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(材料学专业论文)大豆分离蛋白降解接枝改性及应用研究.pdf.pdf 免费下载
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摘要 摘要 大豆分离蛋白的改性方法主要有物理法、化学法、酶法、接枝改性、生物基 因工程法等。本文主要探讨的是大豆分离蛋白的接枝改性和酶改性,通过酶降解 的大豆分离蛋白与2 丙烯酰胺基- 2 甲基丙磺酸( 舢旧s ) 的接枝共聚反应进行改 性,对降解大豆分离蛋白及其接枝产物的溶液性质进行了研究,探索了降解大豆 分离蛋白和其接枝物的成膜性能。 本文首先利用各种蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解,对酸性蛋白酶水解产物 的z e t a 电位、溶解性和粘度等溶液性质进行了研究,结果表明碱性蛋白水解酶 的水解能力更好,大豆分离蛋白经酸性酶水解后。蛋白表面所带负电荷增加,在 水溶液中溶解性明显增大,溶液粘度下降。 用2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸接枝改性酸性酶降解的大豆分离蛋白。选择 了8 m 的尿素溶液和疏基乙醇作为变性剂,使降解大豆分离蛋白分子充分舒展, 采用过硫酸铵作为引发剂,对降解大豆分离蛋白( h s p i ) 进行了接枝2 - 丙烯酰 胺基2 甲基丙磺酸的共聚反应。通过傅立叶转换红外光谱( 兀1 r ) 对接技产物 进行表征,证明接枝成功;研究了水解度、引发剂用量、单体用量、反应时间对 接枝率及接枝效率的影响。确定了比较好的反应条件为:h s p i 水解度为1 4 4 5 , 引发剂浓度0 0 5 m o l l ,单体用量2 0 9 ,反应时间1 0 h 。 不同水解度的大豆分离蛋白与羟乙基纤维素或聚乙烯醇共混,以去离子水配 制成成膜液,在成膜液中加入甘油做增塑剂,调节p h 值,用流延法成功地制各 了可食性大豆分离蛋白膜。探讨了纤维素或聚乙烯醇的含量对可食性膜性能的影 响。随纤维素含量的增加,抗拉强度和断裂伸长率都增强,溶解度上升;随聚乙 烯醇含量增加,抗拉强度和断裂伸长率是先上升,然后又都有所下降,溶解度随 之升高。 用2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸接枝改性未降解的大豆分离蛋白,用f t i r 和 1 3 c - n m r 证明了接枝反应的完成。将接枝产物制膜发现,随着接枝率的增加, 膜的厚度变大,拉伸强度增加,断裂伸长率降低,在水中和尿素溶液中的溶解度 也都相应变大。 采用新方法对大豆分离蛋白进行接枝改性,首先制备氨基封端的聚2 一丙烯酰 胺基2 甲基丙磺酸( n h 2 - p a m p s ) ,然后利用酯化缩合剂将这种大分子接枝到大 豆分离蛋白上,通过傅立叶转换红外光谱( f t i r ) 和核磁共振( 1 3 c - n m r ) 对 接枝产物进行表征,证明接枝成功。 关键词:大豆分离蛋白水解接枝改性溶液性能蛋白膜机械性能 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em o d i f i c a t i o nm e t h o do fs o yp r o t e i n si s o l a t ei n c l u d e sp h y s i c s ,c h e m i s t r y , p r o t c o l y t i ce n z y m e ,g r a f t c o p o l y m e r i z a t i o na n db i o l o g i c a lg e n ee n g i n e e r i n g i nt h i s p a p e r , b o t ht b eg r a f tc o p o l y m e r i z a f i o na n dp r o t e o l y t i c 曲z y l n ew e l eu s e dt om o d i f y s o yp r o t e i n si s o l a t e ( s p d t h eg r a f tc o p o l y m e f f z a t i o no fh y d r o l y t i cs o y b e a np r o t e i n i s o l a t e ( h s p dw 池2 - a c r y l a n m i d o 2 - m e t h y lp r o p a n es u l f o n i ca c i d ( k m p s ) w a s s t u d i e d , a n dt h es o l u t i o nb e h a v i o r o fh s p ia n dt h e i r g r a f t e dc o p o l y m e r s ( h s p i 唁- p a m p s ) w e r ea sa l s os t u d i e d f u r t h e r , t h ea p p l i c a t i o no ft h eh y d r o l y t i cs o y p r o t e i ni s o l a t eg r a f t e dc o p o l y m c r si nt h ef i e l do f s p ie d i b l ef i l m sw a ss t u d i e d v a r i o u sp r o t e o l y t i c 既1 z 邺b eu s e dt oh y d r o l y s i si s o l a t e ds o yp r o t e i n s ( s p i ) t h es o l u t i o np r o p e r t i e so fh y d r o l y t i cs o yp r o t e i n si s o l a t e ( h s p i ) w i t ht h e a c i d p r o t e o l y t i ce n z y m eb es t u d i e d t h er e s u l t sw e r e :t h ee f f e c to fb a s i cp r o t e o l y t i c e n z y l n ei sb e s t t h eh s p lw a sd i s s o l v e di nt h ew a t e rb e t t e rt h a ns p iw a s t h eh s p i i o n i z a t i o nd e g r e ew a st h eh i g h e rt h a ns p i b e s i d e s ,t h ev i s c o s i t yo fh s p lw a st h e l o w e r t h a ns p i i nt h e f a f ic o p o l y m e r i z a t i o n o fh s p i 、 ,i t l l a m p s ,t h em n m o n i t t m p e r s u l p h a t e ( a p s ) w a s u s e da s $ 1 1 i n i t i a t o r , a n dt h e 8 m o l lu r e aa n d f l - m e r c a p t o e t h a n o l ( ) w f t eu s e da sp r o t e i nu n f o l d i n ga g e n t s t h ef t i rs p e c t r ao f h s p ia n dt h e i rg r a f t e dc o p o l y m e r s ( h s p i - g - p a m p s ) i n d i c a t e dt h a tt h ea m p sh a d b e e ng r a f t e do nt h eh s p i t h ee f f e c t so fd e g r e eo fh y d r o l y s i s ,a p sc o n c e n t r a t i o n , a m p su s a g ea n dr e a c t i o nt i m eo ng r a f tc o p o l y m e r i z a t i o nw e r es t u d i e d b y d e t e r m i n i n gt h eg r a f t i n gp a r a m e t e r ss u c ha s 触p e r c e n t a g e ( g p 呦a n dg r a f t i n g e f f i c i e n c y ( g e ) t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w i n g : 【d h 】= 1 4 4 5 ,l a p s 】= o 0 5 m o l l “a m p s 】。2 0 9a n dr e a c t i o nt i m ei sl o b t h ee d i b l ef i l m sw 哪p r e p a r e df r o mt h ea q u e o u ss o l u t i o no fh y d r o l y t i cs o y p r o t e i ni s o l a t ea n dh y d r o x ye t h y lc e l l u l o s eo rp o l y v i n y la l c o h 0 1 w i mv a r i o u sh y d r o x y e t h y lc e l l u l o s ea n dp o l y v i n y la l c o h o lc o n t e n t s w i t ht h ei n c r e a s i n go fc a r b o x y e t h y l c e l l u l o s ec o n t e n t s ,t e n s i l es t r e n g t h ( t s ) a n de l o n g a t i o n s ( e ) o ft h ee d i b l ef i l m s i n c r e a s e d , d i s s o l u b i l i t yo ft h ef i l m si n c r e a s e dt o o 眦t h ei n c r e a s i n go fp o l y v i n y l a l c o h o lc o n t e n t s ,t sa n de o ft h ee d i b l ef i l m si n c r e a s da n dt h e nd e c r e a s e dl i t t l e , d i s s o l u b i l i t yo f t h ef i l m si n c r e a s e d s p i - g - p a m p sc o p o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db yi ra n d ”c - n m r s p i - g - p a m p s f i l m sw e f ep r e p a r e df r o mt h ea q u e o u ss o l u t i o no fs p i - g - p a m p s t e n s i l es t r e n g t ht s e t 1 1 i c k n e s sa n dt h ed i s s o l u b i l i t yi nw a t e ra n du r e as o l u t i o no ft h e s ef i l m sa r e d e t e r m i n e d t h er e s u l t si n d i c a t e d 也et h i c k n e s s t sa n ds o l u b i l i t yi n c r e a s e dw i t ht h e a b s t l c t i n c r e a s i n go fg r a f tp e r c e n t a g eo fe o p o l y m e r s e d e c r e a s i n gw i t ht h ei n c r e a s i n go f g r a f tp e r c e n t a g eo f c o p o l y m e r s an c wg r a f tm o d i f i c a t i o nm e t h o dw a su s e dt om o l l ys o y p r o t e i n si s o l a t e f i r s t , a m i n o - t e r m i n a t e dp a m p sw a s p r e p a r e db y r a d i c a l p o l y m e r i z a t i o n t h e s p i - g - p a m p se o p o l y m e r sw e r ep r e p a r e db yac o u p l i n gr e a l :t i o nb c t w e e ns p ia n d n h 2 一p a m p su s i n ge d ca sc o n d e n s i n ga g e n ti nt h ec u s h i o n i n gs o l u t i o n t h ef t i r s p e c t r aa n d1 3 c - n m rs p e c t r ao fs p ia n dt h e i rg r a f t e dc o p o l y m e r si n d i c a t e dt h a tt h e p a m p sh a db e e ng r a t t e do nt h es p i k e yw o r d s :s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ;c o p o l y m e r i z a t i o n ;h y d r o l y s i s ;s o l u t i o n p r o p e r t i e s ;f i l m ;m e c h a n i c a lp r o p e r t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 签名: 日期:年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定:江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名:导师签名: 日期:年月日 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 大豆分离蛋白是指除去大豆中的油脂、可溶性及不可溶性碳水化合物后的大 豆蛋白质。这是高度精制的蛋白质,其蛋白质含量一般在9 0 以上,具有较好的 功能性质。因此,大豆分离蛋白是具有较高实用价值的功能添加剂。工业上的制 备方法是采用等电沉淀法和超滤法【l 】。 近年来随着现代有机和高分子化工的主要原料石油和煤的日趋枯竭,以及由 此而引起的严重环境污染,导致人们将目光转向淀粉、纤维素、壳聚糖及大豆蛋 白等取之不尽、用之不竭、可生物降解、对环境友好的天然可再生资源【2 卯。大 豆蛋白是富含氨基酸的一类天然蛋白质高分子,它是一种可生物降解的有机材 料。在自然环境中可以被微生物或细菌降解,而且大豆资源极其丰富且再生速度 快,因此,以大豆蛋白制备的生物降解高分子材料将有可能成为新型高分子材料。 但是,纯大豆蛋白的力学性能难以满足作为材料的需要,因此需用物理、化学, 生物等方法对其进行改性,如用共混改性方法 6 - s 制备大豆蛋白塑料,加入增塑 剂用交联方法【9 。2 1 制备大豆蛋白膜。近来,李官奇等【1 3 1 用大豆分离蛋白与丙烯酰 胺合成了一种大豆蛋白纤维,具有优异的性能,这说明对大豆蛋白进行接枝改性 可以极大地提高大豆蛋白的性能。 1 2 大豆蛋白质的氨基酸组成 组成大豆蛋白质的氨基酸有1 8 种之多,如表1 1 所示,大豆不同部位的蛋 白质及同一部位或不同部位的不同种蛋白质的氨基酸组成比例均有差异。不过, 无论哪一部分或哪一种蛋白质,均含有人体自身不能合成的、必须从食物中摄取 的8 种必需氢基酸,且比例比较合理。只是赖氨酸相对稍高,而蛋氨酸、半胱氨 酸含量略低。 此外还应该指出,不同地区、不同品种的大豆,其蛋白质的氨基酸组成也会 有差异。就是同一地区、同一品种的大豆,由于生育期长短( 出苗到开花、鼓粒 及成熟日数) 不同,栽培环境( 出苗到开花、鼓粒及成熟的季温、总日照时数和 总降雨量) 的不同,其蛋白质的氨基酸组成也不同。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、色氨酸、胱氨酸( 属a 组) 的含量与生育期及栽培环境成正相关性; 而天门冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸( 属b 组) 与生育期及栽 培环境成负相关性;异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、胱氨酸、丝氨酸、苏 江南大学硕士学位论文 氨酸( 属c 组) 与生育期及栽培环境不存在相关性。 表l 1 大豆蛋白的氨基酸组成( 氨蓦酸的百分数)单位: 全蛋子叶中蛋白质 胚轴中蛋白 种皮 白质质中蛋 不溶 酸沉淀蛋白质乳清 全胚酸沉白质 性蛋全酸沉7 s 蛋1 1 s 蛋白 轴蛋淀蛋 白质 蛋白质白质 蛋白 质白质白质 质 精氨酸 组氨酸 赖氨酸 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨 酸 胱氨酸 蛋氨酸 丝氨酸 苏氨酸 亮氨酸 异亮氨 酸 缬氨酸 谷氨酸 天门冬 氨酸 甘氨酸 丙氨酸 脯氨酸 羟基脯 氨酸 氨 8 3 2 2 6 0 7 4 5 3 4 8 3 8 8 6 3 8 2 6 5 7 8 0 3 7 8 4 2 2 4 3 8 2 5 4 7 1 3 4 6 6 3 2 l 1 5 86 7 l1 0 00 2 6 1 2 2 1 8 21 2 4 1 6 6 1 5 61 6 31 3 3o 2 51 5 11 9 21 7 21 7 90 8 2 5 5 75 9 75 7 76 6 76 1 77 6 24 9 04 5 07 0 2 4 3 14 6 73 7 62 8 14 1 56 1 84 0 03 8 23 6 6 7 7 28 9 l7 9 l1 0 2 58 。4 07 7 46 ,6 27 2 25 9 4 5 1 0 6 0 25 0 36 4 0 5 5 3 5 0 64 1 14 5 33 8 0 5 3 86 3 75 1 85 0 85 8 5 6 1 94 8 25 2 84 5 5 2 1 0 01 7 7 62 3 4 62 0 5 02 5 1 l 1 5 6 4 1 3 7 8 1 4 1 28 6 6 1 2 0 11 2 3 91 2 5 71 4 1 31 3 7 21 4 0 89 7 49 8 41 0 0 5 4 5 2 5 2 14 5 62 8 54 9 65 7 44 2 54 9 3 ii 0 5 4 5 15 7 3 4 4 83 7 04 2 76 1 64 6 94 4 73 9 8 6 2 85 3 5 6 5 54 5 36 2 16 6 64 2 34 3 85 7 6 00一一一一微 6 2 07 5 7 2 0 52 6 l 糖一一 2 2 01 7 l1 6 1 1 5 3 1 4 01 2 0i 5 5 2 7 84 9 40 8 8 4 2 0 一一一 注:不溶性蛋白质、7 s 球蛋白,l l s 球蛋白的含量因大豆种类变化很大 2 甜筋硒卵勰拍 6 3 8 4 1 4 5 3 7 3 6 3 7 5 9 l 3 l 8 2 6 4 l 6舵配叭们砣的 8 1 7 3 o 7铭记甜叭舛 9 2 5 4 1 5约h 如一m 7 2 6 3 5 2 5 6 o 8 1 4 5 8 9 2 0 & 毛丘生l i 第一章绪论 1 3 大豆蛋白质的分子结构 丹麦生物化学家k a il i n d e r s t d p m 首先将蛋白质结构划分为一级、二级和三级 结构,以后英国化学家b e m a l 又使用四级结构来描述复杂多肽链蛋白质分子的 亚基结构。随着大量天然蛋白质的结构测定及以此为基础的综合分析,在二级结 构和三级结构之间又发现了结构模型( 超二级结构) 和结构域,从而揭示了蛋白 质结构的丰富层次体系( s t r u c t u r eh i r a r c h y ) 1 1 。 蛋白质的重要结构特征是具有层次性【1 4 1 。 蛋白质的一级结构通常是指蛋白质肽链的氨基酸残基的排列顺序,也称为残 基或氨基酸的序列。蛋白质的一级结构包括肽链的数目、端基的组成、氨基酸的 排列顺序和二硫键的位置等。维系蛋白质一级结构的化学键只有共价键,即肽键。 蛋白质的二级结构是指肽链中局部肽段的构象,它们是完整肽链构象( - - 级 结构) 的结构单元,是蛋白质复杂的空间构象的基础,故它们也可称为构象单元。 至今发现的大豆蛋白质多肽链主链骨架构象主要有两种,即a 一螺旋结构和b 一 螺旋结构,蛋白质二级结构的决定因子是肽键间氢键,即附于一肽键n 上的h 与另一肽键之羧基的0 之间的作用,氢键吸引力虽低,但数量很多,故总吸引 力还是很大的,易为热、酸、碱等所影响。 在蛋白质结构中,常常发现两个或几个二级结构单元被多肽连接起来,进一 步组合成有特殊的几何排列的局域空间结构,这些局域空间结构称为超二级结构 ( s u p e r s e - c o n d a r ys t r u c t u r e ) 或简称m o t i f 。 三级结构可以定义为,蛋白质的肽链中所有肽键和残基( 包括侧链) 间的相对 位置,这些相对的位置可以用肽键的两面角和一些原子( 或基n ) n 的距离定量地 加以描述。多肽链的侧链,即氨基酸残基r 基团,相互作用所形成的弱键是稳 定蛋白质三级结构的主要因素。根据r 基团的性质可将氨基酸分为两类:( 1 ) 极性r 基团的氨基酸:丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨 酸、酪氨酸、羟脯氨酸。( 2 ) 非极性r 基团的氨基酸:甘氨酸、丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨 酸。在大豆蛋白质的三级结构中,非极性基团转向分子内部,极性基团或者转向 分子内部或者转向分子表面。稳定蛋白质三级结构的键包括盐键、氢键、疏水键、 范德华力及二硫键。大豆蛋白质在大豆体内以凝胶状态存在,与蛋白质分子接触 的介质是水。非极性基团转向分子内部的,相互作用形成氢键和盐键,极性基团 转向分子表面的,可与极性水分子相互作用。 绝大多数的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构 后,蛋白质内部变得更为紧密,内部的空间约有7 5 被原子所充满。这样的密集 程度远远超过在液体中的小分子,可以和一些晶体的情况相比。 江南大学硕士学位论文 蛋白质的四级结构可以定义为一些特定三级结构的肽链通过非共价键而形 成的大分子体系时的组合方式。蛋白质四级结构中具有三级结构的多肽链单元称 为亚基或亚单位。维系四级结构的力主要是疏水键和范德华力。 1 4 大豆蛋白质的相对分子质量 大豆蛋白质是一系列高分子化合物的总称,按照溶液在离心机中沉降速度来 分,可分为4 个组分,即2 s 、7 s 、i l s 、和1 5 s ( s 为沉降系数,1 s = 1 0 - 1 3 秒= 1s v e d b e r g 单位) 。这每一组分是一些重量接近的分子混合物,如果将每个组分的蛋白质近 一步分离,可以获得蛋白质单体或相类似的蛋白质。大豆蛋白质的分级组成如表 1 2 所示: 表1 2 大豆蛋白组成 t a b l e l 2c o m p o s i t i o no f s o y p r o t e i n s 从表中不难看出,大豆蛋白质的相对分子质量分布非常广,从8 0 0 0 到 6 0 0 0 0 0 ,而且是非均匀分布的。这个相对分子质量分布用凝胶电泳分析法也得到 了证实。 大豆蛋白质的分级组分中,7 s 和1 l s 是主要的,约占大豆蛋白质总量的7 0 , 约有8 0 的蛋白质相对分子质量在1 0 万以上。 1 , s 大豆蛋白质的功能性 功能性指的是配制、加工、储藏过程中对食品能产生影响的那些物理化学性 质。因为大豆蛋白质具有良好的功能性质,因而有利于大豆蛋白质食品的质量, 也有利于其加工工艺【旧。 4 第一章绪论 大豆蛋白由于具有丰富的氨基酸,在食品中有广泛的用处。在食品中的功能 性主要有乳化性、吸油性、水合性、凝胶性( 或胶凝性) 、溶解性、起泡性、粘 性、结团性、组织性、结膜性、调色性等十一大功能( 见表1 3 ) 。 表1 3 大豆蛋白的功能性与应用 t a b l e l 3f u n c t i o n a l i t i e sa n da p p l i c a t i o n s o f s o y b e a n p r o t e i n 注:表中f 、c 、i 、h 、w 分别代表大豆粉、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、大豆水解 蛋白及大豆乳清。 1 6 大豆蛋白质的改性方法 大豆蛋白的改性就是通过改变蛋白质的一个或几个理化性能,达到加强或改 善蛋白质的功能性的目的。同时抑制酶的活性或除去有害物质,达到除去苦味和 提高营养利用率的目的。其实质就是改变大豆蛋白的分子结构,进而改变其理比 性质,达到功能性质改变的结果。大豆蛋白的改性方法有物理改性、化学改性、 酶改性和生物工程改性。 1 6 1 大豆蛋白的物理改性 改变大豆蛋白性质的物理方法有机械处理、挤压、冷冻等,大豆蛋白物理改 性具有费用低、无毒无副作用、作用时间短以及对产品营养性质影响较小等优点。 最常用的是加热改性法。适当的热烘处理能提高大豆蛋白的表面活性和乳化 性,这是由于大豆蛋白部分被展开,而导致氨基酸的暴露,使其能在水油界面很 好的定位,因此,热处理有利于凝胶作用。同时,加工过程中的热处理能钝化大 江南大学硕士学位论文 豆中对人体不利的酶或蛋白。在热处理中发现,8 5 热烘1 0 m i n ,大豆分离蛋白 凝胶性和粘度有所提高,充n 2 水浴加热也能明显提高凝胶性和粘度。其他方法 有热塑挤压、纤维纺丝,也是蛋白质质构化的常用方法;添加黄原胶等能提高大 豆分离蛋白的气泡性和泡沫稳定性;海藻酸钠能增强大豆分离蛋白的粘度。另外, 国内也有利用高频增溶技术增加大豆蛋白的溶解性及钝化酶的报道,还有低剂量 辐射、超滤高频电场处理等新技术应用的报道。 1 6 2 大豆蛋白的化学改性 常用酸、碱、盐部分水解改进大豆蛋白的功能性,如溶解性、起泡性及气泡 稳定性等。但是由于试剂残留和对设备腐蚀严重等问题,已经很少采用。更多的 通过化学手段在大豆蛋白中引入各种功能基团,而使之成为具有特殊加工性的产 品,其实质就是通过改善蛋白质的结构、静电荷数和疏水基及除去抗营养因子, 以此改善大豆蛋白的性质。如卢寅泉报道【1 6 1 ,利用三聚磷酸钠( s t p ) 改性大豆蛋 白,得出3 浓度大豆分离蛋白磷酸化程度最佳的工艺条件为p h 值8 、s t p 浓度 3 、3 5 c 保温3 5 h 、此时磷酸化程度为5 7 ,大豆蛋白的水溶性、乳化性、起 泡性都有很大改善,等电点p h 值由4 5 偏移到3 9 。另外在大豆蛋白的分子上引 入有机大分子糖类物质使之糖基化,生成新的糖蛋白,这不仅提高了其溶解性、 热稳定性、乳化性,还由于发生了美拉德反应,而提高了产品的抗氧化能力,具 有了长时间放置不变质的优点。其他如引入棕榈酸分子、乙酰化、羟甲基化等化 学手段,均能改善大豆蛋白的溶解性、凝胶性、乳化性、吸油性等,其相应的不 同功能性和专一性均较强1 1 ”。 1 6 3 大豆蛋白的酶法改性 大豆蛋白的酶法改性就是通过酶部分水解蛋白质,增加其分子内或分子间交 联或连接特殊功能基因,改变蛋白质的功能性质。根据酶的来源不同,可分为动 物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶等。动物蛋白酶常用的有胰蛋白酶、胰凝 胶蛋白酶、胃蛋白酶。胰酶( 包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶) 限制性水解大豆蛋 白,可提高大豆蛋白的疏水性、乳化性、溶解性。植物蛋白酶报道的最多的是木 瓜蛋白酶,水解度为3 时可得溶解度接近1 0 0 的酶改性蛋白质,水解度为1 7 时,乳化性最佳,水解度为1 3 时,起泡性最好。目前微生物蛋白酶有a l c a l a s e , 枯草秆菌1 3 8 9 ,黑曲酶3 3 5 0 等分离产生的酶。环状芽胞杆菌分离出来的肽谷氨 酰胺酶,能快速水解大豆蛋白中谷氨酰胺基中的酰胺基,而整个蛋白质不受影响, 蛋白质的溶解性、乳化性和起泡性也大有改进,但气泡稳定性未见改变。蛋白酶 a l c a l a s e 作用于大豆分离蛋白,水解度小于6 时,产物乳化性随其溶解性增加 而改善。值得一提的是,目前对微生物链轮丝菌属中某些菌株产生的转谷氨酰胺 6 第一章绪论 酶已被广泛的研究应用。唐传核等人研究了转谷氨酰胺酶催化大豆l l s 球蛋白聚 合反应的最适条件:p h 值为7 o _ - 8 0 ,在低于5 0 t 2 范围内,温度越高转谷氨酰 胺酶催化l l s 聚合越快达到平衡。当大豆蛋白经过转谷氨酰胺酶的交联聚合后, 其溶解性、对酸稳定性、乳化性、凝胶性均得到显著提高。 1 6 4 大豆蛋白的生物工程改性 通过基因工程或选育优良野生品系,可改善大豆蛋白的功能性和营养性。目 前普遍存在的疑问是转基因大豆产品是否安全。关于转基因大豆产品安全性的慢 性实验还缺少证据,它需要5 0 、1 0 0 年的结果,但从消化性、急性、毒性等实验 结果看,目前普遍认为大豆蛋白与现代食用的蛋白实质上是等同的。 1 6 5 大豆分离蛋白接枝改性 自由基型接枝共聚( f r e er a d i c a lg r a t t c o p o l y m e r i z a t i o n ) 是目前用于接枝改性的 一种主要途径,其聚合反应过程通常由引发( i n i t i a t i o n ) 、增长( p r o p a g a t i o n ) 、终止 ( _ r c r i n i n a t i o n ) 和链转移( c h a i l lt r a n s f e r ) 四个基元反应构成【1 引,其中的引发反应对于 大豆分离蛋白大分子的接枝共聚改性十分重要。 利用化学引发剂引发大豆分离蛋白接枝,其中包括诱导热分解法和氧化还原 法。常用的化学引发剂有:c e 盐、过氧化物、偶氮化物、氧化还原引发剂、 五价钒盐等。其途径总结为: ( 1 ) 高铈盐和五价钒盐引发法 以c e 4 + 盐引发大豆分离蛋白与乙烯基单体接枝共聚是最常见的方法,其反 应过程与纤维素、淀粉相似。 c e + 盐如【c e ( n h 4 ) 2 ( n 0 3 ) 6 弓1 发纤维素接枝的工作早有报道。一般认为,c d ” 氧化纤维素首先生成具有络合结构的中间体,然后c ,被还原成c e 3 + ,同时, 一个氢原子被氧化,生成纤维素自由基;葡萄糖单位的c2 一c 3 键断裂,于是纤 维素自由基便与单体起接枝反应,自由基也能再被c e 4 + 氧化而消失。相关文献报 道,丙烯腈、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等都可用此方法接枝到纤维素 上。 引发机理如下1 1 8 】: 引发过程:c e + c e u h k c e l l + c e ”+ h c e u + m c e l l c e + m m + c 一+ + i f 增长过程:c e l l m 。十,m 翟c e l l m n l m m + m - m m + 1 终止过程:c e l l m o + c e 4 + c e l l m n + c e 3 + + h + k t 7 江南大学硕士学位论文 m m + c e ”1 7m a + c e ”+ h + c e l l + c e 4 + 一氧化产物+ c e 3 + + 旷 c e i i - - h 代表纤维素反应官能团,m 是单体,k 是平衡常数,l 【i ,k i 。,印, k p l ,h ,l c t 和1 ( 0 是速率常数。 钒盐( v ,+ ) 引发纤维素反应与此类似。 ( 2 ) 过氧化物、偶氮化物等自由基引发剂引发法【1 9 】 利用过氧化苯二甲酰、过硫酸盐等过氧化引发剂和偶氮二异丁腈、偶氮二异 庚腈等偶氮类引发剂进行接枝共聚。这类引发剂多借助于链转移在大豆分离蛋白 大分子上形成自由基,再和单体进行接枝共聚。 氧化还原法是引发大豆分离蛋白与乙烯基类单体接枝共聚的最常见方法。其 引发体系通常由氧化剂和还原剂两种物质组成,但也有由三种物质或兼备氧化和 还原性质的一种物质组成。基于文献关于纤维素接枝共聚的报道,其分类及组成 可归纳为【2 0 】; 陋“搿 氧化还须引发体系 双组分 :呈辜筹三素黄原酸酯 l 三组分h 。o :+ f e ”+ 纤维素黄原酸酯 氧化剂能使大豆分离蛋白分子中的碳原子( 或羟基上) 的氢被夺走而产生自 由基,然后再引发乙烯基单体,成为大豆蛋白的单体自由基,继续与单体进行链 增长聚合,最后产生链终止。 如用f e 2 + i - 1 2 0 2 引发还原体系发生如下反应1 2 1 】: f e 2 + + h o - - o h f e 3 + + o h + o h - f e 3 + + o h f e 2 + + o h - 有大量过氧化氢存在时, h o + h o o h h 2 0 + h 0 0 h o o + h o - - o h h o + h 2 0 + 0 2 产生的h o 由大豆分离蛋白大分子骨架上抽取氢原子,其活性点引发接枝, 其他反应与c 矿盐引发大豆分离蛋白接枝类似。 近年也有其他接枝改性方法报道,如制备官能基团封端的大分子。通过特定 反应接枝到生物蛋白质上嘲。也有报道利用a 1 r p 反应对蛋白质进行接枝改性 的,先将反应活性种接到蛋白上,再将单体与生物蛋白质进行活性聚厶【矧。 8 第一章绪论 1 7 大豆蛋白在材料领域的应用 1 - 7 1 塑料工业 1 9 1 3 年在法国和英国分别发表了由大豆蛋白质制备半塑料材料的专利。然 而,直到1 9 1 9 年s s a t o w 的专利发表时才引起广泛的兴趣。 1 9 3 0 年受大萧条的冲击,汽车巨子亨利福特为了保护他的汽车在乡村市场 上的购买力,寻找方法拓展农产品市场以增加农民的收入,从而使他们有钱能够 买得起他的汽车。在爱迪生研究院,福特和他的团队在r b o y e r 的领导下,开发 了一种添j j l 3 0 大豆粉的酚醛树脂塑料。福特雄心勃勃地将它们用于他的汽车部 件叫。 二战后,石油价格下降,因此通过石油化工技术人工合成的塑料材料控制了 市场。这期间有五十年,对大豆蛋白塑料的工业化应用,无论是应用的还是基础 的研究,很少有报道。但是这些人工合成塑料在给人们带来许多便利之余,很难 自然降解,因而其在环境中的日益堆积引起了人们的忧虑。而且石油作为一种不 可再生资源,也日益面临所谓枯竭问题。近年来,出于环境和资源两方面的原因, 人们开始重新研究利用天然高分子成分生产环境友好的生物降解塑料。进入9 0 年代,以大豆蛋白质为原料,研制可完全生物降解的绿色塑料重新活跃起来,而 且,作为提高农产品附加值和提高农民收入的有效途径,更引起了美国、巴西、 阿根廷等农业大国的浓厚兴趣1 2 ”。 1 。7 2 纤维工韭 1 9 3 8 年,日本油脂公司开发了以大豆蛋白为原料的纤维。 1 9 4 5 年左右,美国、日本研究了大豆蛋白纤维,美国商品名为s o y l o n ,吸水 率为1 1 左右。 由于受早期科技水平的限制,上述研制的大豆蛋白纤维因强力低、纤维粗、 物理机械性能差、制备的技术难度大等种种原因而未能实现工业化生产。 我国河南濮阳华康生物化学工程联合集团公司李官奇先生潜心研究了八年, 投资了7 0 0 0 多万元,终于在2 0 0 0 年3 月试纺大豆蛋白改性纤维成功,在国际上首 次成功地进行了工业化生产,被国际纺织界称为全球“第八大人造纤维”,它实现 了世界化纤史上我国原创技术“零”的突破。目前第一条生产线年产能力达1 5 0 0 吨左右。 该纤维主要生产原料是豆粕、羟基和氰基高聚物,其生产原理是将豆粕水浸 分离提纯出蛋白质,将蛋白质改变空间结构并在适当的条件下与羟基、氰基高聚 物共聚接枝,通过湿法纺丝生成大豆蛋白纤维。这时的大豆蛋白纤维中的蛋白质 9 南大学硕士学位论文 并没有与羟基和氰基高聚物完全发生共聚接枝具有一定的水溶性,还需经过一 定的缩醛化处理才能成为性能稳定的纤维闭。该种纤维是一种性能优良的纤维, 它具有优良的透气性,好的保暖性,手感柔软、滑爽。 1 7 3 可食性大豆蚤自膜 可食性大豆蛋白膜是指由大豆蛋白形成的膜,它可以通过浸渍、涂布、喷洒 而覆盖在食品表面( 或内部) 形成一层有功能特性的膜。姜爱莉等1 2 。”研究了不同 的p h 值、溶剂系统、增塑剂和盐类对大豆蛋白膜( i s p f ) 的机械性质( 抗张强度t s 和延伸率e ) 和水蒸气渗透性( 、聊) 的影响。莫文敏圆介绍了大豆分离蛋白 ( s p i ) 膜的特性及各种强化方法:热处理和碱处理,交联作用,多组分复合, 物理处理对s p i 膜的影响,提出了s p i 膜的应用前景。 1 8 本论文研究工作设计 ( 1 ) 研究用蛋白水解酶改性制备降解大豆分离蛋白。对多种酶解效果进行了比 较,通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳和红外表征水解后的大豆分离蛋白。表征酸 性水解酶水解后的大豆分离蛋白的z e t a 电位、溶解性、黏度等溶液性质。 ( 2 ) 研究酸性酶水解后的大豆分离蛋白与2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸进行接枝 共聚反应,制备接枝共聚物。通过单因素实验,确定各种不同反应条件,如水解 度、引发剂浓度、单体浓度、反应时间等对接枝率和接枝效率的影响并对接枝产 物的溶液性能进行研究; ( 3 ) 研究降解后的大豆分离蛋白制备可食膜。研究了不同添加剂( 羟乙基纤维 素、聚乙烯醇) 对膜的性能如膜厚、抗拉强度、断裂伸长率和溶解性的影响。 ( 4 ) 研究2 一丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸接枝大豆分离蛋白( s p i - g - p a m p s ) 的成 膜性。 ( 5 ) 探索研究大豆分离蛋白与2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸( 圳p s ) 接枝改性 的新方法。首先制备氨基封端的聚2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸( n h 2 p a ,s ) , 然后利用酯化缩合剂将这种大分子接枝到大豆分离蛋白球上。利用f t i r 和 h c 小琢皿i 证明接枝反应的发生。 l o 第二章大豆分离蛋白的酶水解 2 1 前言 第二章大豆分离蛋白的酶水解 大豆蛋白是富含氨基酸的一类天然蛋白质高分子,大豆蛋白资源丰富可再 生,具有很好的生物降解性、营养性等优良性能,可以用作环境友好材料。但是 由于大豆蛋白分子庞大、结构复杂,性能受诸多因素的影响,这就影响了大豆蛋 白在诸多场合中的使用。 大豆分离蛋白水解产物具有众多的功用性能。在食品中广泛应用大豆蛋白水 解产物的营养性 2 9 1 ,使用大豆蛋白水解产物制作的健康食品可作为肠道营养剂和 流体食物应用于病人、老年人、婴幼儿。大豆蛋白水解产物的营养性、乳化性、 起泡性及保湿性等优良性能,可以用于化妆品行q b t 3 0 。大豆蛋白的水解产物具 有良好的胶黏性,可以用于制备胶黏利3 1 】。大豆分离蛋白的水解产物具有比原大 豆分离蛋白更好的溶解性,扩大了大豆分离蛋白的用途,也大大提高大豆分离蛋 白的进一步改性能力。 大豆分离蛋白水解方法很多,如酶降解、酸变性、碱变性或是混合水解法。 用碱性内切蛋白酶水解大豆分离蛋白已有不少报道 3 2 3 4 j ,主要是研究了酶水解 条件与蛋白水解度的关系,而对于酶水解的动力学过程的报道甚少。有关酶水解 动力学的研究有可能为蛋白质的酶水解改性提供新的认识和改进的可能性。 为此本实验选用了几种常见的蛋白水解酶对大豆蛋白进行改性。研究了各种 水解酶的水解效果,找到对大豆分离蛋白水解的最佳的酶水解条件;其次利用电 泳图、水解度、溶解度、z e t a 电位和黏度等手段对大豆分离蛋白酶水解过程及其 水解产物的溶液性质进行了表征 2 。2 实验材料与方法 2 2 1 实验材料 大豆分离蛋白( 南通光合生物科技有限公司) ,蛋白质含量大于9 0 ,食用级; 胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白水解酶( 无锡酶制剂厂) ,纯度 大于9 5 : 低分子量标准蛋白质( 上海奔耕生物科技有限公司提供) ; t r i s ( 三羟甲基胺基甲烷,上海生化试剂公司) ; a c t ( 丙烯酰胺,s i g m a 公司分装) ; 江南大学硕士学位论文 b i s ( n , n - 甲叉双丙烯酰胺,p h a r m a c i a 公司) ; t e m e d ( 四甲基乙二胺,m e r c h 公司) ; 过硫酸铵( 爱建德固赛引
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