两个方面。 一、生物柴油生产工艺方面的研究 生物柴油是由动、植物油脂与醇（例如甲醇或者乙醇）经酯交换反应制得的 脂肪酸单烷基酯，最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯。目前，制造生物柴油的主要 方法有：化学合成法、生物酶法、超临界流体法等9。 1、化学合成法 化学合成法就是用动物和植物油脂与甲醇或乙醇等低碳醇在酸性或者碱性 催化剂作用下进行酯交换反应，生产相应的脂肪酸甲酯或乙酯，经过洗涤干燥得 到生物柴油， 其过程可以产生 10%左右的副产品甘油。 化学合成法依其催化剂可 分为酸催化和碱催化两种。其中酸催化反应的催化剂可选用浓硫酸、苯磺酸和磷 酸等，在酯交换过程中不发生皂化，但是反应速率较慢；碱催化的催化剂可选用 氢氧化钾等碱性物质，其反应时间短，工艺较成熟，目前大部分厂家都采用该法 生产生物柴油。但是，化学合成法也存在着如下一些缺点：使用碱催化剂时对原 料要求高，需严格控制油脂中游离脂肪酸和水的含量，残留碱会导致生物柴油中 福建农林大学硕士学位论文 4 有皂生成，容易堵塞管道，生成的甲酯、甘油以及多余的甲醇难以回收，处理成 本高， 反应过程中有废酸或者废碱液排放， 造成环境污染。 为了改进上述的不足， 国内外均开展了一些研究，主要集中在催化剂方面，如有机碱、固体酸、固体碱 等。美国爱德华州立大学的一个研究机构利用纳米技术研制出一种新型催化剂， 该催化剂同时具有酸性催化剂和碱性催化剂的特点，与目前的催化剂相比，具有 效率高、 易回收和环保等特点。 m.di serio 等研究了均相路易斯酸催化剂， 以膈、 锰、铅和锌的羧酸盐作为替代催化剂的催化工艺，减少了传统催化过程中难去除 的硬脂酸盐乳化物产量， 且更容易分离出甘油10。 江苏工业学院林西平教授成功 开发固体碱法制备生物柴油技术，研制了 mg-al2o3复合氧化物固体碱、负载型 cao/mgo 固体碱、改进负载型超强固体碱催化剂及新型负载型固体酸催化剂， 该技术在现实生产中进行过试验应用，与常规催化法相比，无废液排放，属于清 洁工艺，且后处理工序简单，与超临界法相比，操作条件温和、能耗低，更易于 产业化11。 2、生物酶法 生物酶法就是用动植物油脂和低碳醇通过脂肪酶催化进行转酯化反应， 制备 相应的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。生物酶法生产工艺的设备投资少、污染小、能 耗低， 对油脂原料的要求也低12,13。 hass 等14以甘油三酸酯、 乙醇、 脂肪酶 （im20 lipase 或 ce lipase 或 ps-30 lipase）为原料合成生物柴油。清华大学化工系刘德 华课题组开发了酶法生产生物柴油的生产工艺， 该工艺解除了甲醇和甘油对酶反 应的影响，脂肪酶不需处理即可应用于下一批次反应，在反应器上连续运转 10 个多月后，酶活性未见下降，表现出良好的操作稳定性15 17。北京化工大学生 命科学学院谭天伟18课题组经过选育，获得适合脂肪酸甲酯、乙酯、丙酯、及辛 酯的专一性的假丝酵母脂肪酶，解决了传统甲醇对脂肪酶的毒性问题，2003 年 建立产 5t 脂肪酶的生产基地，可以提供催化剂脂肪酶，目前已建立了国内外最 大的酶法生物柴油装置（200t/a 的中试装置）。 3、超临界流体法 超临界流体法就是利用甲醇在超临界状态下具有疏水性， 油脂能够很好地溶 解在超临界甲醇中的特性制取生物柴油。在反应中，超临界流体既可以作为反应 介质，也可直接参加反应。具有反应迅速、转化率高等优点，对原料油脂的适应 性强，即使脂肪酸含量高达 30%以上，对生物柴油的得率也基本上没有影响，水 含量超过 30%的原料也能达到 90%以上的得率。但是由于需要在很高温度和压 力下进行，且能耗大，因此要大规模应用于工业生产，还需要进一步的研究。 demirbas ayhan19的试验是在高压釜中,处于超临界状态的甲醇与榛子油发生反 应,摩尔比为 41:1 ,反应温度 450523 k,压力 4565 mpa ,反应时间 200s ,榛子油 转化率达到 90 %以上。saka s 等20 进行的试验是在锡浴加热的管式反应器中, 福建农林大学硕士学位论文 5 处于超临界状态的甲醇与菜籽油发生酯交换反应,醇油摩尔比为 42:1,反应温度 350400 ,压力 4565mpa ,反应时间 240s ,菜籽油转化率在 95%以上。 此外，还有加氢裂化方法也可生产生物柴油 21。这种基于炼油厂的加氢途 径，将植物油、动物脂肪经预处理后生产柴油工艺，加氢得到合成柴油，而生产 的生物燃料气可进入炼油厂燃料气管网，生物汽油可调入汽油中。加氢裂化过程 中发生几种反应，包括加氢裂化、加氢处理。产率为 75%80%，十六烷值高， 硫含量低，可供炼油厂选用且稳定性极好。 二、生物柴油生产原料方面的研究 目前生产生物柴油的主要问题是成本高， 采用廉价原料及提高转化率从而降 低成本是生物柴油能否实用化的关键。 世界各国纷纷根据本国的实际情况就各种 生物质原料作了一些初步的研究，并取得了一定的进展。 1、利用植物油脂油制取生物柴油 利用菜籽油、花生、大豆及各种油料作物提取的油脂为原料制取生物柴油， 其中菜籽油制取的生物柴油中不饱和脂肪酸甲酯的含量较多22。 但是受到地域的 限制，世界各国纷纷根据本国国情，选择合适的油脂原料制取生物柴油，如美国 的大豆油、欧洲的菜籽油、东南亚各国的棕榈油、巴西的甘蔗油和蓖麻籽油等， 另外各国也利用各种生物技术提高产油作物的油脂含量， 如美国通过基因工程方 法研究高油含量的植物，我国利用基因工程改造油菜籽中的油脂含量，也取得了 一定的进展。油菜是我国种植面积最大的油料作物，总产量位居世界第一。因此 充分利用菜籽油资源作为生物柴油原料对我国发展生物柴油具有重要意义， 中国 农科院油料作物研究所培育成功“中油-0361”油菜新品系，种子含油量高达 54.72%，较目前普通菜油品种提高了 25%以上，产油量可达每亩 98kg。另外， 利用木本油料植物制取生物柴油也是发展植物油脂生产生物柴油的重要途径。 以 我国为例，我国野生木本油料植物含油量在 15%以上的约 1000 种，其中含油量 在 20%以上的约 300 种8,23。其中黄连木、油桐、麻风树等十分丰富，种植面积 超过 400 万公顷，果实产量在 500 万吨以上，且大部分油料植物基本上没有被开 发利用，因此，如果能对这些油料植物进行开发利用，可产生数量可观的生物柴 油。 目前， 我国利用小桐子、 黄连木和光皮树种子制取生物柴油的技术比较成熟， 并已少量生产。 2、利用餐饮废油制取生物柴油 利用废弃油脂生产生物柴油， 不仅能提供有用的燃料， 还能为环保做出贡献， 因此将餐饮业废油脂进行回收生产生物柴油确实是一个相对较好的方案24。 而且 尽管植物油在生产柴油方面具有相当的潜力，但是总体上供应有限，如我国是植 物油脂资源短缺的国家，也是全球最大的食用油进口国，现有油料作物年产油脂 在 1000 万吨左右，尚不满足国内食用油脂消费市场需求，因此，在我国以天然 福建农林大学硕士学位论文 6 植物油作为生物柴油原料存在着成本较高的问题，目前，我国一般生物柴油项目 选择废弃油脂作为原料。而且由于饮食习惯，在我国产生了大量的废弃植物油和 动物油脂。据统计，2005 年我国的食用油脂总消耗量近 2000 万吨，并且消耗量 在继续增长。而在这些油脂中，50%被食用，15%在烹调中损失，另外的 35%都 被排放变成了废油脂，因此我国每年至少产生 300 万吨的废弃油脂。尽管如此， 在利用废弃油脂生产生物柴油的时候也存在着资源总量有限，供应不稳定等情 况，如福建卓越新能源发展公司的生物柴油产量为 2 万吨/年，以地沟油为原料， 需从全国调配，原料价格也从 2006 年初的 1800 元/t 涨到 2006 年 11 月的 2800 元/t。而且餐饮废油脂是含有杂质的高酸值油脂，含有较多的游离脂肪酸、分解 物、聚合物等杂质，在酯交换反应之前必须对其进行预处理，其中包括废油脂物 力精炼和甲醇预酯化25。 3、利用微生物油脂制取生物柴油 某些微生物如酵母、 霉菌和藻类等在适合的条件下能将碳水化合物转化为油 脂贮存在体内，称为微生物油脂。因此利用微生物油脂制取生物柴油引起广大的 关注26,27。 据报道国内已进行了广谱碳源产油酵母菌的筛选28， 其中油脂含量最 高可达菌体干重的 70%以上， 这些产油酵母菌能高效利用和转化各种农林废弃木 质纤维素原材料29。 研究表明， 产油酵母还可利用海洋滩涂耐盐植物大米草的水 解液转化产生微生物生物油脂30。 从含油的藻类中提取油脂制取生物柴油， 清华 大学吴庆余等31通过异样转化细胞工程技术获得了脂类含量高达细胞干重 55% 的异养藻细胞。微生物油脂发酵周期短，不受产地、季节、气候变化等的影响， 并且所利用的原料价格低廉。可见，利用微生物发酵法获得油脂原料制取生物柴 油具有非常大的发展潜力。 1.1.4 生物柴油生产中存在的问题生物柴油生产中存在的问题 原料供应、原料价格和政策的不完善成为制约生物柴油发展的关键，有关专 家认为只有破解这三大难题，我国生物柴油才有望走上产业化、规模化道路32。 而这三大难题中最困难的是原料资源得不到保证， 我国有关专家指出技术不是问 题，主要是原料供应和价格问题。我国虽然有丰富的油料植物资源，且许多都可 以加工为生物柴油， 但是分布分散、 规模有限尚不足以满足生物柴油规模化生产， 而大豆、花生、油菜等草本油料作物也可作为生物柴油的原料，但是由于它们与 我国的主要粮食作物如水稻、 玉米等争地， 扩大种植面积的潜力十分有限。 因此， 寻求新的来源更为广阔的油料便成为解决这一问题的可行方法， 于是我们把目光 投向资源更为广阔的微藻，期待获得新的突破。 福建农林大学硕士学位论文 7 1.2 微藻概述微藻概述 微藻是一类具有叶绿素，营养自养生活，植物体没有真正的根茎叶的分化， 用单细胞的孢子或合子进行生殖的低等单细胞藻类33。它是低等植物中种类繁 多、 分布极其广泛的一个群类。 无论在海洋、 淡水湖泊等水域， 或在潮湿的土壤、 树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方，微藻都能生存。 据有关资料记载，居住在亚太地区的人们认识并利用海藻作为食品已有近 3000 年的历史。单细胞藻类的培养历史，是从十九世纪末，欧洲科学家开始的， 荷兰科学家 beijerinck 首先利用微生物分离技术分离出小球藻纯培养物，从而使 微藻的研究进入一个新的时代。近几十年来，各国为寻求人类新的生活资源，努 力研究单细胞藻类，特别是单细胞绿藻类的培养方法和利用途径。20 世纪 40 年 代，德国人已开始实验商业化培养硅藻，用来生产可做燃料的类脂；50 年代美 国也着手研究生产藻类单细胞蛋白；70 年代日本及中国台湾省也开展生产小球 藻的研究，他们利用添加有机碳源来提高藻类的产量；随着科技的不断进步，人 们发现藻类不仅具有上述应用价值， 而且是十分丰富的高价值化学品及药品的资 源，藻细胞中含有难以从其他生物中得到的某些成分。如多不饱和脂肪酸、虾青 素、各种氨基酸、多种维生素、抗生素，以及多种生物活性物质34。 1.2.1 利用藻类生产生物柴油的特点利用藻类生产生物柴油的特点 生物柴油和化石燃料本质上都来源于光合作用产物。绿色植物进行光合作 用，将水、二氧化碳和其他无机物依靠光能合成各种有机物并释放出氧气，动物 和微生物才能生长繁殖。各种生物的油脂都是从植物合成的有机物转化来的。任 何形式的来自动物、 植物和微生物的脂肪酸都能用作生物柴油的原料35。 在众多 的生物质中，藻类具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产 量高的特点，因此藻类是制备生物油燃料的良好材料36。 藻细胞的主要化学成分是脂类、 纤维素、 木质素和蛋白质等,故可以根据其特 有的化学成分，通过获得细胞中的油脂，再进行酯交换技术将其转变为脂肪酸甲 酯，即生物柴油。 利用藻类生产生物柴油的特点，同时这也是其优势，主要有如下几点： （1）已有的油料作物作为生物柴油原来的成本劣势：绿色植物中草本油料 作物的含油量高，收获的种子存储和加工较简单，但是我国现在还要从国外进口 大量食用油，不能依靠油菜、大豆等来大量生产生物柴油。且其他非食用油料作 物尽管也可以作为生物柴油的生产原料，但也会与粮油棉等作物争地、争水、争 肥。而木本油料植物的含有果实一般一年只收获一次，且存储成本高，容易受到 福建农林大学硕士学位论文 8 季节限制。而藻类培养则不存在着争地、争肥以及季节上的限制。 （2）作为低等植物的藻类大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以 整年生长，其中原核的蓝藻可营自养生活，无需添加 c、n 源。 （3）微藻可利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在 同样条件下，缩短藻的培养时间37。 （4）从海洋和湖泊中分离的藻类，经过驯化，其中一些的光和速率已达到 50g/m2d，其油脂组成与一般油料作物相似，以 c16、c18 系脂肪酸为主。且 高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的 15%-20%左右，而藻类的脂肪酸含量在 氮元素缺乏时可达干重的 80%38,39。 因此若要大规模利用藻类来制取生物柴油，就必须保证有充分的藻类生物 量。目前藻类的来源主要有 2 个途径：一是收集河湾、水库、湖泊、池塘等富营 养化水体中天然生长的大量浮游藻类；二是人工养殖设备，这也是大量获取藻类 的最主要和最有效的方法40。 1.2.2 藻类在制取生物柴油方面的研究进展藻类在制取生物柴油方面的研究进展 藻类作为生物柴油原料的研究始于 20 世纪 60 年代。随着经济的飞速发展， 美国、日本、澳大利亚等西方国家为了减少对进口原油的依赖，大力资助微藻培 养产油项目41,42,43， 同时世界各国大量使用石油导致能源短缺、 环境恶化等问题， 世界各国也开始大力发展利用微藻来生产生物柴油44,45。 目前比较大量的工作围 绕在高油脂微藻的筛选与藻细胞中油脂含量提高的研究，主要分为以下两个方 面：一是利用细胞工程技术制备微藻及生物柴油，二是利用分子生物学和基因工 程技术制备微藻。 在细胞工程方面清华大学缪晓玲等31通过异养转化细胞工程技术获得了高 脂含量的异养小球藻细胞，其脂类化合物含量高达细胞干重的55，是自养藻细 胞(14)的4倍。利用这些高脂肪含量的异养藻快速热解获得高产量的生物油， 产油率为57.9(藻干重)， 是自养藻细胞产油率(16.6)的3.4倍。 异养藻细胞的生 物油热值高达41mj/kg,分别是木材生物油和自养藻生物油的2倍和1.4倍。与木材 或农作物秸秆的生物油和自养藻生物油相比，异养藻细胞的生物油具有高热值、 低密度、低粘度的特点。此外，清华大学还应用细胞培养技术(异养发酵技术)控 制有机与无机c、n 的供给，获得叶绿素消失、细胞变黄的异养小球藻。异养小 球藻细胞中油脂类化合物大量增加， 蛋白质含量下降。 与未经转化的自养藻相比， 异养藻细胞的粗脂肪含量提高了4倍以上。完成1个批次的细胞工程周期为7d左 右。利用独创的淀粉酶解和两步法半无菌培养基技术，以淀粉为原料发酵生产富 营养油脂，完成实验室规模的全部工艺与常规制备技术相比，成本下降58倍， 福建农林大学硕士学位论文 9 油脂质量分数达99%以上46。张薇、吴虹、宗敏华从5种不同来源的小球藻中筛 选到1株油脂产量较高的蛋白核小球藻，在优化培条件下培养7d,藻的生物量和油 脂含量分别由优化前的3.73 g/l和40.15%提高到6.56g/l和59.90%，油脂产量提高 了162%。选出的小球藻能以木糖为碳源产油脂，可望用于以木质纤维素等可再 生生物质资源为原料生产油脂47。陈昱、林锦明、刘广发48采用紫外线照射的 方法对巴氏杜氏藻h-42进行诱变。 通过小剂量乙醚抽提， 索氏法提取和氯仿提取 分析，得到两株总脂含量显著高于原出发株的突变株hl-1和hl-2。研究表明， hl-1和hl-2的总脂含量可达细胞干重的21.1%和2o.5%,分别比对照提高了31.1% 和27.3%。 在分子生物学和基因工程方面早，在2o世纪8o年代初，美国可再生能源国 家实验室在美国能源部的资助下，就开始了利用微藻制备生物柴油的研究。研究 人员从海洋和湖泊中分离了3000多种藻类，从中筛选出300多种生长快、含油高 的硅藻、绿藻和蓝藻等藻种。研究人员通过改变硅藻的基因结构，将其变成“工 程小环藻”亦即“工程微藻”，其细胞中油脂的质量分数增加到6o%以上，户外 生产也可使其质量分数增加到4o%以上， 而一般自然状态下硅藻油脂的质量分数 仅为5%2o%。“工程微藻” 中油脂含量的提高主要由于乙酰辅酶a羧化酶(acc) 基因在微藻细胞中高效表达，在控制油脂积累水平方面起到了重要作用。目前， 研究人员已经筛选出合适的分子载体， 使acc基因在细菌、 酵母和植物中充分表 达，进一步将修饰的acc基因引入微藻中，以获得更高效表达，从而可以得到更 高油脂含量的微藻38,49,50。pereira等51人发现epa转化成dha的两个关键基因 pavelo和igd4。中国科学院植物研究所和中国科学院水生生物研究所的科研人 员借鉴美国的经验和教训，在较短的时间内，通过基因工程开发出高产的油藻品 种52。施定基等53人研究提高了外源基因转化蓝藻的效率56倍，并提高了基 因表达率45倍。 1.2.3 微藻制取生物柴油存在的问题微藻制取生物柴油存在的问题 尽管藻类有很多优点，但是在制备微藻的实际生产中也存在着不利因素。主 要有以下几个方面54：（1） 藻类生长繁殖需要一定的条件， 因此前期投资比较大； （2）在最初培养藻类时需要用到纯净的 co2和有机物（如乙酸盐、葡萄糖等） ， 并且要求用化合物作为矿物质的来源，这些条件会增加投资； （3）有些有机物和 化合物可造成环境污染； （4）藻类在水中生长，进行热转化前，需将其从水中分 离出来，需要特定的设备，进一步增加投入。另一方面，利用微藻制备生物柴油 方面也存在着不少困难， 例如， 如何提高藻种质量， 使藻体含有更高的油脂含量， 并降低藻体细胞中的灰分含量；如何有效收集藻体，降低藻类采收成本；微藻热 福建农林大学硕士学位论文 10 解过程中，如何进行气体、液体和固体的收集及回收再利用等方面，都有待进一 步的研究55。 1.2.4 微藻在处理废水方面的研究现状微藻在处理废水方面的研究现状 微藻多为光和自养型生物，但是光和自养微藻的生物产量较低，异养培养 可以克服光合自养培养的诸多缺陷，是提高微藻产量与产率的有效途径。因此， 近年来对于微藻异养培养的研究受到了众多学者的重视。此外，藻类具有吸收、 消耗水体环境中的氮、磷等营养元素以及吸附重金属元素的功能，因此对水体环 境有一定的净化作用， 可用于对污水的处理， 是一项很好的生物制污措施。 因此， 可利用各种生活污水、工业废水、农业废弃物作培养基来获取大量的藻类原料， 一方面可以降低养殖成本， 另一方面又治理了水环境污染。 后勇等56学者就提出 利用污水处理池来养殖工程海藻，既可以大规模净化富含营养的污水，又可以提 高工程微藻的产量，并提高从工程微藻中提炼生物柴油的比例。 利用微藻技术处理污水始于 20 世纪 70 年代初期，该技术从污水中去除有 机废物和 n、 p 等营养。 藻类是光和无机型营养生物， 能从光和无机碳获得能量， 并释放足够的氧分解营养物。 藻类大量繁殖所吸收的营养正是污水处理系统中应 予去除的，利用微藻技术处理污水，不需要任何化学物品，在特定受控条件下， 藻类对许多营养物发生作用，从而达到去除的目的，这是任何物理和化学技术所 不能及的。 最近几年，国内外研究利用藻类处理废水的人越来越多。吕福荣等人57研 究了小球藻在自养条件下对添加在自来水中氮、磷的吸收情况，发现小球藻吸收 氮、磷 2d 后，对其利用率可分别达到 75%和 62%。ledi a等人58证实了摇瓶 培养钝顶螺旋藻具有降低废水中硝酸盐和磷酸盐的能力， 同时测定了一些动力学 参数， 结果表明了钝顶螺旋藻在此方面的潜在应用价值。 胡月薇等人59综述了国 内外利用小球藻处理废水的最新研究进展， 阐述了小球藻吸收和利用废水中营养 成分、超负荷吸收和富集重金属、降解有毒有机化合物的性能。孔进等人60进行 了鞘丝藻和颤藻对污水净化能力的实验研究， 发现其能利用污水处理厂的氮和磷 来合成细胞物质，3d 时间对氨氮的降解率为 81.4%，磷酸盐的去除率达到 94%。 另外国外学者利用活性藻技术处理城市污水、工业废水和合成污水已获得 许多有参考价值的资料，我国在这方面起步较晚，九五期间才开展相关研究 。 活性藻通过生物絮凝作用使废水中的营养和有机颗粒物明显减少， 其持续去除 n 和 p 的关键是藻类光能活性。当光暗比为 3.3:2.4min 时，处理效果最佳。与此光 暗比相应的其他可行性运转参数是:停留时间 10h， mlss10001400 mg/l， 光强 约 400lux，在这些条件下，bod、cod、n 和 p 的去除率分别达 97%，87%， 福建农林大学硕士学位论文 11 92%和 74%61 。 maiti 等62将活性藻技术与氧化沟技术结合处理合成污水， 当停 留时间 6 至 23d 时，氧化沟活性藻对 n 和 p 的去除率为 67-96%，cod 去除率 96%。 当水的停留时间从 6h 增加到 26h， cod 负荷从 0.90 kg/l 减少到 0.32kg/l。 nh-n 和磷酸盐的去除率分别从 32%和 30%同时增加到 53%。试验期间，ktn 的去除率高达 52%。不同水力负荷条件下活性藻技术对 p 的去除效果随水力停 留时间的不同而各异，当停留时间分别为 4h 和 12h，p 的去除率分别为 70%和 95%，沉降作用是 p 去除的主要机制。况琪军的研究结果是63：在 26左右条 件下，停留时间 24h，活性藻系统对人工合成污水的处理效果是：n、p、codcr 和 bod 的平均去除率分别为 77.6%，33.2%，9o.9%和 95.8%。当进水负荷加大 一倍、停留时间相应缩短、光强减弱、温度降低时，对 p、bod 的处理效果受 到明显影响，对 codcr 的去除率影响不大。 1.3 本论文研究的目的和意义本论文研究的目的和意义 随着化石能源储量的日益减少，以及化石能源的燃烧对空气造成的污染，人 们开始找寻新的能源，其中最为人们关注的就是生物柴油。然而原料供应、原料 价格和政策的不完善成为制约生物柴油发展的关键， 尤其是原料供应的成本问题 成为发展生物柴油的瓶颈。在生产生物柴油的众多原料中，藻类因其具有生物量 大、生长周期短、易培养以及含有较高脂类物质等优点，成为制备生物柴油的理 想材料，具有广阔的开发利用前景。但是在将藻类应用于燃料生产的进程中，还 有许多问题需要加以解决， 尤其是如何更好地培养和采集藻类以降低藻类的采集 成本和生产成本。考虑到藻类能够吸收污水中的氮、磷等营养物质，且国内外对 这方面的研究也比较成熟， 而培养微藻制作生物柴油也逐渐成为近几年生物柴油 研究方面的热点，但是将二者结合在一起的研究报道却鲜有发现。利用废水来培 养富油微藻，一方面既降低了微藻的生产成本，另一方面又治理了水环境污染。 本课题立足于高效富油藻种的筛选并将藻类培养与污水处理相结合， 利用富 油微藻降解污水中的 n、p 等营养物质，使其转化为藻类自身的成分，促进藻类 生长，同时通过控制培养条件，提高藻细胞中的含油率，以期待获得高效富油藻 株，为生产生物柴油提供廉价的原料，以实现生物柴油与污水处理的循环化资源 化利用。 1.4 本论文的研究内容本论文的研究内容 （1）从富营养化天然水体中采集、分离、筛选出含油率较高的优良藻种。 （2）对筛选出的优良藻种进行生理生化研究，包括其最适合培养基的选择和在 此基础上藻的生长曲线的研究，以及不同的培养条件对微藻生长情况影响的研 福建农林大学硕士学位论文 12 究：包括不同的碳源及其浓度对微藻生长情况的影响；不同氮源及其浓度对微藻 生长情况的影响；p 源的不同浓度对微藻生长情况的影响以及不同初始 ph 值对 微藻生长情况的影响。在上述基础上，利用正交试验得出的最佳培养条件。 （3）对筛选出来的藻种进行富油方面的研究，包括不同的碳源及其浓度对微藻 细胞内含油率的影响；不同氮源及其浓度对藻细胞中含油率的影响；p 源的不同 浓度对微藻细胞内含油率的影响以及不同初始 ph 值对微藻细胞内含油率的影 响。在上述基础上，利用正交试验选出藻细胞内含油量最适合的培养条件。 （4）利用筛选出的微藻在不同浓度的养猪废水中分别进行培养，考察藻株在废 水中的生长情况，及其对氨氮的降解情况，同时检测不同浓度中微藻细胞内的含 油率，并进一步对藻株进行应用上的研究。 福建农林大学硕士学位论文 13 第二章第二章 富油藻的分离与筛选富油藻的分离与筛选 2.1 试验材料与方法试验材料与方法 2.1.1 藻种采集藻种采集 藻种采自福州左海湖、西湖、白马河、福大人工湖、农大观音湖等富营 养化较为严重的天然水域。 2.1.2 试剂与仪器设备试剂与仪器设备64 所使用的培养基有朱氏10号培养基、bg11培养基、水生6号培养基及 sorokin-krause培养基，主要使用的试剂如表2-12-4所示；所使用的主要仪器设 备如表2-5所示。 表2-1 朱氏10号培养基 工作液 g/l ca(no3)2 0.040 k2hpo4 0.010 mgso47h2o 0.025 na2co3 0.020 na2sio3 0.025 柠檬酸铁 0.003 柠檬酸 0.003 *a5溶液 1.0ml 蒸馏水 加到 1000ml 注： a5 溶液由 h3bo4 2.86g， mncl2 4h2o 1.87g， cuso4 5h2o 0.08g， na2moo4 0.021g， znso4 7h2o 0.22g， 蒸馏水 1000ml，浓硫酸 1 滴配置而成。 表 2-2 bg11 培养基 工作液 g/l nano3 1.500 k2hpo4 0.039 mgso47h2o 0.075 cacl2h2o 0.027 na2co3 0.020 na2so49h2o 0.058 柠檬酸铁 0.006 edta 0.001 allen 微量元素 1.0ml 蒸馏水 1l ph 7.8 福建农林大学硕士学位论文 14 注： allen 微量元素由 h3bo3 2.86g,mncl2 4h2o 1.81g,znso4 7h2o 0.222g, na2moo4 2h2o 0.391g,cuso45h2o 0.079g，cocl26h2o 0.040g 配置而成。 表 2-3 水生 6 号培养基 工作液 g/l 尿素 0.133 h3po4 0.033ml mgso47h2o 0.100 nahco3 0.100 kcl 0.033 feso4（1%水溶液） 0.200ml cacl2 0.030 水土壤浸出液 0.500ml 蒸馏水 1l 注：土壤浸出液由一份菜园土加二份水浸泡，取其浸出液 表 2-4 sorokin-krause 培养基 工作液 g/l kno3 1.250 mgso47h2o