（环境科学专业论文）具有α葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究.pdf

伐一g l y c o s i d a s ei n h i b i t o r d e r i v e df r o mm a r i n e s p o n g e - - a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m s a b s t r a c t m a r i n es p o n g e a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m sa r et h ei m p o r t a n ts o u r c eo fn a t u r ep r o d u c t s f o r p h a r m a c e u t i c a l s i ti sap o t e n t i a lw a y f o rd e v e l o p i n gn e wd i a b e t e sd r u g ( 0 【。g l y c o s i d a s ei n h i b i t o r ) i nt h i ss t u d y , t h ea 。g l u c o s i d a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t ys c r e e n i n gm o d e li sb u i l t u pt os e a r c hf o r t h ea c t i v ec r u d ee x t r a c tf r o mt h em i c r o o r g a i n i s mm e t a b o l i t es a m p l e sp r e p a r e df r o mm a r i n e s p o n g e si nf r i d a yh a r b o ro fu s t h er e a c t i o ns y s t e mo ft h e0 【- g l u c o s i d a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t y s c r e e n i n g i sp e r f o r m e do na9 6w e l l sp l a t e s t h er e a c t i o nc o n d i t i o n ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o n o f e n z y m e s ，i ss e ta t0 0 0 8 u m l ，p h6 8 ，3 7 。c ，a n dw a v e l e n g t h4 0 5 n m m o r e o v e r , t h es c r e e n i n g m o d e lw a so p t i m i z e dw i t hr e a c t a n tp n p gc o n c e n t r a t i o n10m m o l l ，r e a c t i o nt i m eo f2 5m i na n d t h es o l v e n td m s oc o n t e n to f2 ( 功 u s e da c a r b o s ea sap o s i t i v ec o n t r o l l e ds a m p l e ，212c r u d ee x t r a c t ss a m p l e sf r o mm a r i n e s p o n g ea s s i c i a t e dm i c r o o r g a n i s m sw e r es c r e e n e dw i t ht h ea b o v eo p t i m i z e dm o d e l t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tm e t a b o l i t e so f19s t r a i n sh a dh i g hi n h i b i t i o r ya c t i v i t y ( 5 0 ) a m o n gt h e m ，5 s t r a i n ss h o w e di n h i b i t o r ye f f e c th i g h e rt h a n7 0 a g a i n s t 仅一g l u c o s i d a s ea tc o n c e n t r a t i o n0 4 ，0 6 ， 0 8m e m l t h ei n h i b i t o r ye f f e c t sw a sh i g h e rt h a nt h a to fa c a r b o s e ( 5 8 ) a tc o n c e n t r a t i o n1 6 m e m e a sr e s u l t ，t h es t r a i nh y 9 3 6 ，w i t hh i g hi n h i b i t o r ya c t i v i t y ( 7 9 3 ) a tc o n c e n t r a t i o n0 4 m e m l ，w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u s f i r m u sb yt h em e a n so f16 sr d n as e q u e n c e t h ec u l t i v a t i n gc o n d i t i o no fs t r a i n sw a so p t i m i z e df o rah i g h e rp r o d u c t i o no fa c t i v e c o m p o n e n t s s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t a ld e s i g nw a sp e r f o r m e dt oa n a l y s i st h e i n f l u e n c eo f c u l t i v a t i n gt i m e ，r o t a t i n gs p e e d ，i n o c u l a t i o nv o l u m e t h eo r t h o g o n a lt e s tl 9 ( 3 4 ) t o o kp e p t o n e ， y e a s te x t r a c t ，a n dn a c lc o n c e n t r a t i o n si nt h ec u l t u r em e d i aa sw e l la st h ep h v a l u ei n t oa c c o u n t a f t e rt h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s ，t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s su s i n gs t r a i n so fb a c i l l u s 。f i r m u sw a sc o n d u c t e dt oa c c u m u l a t e2 8gc r u d ee x t r a c t ，w h i c hw a ss e p e r a t e d a n dp u r i f i e d t h r o u g hs i l i c ac o l l u m no ft l c o rh p l c f r 1a n df r 4w e r eo b t a i n e db yu s i n gs i l i c a g e lc o l u m n a n dt h e yh a v eh i g hi n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s t0 【一g l u c o s i d a s e t h ei n h i b i t a r yr a t e so f3 5 5 a n d 19 6 r e s p e c t i v e l y t h e ns u b f r a c t i o n1 1w a si s o l a t e df r o mf t 1s h o w e di n h i b i t a r yr a t eo f8 2 3 8 i i i t h e r e f o r e ，s u b f r a c t i o n1 1w a ss u b je c t e dt og c m sa n a l y s i sa n d11k i n d so fc o m p o u n d sw e r e f o u n d ，i n c l u d i n gc y c l i cd i p e p t i d ea n dp i p e r i d o n ea st h em a j o rc o m p o n e n t s t h et w ok i n d so f s u b s t a n c e sp r o v i d e s p o t e n t i a lc l u e sf o rd e v e l o p i n gn e wc 【g l y c o s i d a s ei n h i b i t o r s a t t e n t i o n s s h o u l db ep a i do nt h es t u d yo ft h e mi nf u r t h e r k e yw o r d s ：m a r i n es p o n g e - a s s o c i a t e dm i c r o o r g a n i s m s ；q g l u c o s i d a s ei n h i b i t o r ；p u r i f i c a t i o n ： a c t i v ec o m p o u n d 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i i 第1 章前言1 1 1 海洋天然产物研究概况1 1 1 1 海绵天然产物研究1 1 1 2 海绵共附生微生物及其天然产物研究2 1 20 【葡萄糖苷酶与糖尿病3 1 30 【葡萄糖苷酶抑制剂4 1 3 1 从天然动植物中提取的0 【葡萄糖苷酶抑制剂4 1 3 2 化学半合成的c 【葡萄糖苷酶抑制剂5 1 3 3 微生物由来的a 葡萄糖苷酶抑制剂5 1 4 典型a 一葡萄糖苷酶抑制剂类药物一6 1 5 新型o c 一葡萄糖苷酶抑制剂及其应用7 1 6 活性先导化合物活性筛选模型8 1 7 选题意义和研究方案8 第2 章0 c 一葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的建立1 0 2 1 材料10 2 1 1 主要仪器1 0 2 t 2 主要试剂一10 2 2 方法10 2 2 1 溶液的配制1 0 2 2 2 筛选模型的建立及验证1 0 2 3 结果与分析11 2 3 1 o 【一葡萄糖苷酶活性测试体系11 2 3 2 筛选模型的建立及验证1 2 2 4 小结与讨论1 5 第3 章具有q 葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物的筛选和鉴定1 6 3 1 材料1 6 3 1 1 菌株1 6 3 1 2 培养基1 6 3 1 3 主要仪器16 3 1 4 主要试剂1 6 3 2 方法1 6 3 2 1 海绵共附生微生物代谢产物的制备1 6 3 2 2o 【葡萄糖苷酶抑制活性菌株的初步筛选1 7 3 2 3 具c c 葡萄糖苷酶抑制活性菌株的复筛1 7 3 2 4 活性菌株的形态及扫描电镜分析1 7 3 。2 5 活性菌株的1 6 sr d n a 测序1 8 3 3 结果与分析2 1 3 3 1 海绵共附生微生物代谢产物的制备2 1 3 3 2 具c 【葡萄糖苷酶抑制活性菌株的初步筛选一2 l 3 3 3 具0 l 。葡萄糖苷酶抑制活性菌株的复筛2 2 3 3 4 菌株h y 9 3 6 的形态及扫描电镜分析2 4 3 3 5 菌株h y 9 3 6 的1 6 sr d n a 测序及分析2 5 3 4 小结与讨论2 6 第4 章菌株b a c i l l u s f i r m u s 的培养条件优化一2 7 4 1 材料2 7 4 1 1 菌株2 7 4 1 2 培养基2 7 4 13 主要仪器一2 7 4 1 4 主要试剂2 7 4 2 方法2 7 4 2 1b 乜c i l l “sf i r m “s 的培养条件优化2 7 4 2 2 利用正交试验优化培养基成分2 8 4 3 结果与分析3 0 4 3 1b a c i l l u st z r m u s 的培养条件优化一3 0 4 3 2 利用正交试验优化培养基成分一3 2 4 4 小结与讨论3 6 第5 章b a c i l l “s f i r m u s 代谢产物中活性组分的分离与纯化3 7 5 1 材料3 7 5 1 1 菌株”3 7 5 1 2 培养基”3 7 5 1 3 主要仪器3 7 5 1 4 主要试剂一3 7 5 2 方法3 7 5 2 1b a c i l l u s i r m “j 规模化发酵及0 【葡萄糖昔酶活性测定3 7 5 2 2 活性物质的柱层析分离3 8 5 2 3 活性组分的g c m s 分析3 9 5 3 结果与分析3 9 5 3 1b a c i l l u sf i r m u s 规模化发酵及c 【葡萄糖苷酶活性测定3 9 5 3 2 硅胶柱分离及o 【葡萄糖苷酶活性测定3 9 5 3 3 活性物质的进一步分离纯化4 2 5 3 4 活性组分的g c m s 分析4 3 5 4 小结与讨论4 7 第6 章结论与展望4 8 6 1 结论4 8 6 2 展望4 8 参考文献51 附 录5 5 附录一阿卡波糖纯样品的h p l c 分析报告5 5 附录二菌株h y 9 3 6 的1 6 sr d n a 测序结果5 6 附录三b a c i l l u s f i r m u s 的培养条件优化5 7 附录四利用正交试验优化培养基成分5 8 附录五组分f t 1 的h p l c 分析报告5 9 附录六组分f r 4 的h p l c 分析报告6 0 附录七组分f r 1 的薄层层析分析6 1 附录八g c m s 分析报告6 2 发表论文情况6 3 致谢6 5 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书6 7 查鑫矗 具有竺萱垄焦笪堕塑叠坚重丝塑塑塑! 圭堕竺垡竺塑垄茎适丝兰塑堕壅 ! _ _ - _ - _ _ _ _ - _ - _ _ - _ ，一 第1 章前言 1 1 海洋天然产物研究概况 海洋是生命的发源地，其覆盖面积约占地球表面的7 1 ，在广阔的海洋里生存着数以 万计的生物。由于海洋生态环境的特殊性，使得海洋生物拥有与陆生生物不同的代谢过程 及生理功能【。近几十年，人们通过对海洋藻类、微生物、海绵、腔肠动物、软体动物等 海洋生物的研究，从海洋动植物及微生物中分离鉴定出上万种天然活性物质 1 ，2 ，活性物质 的主要类型有肽类、萜类、聚醚类、脂类、醇酮类、生物碱、多糖类、有机酸、氨基酸类 等，每种活性物质类型含有许多结构不同的活性化合物，这些活性化合物不仅包括陆生生 物中已存在的各种化学结构类型，而且还存在着很多陆生生物未有的特殊化学结构类型， 海洋活性化合物的出现是寻找和开发具有药理活性物质的重要来源。 1 1 1 海绵天然产物研究 海绵被认为是最原始最低等的水生多细胞动物，据估计自然界存在的海绵约有1 5 0 0 0 种【2 3 】。海绵是机体没有器官的分化，其体内存在着一种过滤管系统，这种高度发达的过滤 管系统为许多微生物提供了生存空间。海绵是近十几年来一直被研究的海洋生物，是海洋 天然产物的重要来源。从海绵来源的生物活性物质有萜类、生物碱类、多糖类、聚醚类、 大环内酯类、多肽类和不饱和脂肪酸等。 目前，从海绵中分离出的多种结构新颖、药理活性显著，并且具有特定作用的天然产 物已进入临床试验，这些高活性化合物类型有海豚毒素、海葵毒素、麻壳鱼毒素等。 s p o n g o t h y m i d i n 6 4 j 和s p o n g o u r i d i n e 15 等几种物质是美国耶鲁大学b e r g m a n 从海绵 c r y p t o t e t h ac r y p t a 中分离出的阿拉伯糖核苷，s p o n g o t h y m i d i n e 的合成类似物a r a c 具有抗 肿瘤作用；大环内酰胺类化合物a 1 t e r a m i d ea 是s h i g e m o r i 从日本n a g a ik a n a g a w a 的海绵 h a l i e h o r d r i a k a d a i 中分离出的一种化合物，它具有明显的抗肿瘤活性作用【6 】； c a l l y s p o n g y n i c a c i d 是n a k a o 从美丽属海绵q f 脚。咒g 砌t r u n c a t e 中分离到的种多炔类物 质，具有很好的抑制葡萄糖苷酶效果；另外，从海绵体组织中分离出一种含脯氨酸的大环 内酯的硫化物a 1 和a 2 ，它们是n a k a o 发现的具有较强0 【葡萄糖苷酶抑制活性物质刀。近 年来，从海绵中还分离出诸如过氧化物、神经酰胺衍生物等类型的化合物，如 c y c l o t h e o n a m i d ee 4 是从r c n & s p 中分离到的一种化合物，它能够抑制人胰蛋白酶 ( i c 5 0 = 5 1 n m ) ，是有效治疗各种过敏性疾病的药物 引。 ! 扬州大学硕士学位论文 二= = _ 一一 1 1 2 海绵共附生微生物及其天然产物研究 海绵体存在着非常复杂的微生物生态系统，这为多种微生物的共同生活提供生存空 间，海绵体内和体表富集的这些微生物群落占海绵干重的4 0 左右。一种海绵体内可能存 在几十种不同的菌种 9 1 ，并且，在中质层中存在着大量的共生和寄生微生物，图1 1 是海 绵a p l y s i n ac a v e r n i c o l a 中质层中的微生物照片f 1 0 。 图1 - 1 海绵却咖n ac a v e r n i c o l a 中质层中的微生物照片 f i g 1 1t h ep i c t u r eo f m i c r o o r g a n i s m so f t h em e s o h y li ns p o n g e 和t y s 切口c a v e r n i c o l a 在复杂多变的海洋生态系统中，人们般很难从某局部海域重复采集到某种特定海洋 生物，海洋生物的这种难捕捉性使得人们将研究目标集中在海洋微生物中，海洋微生物具 有生长周期短、代谢易于调控、菌种较易选育等特点，如果对其进行大规模的发酵可望得 到大量的活性物质 】。海绵体内微生物的生存方式主要包括：( 1 ) 共生：微生物对海绵动 物的生命代谢活动有着至关重要的作用，在海绵和微生物之间存在相互依存，互惠互利的 一种共生关系【1 1 】；( 2 ) 附生：即微生物能给海绵动物带来某些利益，但海绵在它们不存在 时照样能够生存，两者之间是一种附生关系。近年来，对共附生微生物的研究越来越受到 人们的重视，共附生微生物所产生的次生物质可有效地抑制宿主竞争对手、天敌( 或捕食 者) ，从而大大提高宿主在海洋环境中的适应和生存能力。海绵体内微生物分泌的一些天 然化学物质，具有海绵化学防卫和抗污损作用，从而保护了海绵动物不被其他海洋生物的 捕食或附着。海绵体内丰富的微生物物种资源是开发医药化学品的重要来源，也是国内外 研究和开发具有自主知识产权的活性先导化合物的重要方向之一【1 2 ，l3 1 。 研究发现，从海绵中所获得的活性物质实际上是由海绵共附生的微生物所产生的 1 4 - 1 7 。并且很多研究报道指出，从海绵中分离出的化合物的分子结构与其共附生微生物的 产生物结构几乎完全相同。最早是s t i e l e 等证明了海绵共附生微生物是海绵天然产物的真 正生产者【1 8 】。每年有上百种的新化合物及其新功能被发现和研究，这些活性化合物都被证 明与海绵共附生微生物有关。化合物d e b r o m o h y m e n i a l d i s i n e 是张浩【3 】等从源于南海三亚地 区的小轴海绵a x i n e l l as p 的放线菌中分离纯化得到的物质，它具有治疗关节炎的作用，另 查鑫毒具有u 堑垄塑蔓堕塑生! 适壁堕童塑茎堕竺垡竺塑墨基适丝兰塑婴窒 ! _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - 一一。 一 外从中分离出的化合物h y m e n i a l d i s i n e 具有治疗神经障碍功效。a t s u s h in u m a t a 等人从海 绵协比h d ，z d r i 口j a p o n i c a 分离出的真菌g y m n a s c e l l a d a n k a l i e n s i s 中获得3 种化合物 g y m n a s t a t i n sa 、b 和c ，这3 种化合物对p 3 8 8 肿瘤细胞都具有很强的抑制作用。 1 20 【葡萄糖苷酶与糖尿病 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ) 刚是一种由于内分泌代谢紊乱所引起的疾病，临床症状为高 血糖、葡萄糖耐量减低及胰岛素释放实验异常等，主要原因是胰腺p 细胞分泌的胰岛素 ( i n s u l i n ) 减少或胰岛素敏感性降低引起的餐后高血糖，而高血糖又抑制了胰腺分泌胰岛 素，减少胰岛素调节外周组织对葡萄糖的吸收能力，从而导致因胰岛素分泌及作用缺陷所 引起的糖，脂肪和蛋白质代谢紊乱 2 1 1 。随着患糖尿病时间的延长，患者还会出现眼、神经、 肾、血管和心脏等组织器官的慢性并发症。世界卫生组织按糖尿病病因和发病机制将糖尿 病分为：i 型糖尿病、i i 型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。i 型糖尿病是由于 遗传和外界环境因素影响引起机体自身免疫功能紊乱，导致胰岛b 细胞损伤和破坏，使得 胰岛素分泌不足。i i 型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病，患这种病的人群约占糖尿病总 人数的9 0 ，主要原因是因为胰岛素分泌不足或胰岛素作用环节不健全所引起。特殊类型 糖尿病主要因为胰岛p 细胞功能遗传缺陷，胰岛素作用遗传缺陷，外分泌胰腺疾病，内分 泌疾病等所导致 2 2 。 血糖生成原理如图1 2 所示，人们从食物中摄取淀粉等多糖，通过体内代谢最终在o 【。 葡萄糖苷酶的作用下变成葡萄糖进入血液。 图1 2 血糖生成原理示意图 f i g 1 - 2t h eg e n e r a t i o np r i n c i p l eo f b l o o ds u g a r l 一 扬州大学硕士学位论文 二= = 二二_ 一一 o 【- 葡萄糖苷酶主要类型有位于小肠腔的o 【淀粉酶、小肠刷状缘的麦芽糖酶、c 【糊精酶 和蔗糖酶等。当人进食后，食物中的碳水化合物如淀粉先经0 c 淀粉酶作用，生成麦芽糖、 麦芽三糖、g 【一糊精等，随后和蔗糖一起通过蔗糖酶等o c 糖苷酶水解作用生成葡萄糖、半乳 糖和果糖，经肠壁细胞吸收而被机体利用。糖尿病患者病因的主要类型是i i 型糖尿病。目 前，治疗i i 型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为：( 1 ) 促胰岛素分泌剂：如磺酰 脲类；( 2 ) 胰岛素增敏剂：如屈吉他宗( t r o g l i t a z o n e ) 等噻唑烷衍生物；( 3 ) o 【葡萄糖昔 酶抑制剂：如阿卡波糖、伏格列波糖等。其中，0 l 一葡萄糖苷酶抑制剂能过可逆地占据o 【葡 萄糖菅酶与糖的络合位点，抑制0 【葡萄糖苷酶催化多糖降解为单糖，从而延缓肠道碳水化 合物的吸收。根据血糖生成原理可知，0 c 葡萄糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、无毒或毒 副作用小等优点，受到国内外很多研究者的关注。从上述酶反应原理示意图可以看出，o 【 葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制o 【葡萄糖苷酶的活性，使葡萄糖的生成及吸收减缓，降低餐 后高血糖，调整血糖水平，从而减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，有效地 预防和改善糖尿病并发症的发生，使患者血糖维持在一定水平，稳定血糖指数【2 4 1 。 1 30 【葡萄糖苷酶抑制剂 o 【葡萄糖苷酶抑制剂是一种新型口服降糖药，对任何类型糖尿病具有很好的疗效作用。 目前，对o 【葡萄糖菅酶抑制剂药物来源的研究越来越受人们的关注，主要来源有三种：一、 天然动植物及海洋生物产物中提取；二、化学半合成的0 【葡萄糖苷酶抑制剂；三、微生物 由来的u 葡萄糖苷酶抑制剂。0 【一葡萄糖苷酶抑制剂作为降糖药物，其筛选和研制源于德国 和日本。人们最初是从细菌( 放线菌属，链酶菌属) 中提取一系列的o 【葡萄糖苷酶抑制剂 物质，随着研究的深入，0 【一葡萄糖苷酶抑制剂的来源已深入周围环境的各个领域。 1 3 1 从天然动植物中提取的0 【葡萄糖苷酶抑制剂 从天然动植物中发现的o 【葡萄糖苷酶抑制剂种类繁多。很多天然植物如苦瓜、绞股蓝、 山药、蜂胶之类就具有降血糖功效，它们的提取物对0 【葡萄糖苷酶有明显的抑制作用【2 引。 天然产物r a d i c a m i n e s a 和b 是从半边莲中分离到的两种新型吡咯烷型生物碱，它们是很 好的0 【一葡萄糖苷酶抑制剂 2 6 。s a l a c c i n o l 和k o t a l a n o l 是从印度植物s a l a c i ar e t i c u l a t ew i g h t 的根和茎的水提物中分离提取出的0 【葡萄糖苷酶抑制剂，体外实验表明，s a l a c c i n o l 和 k o t a l a n 0 1 对小肠内0 【一葡萄糖苷酶具有较强的抑制活，l 生 2 7 , 2 8 。另外，植物来源的类黄酮 ( f l a v o n o i d ) 物质对0 【一葡萄糖苷酶有一定的抑制效果，j o n gk 等发现，从植物中提取出的 毛地黄黄酮，毛地黄黄酮一7 一氧葡糖苷、大豆黄素对o 【，葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性【2 引。 此外，如桑叶、桑枝、桑白皮之类的水提物是黄哲、白钢等研究发现的对。【一葡萄糖苷酶有 查鑫矗具有0 【葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究 5 抑制活性作用的物质，并且抑制率与阿卡波糖相似阢3 。m a t s u u r a 3 3 1 等从海索草的干燥叶 子中分离提取的有效成分对o 【一葡萄糖苷酶有抑制作用。k i m 等 3 4 】从鸭跖草中提取的2 ，5 一 二羟甲基。3 ，4 。二羟吡咯烷、四个哌啶生物碱、1 一脱氧野尻霉素等物质，对0 【葡萄糖苷酶 具有明显的抑制作用。 此外，在对天然产物的研究过程中，很多食用食物中具有着很多对o 【葡萄糖苷酶有较 强抑制活性的物质，如食用食物杜仲等来源的天然化合物对酵母0 【葡萄糖苷酶活性有很强 的抑制作用，其抑制率达9 2 1 32 | 。 1 3 2 化学半合成的0 【葡萄糖苷酶抑制剂 化学半合成的0 【葡萄糖苷酶抑制剂是以天然产物或微生物发酵产物为母体，根据天然 化合物的结构进行修饰，再通过化学合成的方法获得。人工合成的伏格列波糖和米格列醇 就是很好的降低餐后高血糖的0 c 葡萄糖苷酶抑制剂类药物。伏格列波糖盼3 6 1 的人工合成途 径主要有两条：一条是由有效霉素产生菌经发酵并分离到产物有效霉素a ，经生物转化得 到中间体v a l i e n a m i n e ，再通过化学合成获得；另一条途径同样是利用有效霉素产生菌发酵， 然后直接从发酵代谢产物中分离中间体v a l i e n a m i n e ，最后经化学合成获得。其化学合成方 法是根据v a l i o l a m i n e 与1 ，3 二羟基丙酮的反应，形成薛夫氏碱，然后经还原制得，在反 应的过程中，氨基和仲氨基形成的脱水缩合健与天然假性寡糖类0 【葡萄糖苷酶抑制剂有所 不同，它们分子中不具有糖苷键，与天然产物相比，对水解酶类、酸和碱都很稳定。化学 合成物米格列醇3 7 1 是目前比较新的仅一葡萄糖苷酶抑制剂，其结构与葡萄糖的化学结构相 似，是1 脱氧野尻霉素衍生物。米格列醇主要制备方法是野尻霉素或1 脱氧野尻霉素产生 菌发酵后所得到的野尻霉素或1 脱氧野尻霉素，然后经化学合成、生物转化，再经化学合 成所得。 在对0 【葡萄糖苷酶抑制剂结构的研究过程中，人们发现很多o 【葡萄糖苷酶抑制剂存在 着共性，很多研究者从这些共性中设计出许多具有很强抑制活性的化合物。常见的化合物 类型有五元环、六元环及寡糖类。六元环物质主要有糖苷类、醛糖1 ，5 内酯类、醛糖1 ， 5 内酰胺类、吖糖类，其中吖糖是糖苷酶很好的抑制剂，1 脱氧野尻霉素属于吖糖类 3 8 】， 它的衍生物n 一丁基脱氧野尻霉素，能够较好地抑制h i v 病毒的感染。寡糖类衍生物包括 木二糖的各种含n 衍生物、纤维二糖的衍生物。曲二糖假二糖及假三糖如n 一丁基一环异脲 被证明对c 【一葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶有很强的抑制活性p 9 l 。 1 3 3 微生物由来的0 【葡萄糖苷酶抑制剂 科学家梅译滨夫在2 0 世纪6 0 年代提出从微生物代谢产物中寻找酶抑制剂活性物质。 扬州大学硕士学位论文 19 6 6 年，u m e z a w a 从链霉素的代谢物中发现野尻霉素( n o j i r i m y c i n ) 具有抑制a 葡萄糖苷 酶的作用【矧，1 9 7 7 年，德国科学家发现放线菌s e 5 0 、s e 8 2 和s e l 8 的代谢产物对0 【葡萄 糖苷酶有很好的抑制效梨4 1 4 2 1 。 随着研究的深入，国内也有很多0 【葡萄糖苷酶抑制剂的相关报道，如郎国竣【4 3 】采用 h d 1 大孔酚醛系弱酸性阳离子交换树脂柱层析、h z 8 0 6 大孔吸附树脂柱层析、硅胶薄层 层析、高效液相制备色谱等方法，得到0 【葡萄糖苷酶抑制剂纯品( 纯度9 5 以上) ，其抑 制活性约为阿卡波糖的1 0 倍。王欣荣【删等从2 0 0 0 株放线菌中筛选出淡紫灰链霉菌，其代 谢产物对a 葡萄糖苷酶的抑制活性与阿卡波糖相当。孙敏【4 5 】等从菌株e 3 5 1 9 的发酵液中 分离到的s h 9 7 6 6 对0 【淀粉酶和蔗糖酶有很强的抑制作用。l e e 4 6 】等从一种链霉菌的发酵 液中分离出染料木素，同样具有0 【葡萄糖苷酶抑制活性。 1 4 典型仅葡萄糖苷酶抑制剂类药物 1 4 1 阿卡波糖( a c a r b o s e ) 阿卡波糖的结构如图 图1 - 3 阿卡波糖的分子结构 f i g 1 3m o l e c u l a r s t r u c t u r eo f a c a r b o s e 嘲 阿卡波糖于1 9 9 0 年在德国上市，是b a y e r 公司推出的第1 个0 【葡萄糖苷酶抑制剂， 商品名为拜糖平。主要作用是抑制小肠上段0 【葡萄糖苷酶，使碳水化合物在该肠段分解成 葡萄糖的量减少，延缓碳水化合物的分解过程，从而避免进餐后血糖聚然升高。体外研究 表明，阿卡波糖对体内代谢的葡萄糖淀粉酶的抑制作用最强，其次是蔗糖酶、麦芽糖酶及 异麦芽糖酶。并且，阿卡波糖是目前唯一可用于干预i c t 的药物【4 2 1 。 1 4 2 伏格列波糖( v o g l i b o s e ) 伏格列波糖的结构如图1 4 查鑫矗具有c 【一葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究 7 h h ，0 h r 。h 图1 4 伏格列波糖的分子结构 f i g 1 - 4m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fv o g l i b o s e 伏格列波糖于1 9 9 4 年在日本上市，商品名为倍欣。伏格列波糖是一种o 【d 葡萄糖苷 酶抑制剂，作用机理是竞争性地抑制小肠粘膜麦芽糖酶、异麦芽糖酶、糖苷酶等双糖向单 糖分解，从而使d 葡萄糖的量减少，伏格列波糖具有延缓淀粉和蔗糖的消化吸收，降低血 糖的功效4 7 1 。 1 4 3 米格列醇( m i g l i t 0 1 ) 米格列醇的结构如图： o 。h 孵。h 摊0 a v 漩、 、0 h 图1 5 米格列醇的分子结构 f i g 1 5m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fm i g l i t o l 米格列醇于1 9 9 8 年最先在德国上市，其作用机制与拜糖平相似。米格列醇通过有效 地抑制蔗糖酶和葡萄糖淀粉酶的活性，控制碳水化合物的全程消化。主要针对i i 型糖尿病 患者，对i 型和某些继发糖尿病患者可作为辅助治疗1 3 川。 1 5 新型0 c 葡萄糖苷酶抑制剂及其应用 目前，人们从植物、微生物代谢产物和化学品中筛选并提纯出很多新型0 【葡萄糖苷酶 抑制剂，并在临床上得到广泛应用。在对新型0 【葡萄糖苷酶抑制剂的研制过程中，发现q 一 葡萄糖苷酶抑制剂与0 【。葡萄糖苷酶之间存在构效关系，陈海敏 4 8 等通过测定多种糖及糖衍 生物的抑酶性，发现抑制剂对糖苷酶的作用方式主要是先形成糖- 酶中间体，然后通过亚基 间的酸性氨基酸进行广义酸碱催化及亲核作用，形成碳瓮离子过渡态类似物。研究酶、抑 制剂及二者的相互作用是寻找新型高效酶抑制剂类药物的基础。 0 【葡萄糖苷酶抑制剂除了在治疗糖尿病方面有独特的疗效。近年来，研究发现o 【一葡萄 扬州大学硕士学位论文 糖苷酶抑制剂还有治疗艾滋病，癌症，肥胖症等功效，并为这些疾病的治疗开辟了新的方 向。米格列醇除了在治疗糖尿病上得到广泛的应用，它还可以通过作用于艾滋病病毒( h i v ) 外壳组成成分阻止病毒与c d 4 后期的连接，抑制h i v 的体外表达和合成，具有抗h i v 的 作用 4 9 。此外，糖苷酶抑制剂还可以通过扰乱乙型肝炎病毒( h b v ) 的包膜阻止其形成和 分泌。 1 6 活性先导化合物活性筛选模型 药物筛选模型是对具有药理活性( 生物活性、治疗作用) 的某些物质所建立的实验方 法，在长期的药物研究过程中，人们通过建立新药筛选模型，研究并发现很多新药。随着 生命科学的发展，很多新的药物筛选模型陆续出现，这些筛选模型不仅促进新药物的发现， 而且给药物的筛选带来了很多新方法、新技术 5 0 , 5 1 。 随着新药研究的发展，药物筛选模型包括三种类型：受体结合模型、细胞水平的筛选 模型、酶靶筛选模型。 受体结合模型通常是利用放射性标记的配体与受体结合，来寻找能阻断或增强内源化 学信息因子与细胞受体结合的新型化合物，从而达到治疗目的。细胞水平的筛选模型是为 了观察被筛样品对细胞的作用，用于筛选的细胞模型，包括各种正常细胞、病理细胞( 如 肿瘤细胞和经过不同手段模拟的病理细胞) 。酶靶筛选模型是根据酶抑制剂与酶的反应产 物，测定抑制剂的抑制活性，通过检测酶的反应底物、产物等指标，确定酶反应速度。 受体结合模型是一种直接作用结果，但生物中的一些影响因素会对生物活性和药动学 的变化产生较大的影响，直接影响筛选结果。细胞水平的筛选不能反应药物作用的具体途 径和靶点，只能反映药物对细胞生长等过程的综合作用。酶靶筛选模型可以排除前两种模 型在体内和细胞进行实验的一些负面影响，但要根据酶的特点来决定，酶靶筛选模型是从 自然资源中获取酶抑制剂的有效途径。 药物筛选模型是发现新药的重要条件，建立新模型会带动新型药物的发展。随着分子 生物学、细胞生物学、计算机科学的发展，人们在药物筛选模型的研究上投入了更多的精 力，为医药研究带来了优势条件。 1 7 选题意义和研究方案