（环境科学专业论文）北京市典型行业废水中的雌激素效应和多环芳烃含量分析.pdf

a b s t r a c t t h i sp a p e rr e s e a r c h e st h e e s 仃o g e n i c i t ya n d16u s e p ap r i o r i t yp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) p 0 1 1 u t i o ns i t u a t i o no fd i f 琵r e n tr e p r e s e n t a t i v ei n d u s t r i a l w a s t e w a t e ri ns u m m e ra n dw i n t e rb yu s i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ，r e c o m b i n a l l t g e n ey e a s ta s s a yw i t hs a m p l e s 矗a c t i o n a t i o na i l dg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s s ( g c m s ) t h ei n d u s t r i a la n du r b a nw a s t e w a t e rs a r n p l e sw e r ec o l l e c t e df r o mt h et a i z h o u w u p o n d ，n o 2c h e m i c a lp l a n t ，g u a i l g m i n gh o s p i t a l ，h u a d uc h i c k e nf a r m ，z i z h u p h a n n a c e u t i c a lc o m p a n y ，l u g o u q i a ow a s t e w a t e rt r e a t i 工l e mp 1 a j l t ( w w t p ) a n d j i u x i a l l q i a ow a s t e w a t e r t r e a t n l e mp l a n ti nb e 巧i n g i tc o l l e c t e d2 5w a t e rs a m p l e s 疗o mt h ei r u s t r i a la n du r b a nw a s t e w a t e ri n s 吼m e ra 1 1 dw i n t e ru s i n gr e c o m b i n a n tg e n ey e a s ta s s a yt oa i l a l y z ea ut h ew a t e r s a m p l e s ，m er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r e i s e s t r o g e n i c i t yi na ut l l ee m u e n tw a t e r s a r n p l e st os o m ee x t e n t t h e1 7 一be s 也l d i o le q u i v a l e n tc o n c e i l t r a t i o n ( e e q ) o ft h e s o u r c ew a t e ri s1 3 1 3 8 9 n lt h es me e qo f n o n p o l a r i t y ，p e a k p o l a r i t ya n d p 0 1 a r i t yi s5 o 5 4 3 n g l t h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 e r e a r ec o o p e r a t ea n da n t a g o n i s m a c t i o n s 锄o n gt h ed i 鼠r e n te s t r o g e nm i m i c si nw a t e rs 锄p l e s n l ec o m p a r i s o ne e q o fa l lt l l ew a t e rs a m p l e sh a sn or u l e s t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h er e m o v a lr a t i oo n e s t r o g e nm i m i c so fl u g o u q i a ow w t p i sb e t t e rt h a i lj i u x i a i l q i a ow w t p u s i n gg c m st oa n a l y z e1 6u s e 队p r i o r i t yp a h s ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h e r ea r e15p a h sb e e nd e t e c t e d u n l e s sb e n z o a p y r e n e t h ec o n c e n t r a t i o no fp a h si s o 5 2 6 9 8 0 0 n g l ；t h e p a h si s3 1 6 3 7n g l 2 2 7 7 n g l ；t h em a i nc o m p o s i t i o n o fp a h sa r et w or i n ga 1 1 dt h 豫er i n g t h e p a h so fa l l 也ew a t e rs a m p l e si ns u m m e r i sh i 曲e rt h a i li n 、v i n t e ru n l e s sl u g o u q i a ow w t pt h er a t i ou pt op a ro fa l lt h ew a t e r s a r n p l e sa r e1 0 0 k e yw o r d se s t r o g e nm i m i c s ，e s l r o g e n i c i t y ，p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ， r e c o m b i n a n tg e n ey e a s t ，f r a c t i o n a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 讶 鳍 日期：b 6 u 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 蚜恒驾 导师签名：i 垒31 日期娜jf 。| 亨 第l 章绪论 1 1 课题来源 北京市自然科学基金项目北京市不同水体中环境内分泌干扰物分布及 生物效应研究( 8 0 5 2 叭8 ) 。 本课题由中科院生态环境研究中心和北京工业大学共同承担。 1 2 课题研究背景 1 2 1 雌激素效应 1 2 1 1 概念 环境雌激素是内分泌干扰物的一种，是具有雌激素活性的外源性化合物。 雌激素效应( e s _ r o g e n i c i t y ) 是指由环境雌激素( e s 订o g e n m i m i c s ) 引起的对生态 系统内生物体内分泌或与其相关系统的干扰损害作用，主要包括对生物体的生 殖与生长发育的干扰影响，致突变或致癌性影响，内分泌系统紊乱或正常免疫 功能改变影响，神经系统失调影响等现象 1 】。环境雌激素通常包括类似于雌激 素的外源性化学物质( 邻苯二甲酸酯、壬基酚、双酚a 、已烯雌酚、1 7 一乙炔 基雌二醇等) 和环境中的内源性雌激素( 1 7a 一雌二醇、1 70 一雌二醇、雌三醇、 雌酮) 【2 j 。 内分泌干扰物，学术界称为“e n d o c r i n ed i s m p t i n gc h e m i c a l s ( e d c s ) ”或 “e n d o c r i n ed i s n l p t e r ”，直译为“内分泌干扰物质”，也称环境激素。内分泌干扰 物是指由于人类的生产和生活活动而释放到环境中的、对人体内和动物体内原 本营造的正常激素功能施加影响，从而影响内分泌系统的化学物质作用的物 质”1 。美国环保署( u s ep _ a ) 将这类化学物质影响内分泌系统的具体过程描述 为：对生物的正常行为及生殖、发育相关的正常激素的合成、贮存、分泌、体 内输送、结合及清除等过程产生妨碍作用【“。雌激素效应属于内分泌干扰效应 内输送、结合及清除等过程产生妨碍作用【4 】。雌激素效应属于内分泌干扰效应 北京工业大学工学硕：匕学位论文 ( e n d o c r i n ed i s r u p t i n ge 骶c t ) 的一种，目前国内外学者对内分泌干扰效应的介 绍和研究基本都是针对雌激素效应而来。 1 9 9 6 年，美国环保署首次正式列出了6 0 种有内分泌干扰效应的化学物质， 1 9 9 7 年美国环保署又进一步对这些物质作了分类；1 9 9 6 年，美国“o u rs t o l e n f u t u r e ”一书列出5 0 种；1 9 9 7 年世界野生动物基金会( w w f ) 把上述5 0 种扩 展为6 8 种；1 9 9 7 年日本环境厅关于外因性扰乱内分泌化学物质问题的研究班 中间报告列出6 5 种；1 9 9 7 年，美国国家环境健康中心疾病控制与预防及公共 健康服务中心( c d c ) 列出了4 8 种；1 9 9 9 年世界自然基金会列出了1 2 5 种： 2 0 0 3 年，日本国立环境研究所( n i e s ) 公布了6 8 种被怀疑具有内分泌干扰效 应的化合物。现在己列入内分泌干扰物黑名单中的人工合成化学物质已有1 0 0 余种，并且还在不断增加。这些内分泌干扰物按其来源和用途可分类为：工业 有机化学品( 包括其副产品或杂质，如二嗯英和苯并【a 芘) 、除草剂、杀真菌剂、 杀虫剂、杀线虫剂、杀生剂、金属及其有机化合物 5 ，6 1 。 1 2 1 2 内分泌干扰效应的形成机理 内分泌干扰物干扰血液中激素，与激素结合蛋白相结合，影响其发挥生理作 用功能。内分泌干扰物通过各种途径进入体内，干扰激素的作用。内分泌干扰 物可以通过以下途径干扰正常的内分泌系统而产生内分泌干扰效应【7 】： ( 1 ) 内分泌干扰物进入细胞内，模仿天然激素，与激素结合位点结合，形 成配体一受体复合物后，再结合到d n a 结合区的d n a 反应元件上，从而影响 人和动物的生殖能力。内分泌干扰物还可能在细胞内作用于细胞核内的核酸或 酶系统，引发遗传变异。 ( 2 ) 在结构上与生物体蛋白质、肽类激素相似的内分泌干扰物进入生物体 后，与生物体激素竞争靶细胞上的受体，与其结合，减少受体对天然激素的吸 附，从而影响人体或动物体正常生理活动。 1 2 1 3 危害 1 2 1 3 1 内分泌干扰效应对人类的危害 内分泌干扰效应对人类危害极大，主要是内分泌干扰物进入体内，与受体结 合，扰乱正常的内分泌系统、神经系统、免疫系统等，从而导致各种病变。 第l 章绪论 ( 1 ) 内分泌干扰效应对人类生殖的影响。女性的视丘下部、垂体、卵巢等 部位接触了内分泌干扰物后将危害她们的生殖能力，并最终导致不孕不育。数 据表明极其低浓度的多氯联苯p c b 就能通过不同的细胞和分子机制扰乱哺乳动 物的卵母细胞成熟 8 】o 在美国，怀孕率在1 9 9 6 年比1 9 9 0 年要低9 。由于内分 泌干扰物的影响，在美国纽约州，居住在重度污染地区的夫妇比居住在轻度污 染地区夫妇的不孕率要高。在德国一项大规模的研究中，在不育妇女体内均检 出了高浓度的多氯联苯p c b ，滴滴涕d dt ，六六六h c b 等有机氯化合物 9 】。内 分泌干扰效应能导致男性精子数量减少和质量降低。2 0 世纪9 0 年代后，丹麦首 先报道了男性精子数量减少，生殖功能异常。苏格兰研究表明，1 9 7 0 年以后出 生的男性精子数量比1 9 5 9 年以前出生的人显著降低。我国每8 对夫妇中就有1 对不育。目前西方发达国家约有2 0 的夫妇苦于没有孩子【i o 】。 ( 2 ) 内分泌干扰效应对发育的影响。内分泌干扰效应导致青少年提前出现 第二性征。在波多黎各，5 年的时间里有数以千计的儿童出现青春期前乳房发育， 青春期前阴毛发育或性早熟，体内激素水平升高 1 l 】。而在我国上海，儿童性早 熟发病率已达l 【”】。 ( 3 ) 内分泌干扰效应对神经行为的影响。极低水平( 低到通常不认为是有毒 的水平) 的多氯联苯p c b 或二嗯英类化合物就可能改变母亲和胎儿的甲状腺功 能，导致神经系统的发育障碍。在美国大约有5 l o 的学龄期儿童有好动症、 注意力分散、记忆障碍和一些运动技能障碍。据测试，接触农药组儿童的手和 眼协调能力差，3 0 分钟记忆力差，而且画人形时多数都画不像【13 1 。魏泽兰研究 认为，内分泌干扰效应可导致神经系统的发育迟滞和行为改变，如阿尔茨海默 病【1 4 】。 ( 4 ) 内分泌干扰效应对免疫系统的影响。内分泌干扰效应作用于人体激素， 会使人体内分泌系统紊乱，进而使免疫系统受到伤害【1 0 1 。 ( 5 ) 内分泌干扰效应对肿瘤发生的影响。内分泌干扰效应可引起乳腺癌、 前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、甲状腺癌、副睾丸囊肿、阴道癌等陋1 6 ”】。美国 5 0 岁以下男人1 9 4 0 年以来前列腺癌发病率增加达3 倍之多 1 8 】。 1 2 1 3 2 内分泌干扰效应对动物的危害 北京工业大学工学硕士学位论文 内分泌干扰效应广泛存在于生物体内，其大部分通过水生食物链，小部分 通过陆生食物链对野生动物产生不良影响。内分泌干扰效应对动物造成的危害 主要表现为生殖器官、生殖机能和生殖行为的异常。 在野生动物中，因为鱼类处于内分泌干扰效应污染的始点，所以对鱼类的 研究最多。在西班牙北部埃布罗河的鲤鱼群，英国河流的野生鱼群，易北河 的野生鲤鱼，瑞典偏远河流中的河鲈，波河的刁子鱼群中都检出了内分泌干扰 物1 2 0 1 。在意大利的墨西拿海峡捕获的旗鱼体内检测到了高浓度的多卤芳烃和有 毒金属，在它们肝脏中检测到l 2 2 m l h g ，1 2 8 m g l c d ，0 1 6 m lp b 【2 l 】。 内分泌干扰物能导致水生动物生殖能力降低、甲状腺增大、雌雄同体化等。 内分泌干扰效应对爬虫类有危害【2 2 1 。美国佛罗里达州湖泊里的雌性鳄鱼卵 的孵化率降低。 内分泌干扰效应对鸟类有危害【引。美国五大湖的海鸥雌性化，患甲状腺瘤。 美国密歇根湖的美国燕鸥的孵化率降低。 内分泌干扰效应对哺乳动物类有危害。上世纪6 0 年代，只有5 种有机氯农 药在8 1 种海洋哺乳动物体内被检出，但是到了上世纪9 0 年代，2 6 5 种有机污染 物在全世界超过5 0 0 0 种海洋哺乳动物体内被检出【2 3 。哺乳动物在胎儿和刚出生 时期比成年后更容易感染内分泌干扰物。荷兰的海豹和加拿大的白海豚免疫功 能下降，数量减少。美国的美洲狮睾丸缩小、精子数量减少。研究表明，出生 前和或出生后接触辛基酚、壬基酚、双酚a 、甲氧d d t 、d d t 同系物、狄氏 剂、艾氏剂和p c b s 等内分泌干扰物能提前老鼠的青春期【2 4 】。 1 2 2 多环芳烃 1 2 2 1 概念 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 是指含有两个以上苯 环的碳氢化合物。可分为两类：第一类是芳香稠环化合物，也称稠环芳烃，即 相邻的苯环至少有两个共用的碳原子的碳氢化合物。第二类是苯环直接通过单 链联结，或通过一个或几个碳原子联结的碳氢化合物【2 5 】。常见的多环芳烃大多 数由4 7 个苯环组成，一般4 5 个苯环组成的烃类往往具有致癌作用，由6 个苯 环组成者也有一部分为致癌物，由6 个以上苯环组成的致癌可能性很小。已发现 弟l 苹躇论 多环芳烃类物质中有4 0 0 多种具有致癌作用，而其中的苯并 a 芘的致癌特性最 强，在各国饮用水标准中多用其作为控制化合物。中国政府列出的“中国环境 优先监测黑名单”中包括7 种多环芳烃。美国环保署在1 9 7 9 年列出的优先控制污 染物“黑名单”中就有1 6 种多环芳烃化合物。1 6 种优先控制的多环芳烃中，已 知具有明显的致癌效应的化合物有苯并【a 芘、 、苯并 a 蒽、苯并 b 荧蒽、二 苯并【a ，h 】葸。美国环保署优先控制的1 6 种多环芳烃结构如图l 一1 所示： 娼豳 1 4 1 萘，2 苊烯，3 苊，4 芴，5 菲，6 葸，7 荧葸，8 芘，9 苯并 a 葸，1 0 蔗，1 1 苯并 b 荧葸， 1 2 苯并 k 】荧葸，1 3 苯并 a 芘，1 4 茚并【1 ，2 ，3 一c d 芘，1 5 二苯并 a ，h 葸，1 6 苯并【g ，h ，i 】芘 图1 1 美国环保署优先控制的1 6 种多环芳烃结构示意图 f i g 1 1 t h ec h e m i c a ls 仃u c t u r eo f l 6 u s b p ap r i o r i t y p a h s 5 拶蕊留涕笫$ 弱 ，够 。；印 北京工业大学工学硕= l 学位论文 美国环保署1 6 种优先控制的多环芳烃概况见表1 1 。 表l 一1 美国环保署优先控制的1 6 种多环芳烃概况 t 曲l e1 1i n t r o d u c t i o no f1 6u s e p a pr i o r 时p a h s 6 第l 蕈绪论 1 2 2 2 特性 多环芳烃性质稳定、脂溶性强，不易水解，五环以上的多环芳烃大都是些 无色或淡黄色的结晶，个别具有深色，熔点及沸点较高，所以蒸气压低被摄 入动物体内后即溶于脂肪，很难分解排泄。随着摄入量的增加，这些物质在生 物体内的含量会逐渐增大，随着营养级的提高，含量也逐步增大，其结果使食 物链上高营养级生物机体中这种物质的含量显著地超过环境中的含量。由于生 物放大作用，进入环境中的污染物，即使是微量的，也会使生物尤其是处于高 位营养级的生物受到毒害，甚至威胁人类健康。 多环芳烃主要来自化石燃料等的不完全燃烧，源排放的多环芳烃首先进入 大气，因此长期以来人们的研究主要集中在大气环境中的多环芳烃【2 6 】。由于多 环芳烃化学性质稳定，难以被生物降解，具有“三致”效应，在多介质环境中 易发生迁移转化进入水体、土壤等【2 7 】。 多环芳烃大多不溶于水，而辛醇一水分配系数比较高。水体中的多环芳烃 可呈三种状态：吸附在悬浮性固体上；溶解于水：呈乳化状态。由于多环芳烃 在水中的溶解度较小，它在地表水中浓度很低，但多环芳烃易于从水中分配到 生物体内或沉积物中，所以沉积物和生物体中该类化合物的残余物浓度可达 m g l 级。 1 2 2 3 危害及污染现状 多环芳烃在环境中的存在虽然是微量的，但其不断地生成、迁移、转化和 降解，并通过呼吸道、皮肤、消化道进入人体，极大地威胁着人类的健康。多 环芳烃是人们最早发现具有致癌效应的化合物，1 9 5 0 年以前，多环芳烃被认为 是最主要的致癌因素。后来人们认识到多环芳烃只是众多类型致癌物中的一种， 但这并不因此降低了多环芳烃致癌的重要性。它至今仍然是数量上最多的一类 致癌物，在总数已达1 0 0 0 多种的致癌物中，多环芳烃将近占了1 3 以上。近年来， 各国的肺癌发病率和死亡率都显著上升，事实表明多环芳烃是导致肺癌发病率 上升的重要原因。有调查表明苯并【a 】芘浓度每1 0 0 m 3 增加o 1pg 时，肺癌死亡率 上升5 f 2 7 】。 对多环芳烃的致癌机理目前研究较多。有的学者认为，具有致癌性的多环 ：嘏j 7 渤： 珊 的k 嚣辩鼓 慧l 隧示意 图l 一2 多环芳烃中的k 区和l 区 f g 1 2 kz o n e l z o n eo f p a h s 多环芳烃是环境中有机物热解和不完全燃烧的产物。煤、石油、木材、 有机高分子化合物、烟草和许多碳氢化合物在不完成燃烧时都能生成多环芳 烃。当温度在6 5 0 9 0 0 ，氧气不足而未能深度氧化时，最易生成多环芳烃。 环境中的多环芳烃主要来源于煤和石油的燃烧。其生成量同燃烧设备和燃烧 温度等因素有关。焦化、煤气、煤油等工厂排出的废气、废水和汽车、飞机 等交通运输工具以及采暖锅炉和家庭炉灶排气是多环芳烃的主要污染源。除 此之外，多环芳烃还存在于熏制的食物和香烟雾中口。 1 3 课题的研究目的与意义 为了要实现“新北京、新奥运”的战略目标，坚持噱i 色奥运”理念，为2 0 0 8 年奥运会提供一个清洁、优美的环境，北京市计划2 0 0 8 年市区污水处理率达到 9 0 以上，再生水经过适当处理后将主要用于补充河湖景观水体、农业灌溉、 8 第1 章绪论 回填地下水，提供市政、绿化或冲洗需水。而对北京市典型行业废水中的雌激 素效应以及多环芳烃的研究鲜有报道，因此有必要对这个领域进行研究，以提 供第一手资料给相关部门参考。 本课题的目的有三个：( 1 ) 利用重组雌激素受体基因酵母法测试对北京市 典型行业废水中可能存在雌激素效应的点源进行检测，以了解雌激素效应的动 态变化规律；( 2 ) 利用气相色谱一质谱对北京市典型行业废水中的多环芳烃进 行检测；( 3 ) 研究北京市卢沟桥污水处理厂与酒仙桥污水处理厂各工艺段对雌 激素效应和多环芳烃的去除效果。 我在课题中的作用是：( 1 ) 点源的调查；( 2 ) 参与采样，独立完成样品的 前处理过程，雌激素效应及多环芳烃测试；( 3 ) 对结果进行分析讨论。 工作创新点：首次用生物分级样品的重组雌激素受体基因酵母生物毒性测 试方法结合多环芳烃的化学分析对北京市不同污水的环境雌激素分布水平进行 分析调查。比较了环境雌激素夏季和冬季的含量水平。 9 第2 章国内外研究结果综述 2 1 内分泌干扰效应的研究现状 内分泌干扰效应已经引起了包括欧盟、美国环保署、世界经合组织、世界 卫生组织等国际机构和许多非政府组织的重视【2 9 。日本环境厅于1 9 9 8 年公布了 环境荷尔蒙战略计划，1 9 9 1 年以来，英、美、日等国均召开了有关内分泌干效 应的科学研讨会。 欧美于2 0 世纪9 0 年代开始系统研究内分泌干扰物，为此成立了专门的工 作机构负责内分泌干扰物研究的规划与协调工作。研究框架包括确认内分泌干 扰物对人类和生态效应的方法、剂量一效应关系模型以及检测环境暴露水平等， 研究对环境威胁最大的内分泌干扰物的主要毒理学，包括有致癌性、生殖发育 毒性、神经毒性和免疫毒性。目前危险度评价的新进展是应用定量结构活性关 系( q s a r ) 模型预测化学物的安全性。 1 9 9 1 年以来，英、美、日等国均召开了有关内分泌干扰物的科学研讨会。 1 9 9 7 年世界野生动物基金会( w w f ) 召开会议，启动了庞大的“蓝带专家”f b l u e r i b b o n ) 内分泌干扰物的研究计划。1 9 9 8 年欧洲环境毒理和化学学会年会，将内 分泌干扰物作为大会的重要主题。1 9 9 9 年在布鲁塞尔召开第八届毒物生态环境 委员会全体会议，会议的主题讨论了内分泌干扰物对野生动物和人类的影响， 并推出了野生生物生态毒理学测试方法【3 0 1 。 2 0 0 0 年1 2 月1 0 日全世界1 2 2 个国家在约翰内斯堡达成一致协议：制定一 项国际公约，禁止使用或者严格限制使用1 2 种毒性极强的化学物品，包括艾氏 剂、异狄氏剂、毒杀芬、氯丹、狄氏剂、七氯、灭蚁灵、d d t 、六氯苯、多氯 联苯、多氯二苯并二恶英( p c d d s ) 及多氯二苯并呋喃( p c d f s ) 等，这些化 学物会通过食物链污染环境，引起先天性缺陷、癌症和儿童发育等问题。 2 0 0 1 年3 月2 1 日美国疾病控制中心( c d c ) 发布一份报告，题为“人体 暴露于环境化学物质”的国家报告。该报告记述了对美国小范围人群尿中环境 1 1 北京工业大学工学硕士学位论文 化学物质的调查。疾病控制中心的调查目的并不是为了确认人体尿中的环境化 学物质和疾病间的联系，而是要获知更多关于人体暴露于工业化学制品这一领 域的信息。 2 0 0 1 年5 月2 3 日，包括中国在内的1 2 7 个国家和地区的环境部长和高级官 员在瑞典首都斯德哥尔摩签署了一项国际公约，决定在世界各地禁止使用或限 制使用1 2 种持久性有机污染物，绝大多数属于内分泌干扰物。该公约已于2 0 0 4 年1 1 月1 1 日在中国生效【3 1 。 2 0 0 4 年9 月2 0 一2 4 日，鹿特丹公约缔约国第一次代表大会在同内瓦召 开，公约禁限清单上的农药和有毒化学品总计4 1 种，绝大多数属于内分泌干扰 物【3 2 。 现在的研究将系统地鉴别那些能干扰生殖系统正常生长和功能的环境化学 物。实际上只有4 0 多种环境污染物被认定为内分泌干扰物，其中的大多数只是 因为危险事故才被认为内分泌干扰物，而不是基于合理的和详尽的检测程序。 只有在对哺乳动物进行风险评价的合适的生物标志被确定并用于大规模的对潜 在毒性化合物进行检测后才能确定化合物是否是内分泌干扰物 3 3 1 。 今后内分泌干扰效应领域研究的前沿和重点应该是：1 内分泌干扰效应 的致毒生物化学机理的深入研究；2 内分泌干扰物在环境介质中的迁移、转化 和积累的行为研究；3 内分泌干扰效应容量的确定，以及如何将其纳入定量监 测评价中；4 内分泌干扰物的鉴别和确定。 2 2 多环芳烃研究现状 多环芳烃的研究主要集中于其在大气和沉积物中的污染行为。近年来，有 关地面水中多环芳烃污染现状研究报道逐渐增多。该领域的研究始于2 0 世纪8 0 年代初，当时有人在b o d 、c o d 综合指标描述地面水的有机物质污染水平的同 时，分析了地面水中的特殊有毒有机物的浓度水平。而我国在该领域的研究始 于2 0 世纪9 0 年代中期，并主要集中在大江、大河( 如长江、黄河) 水环境中 多环芳烃的监测评价，对地面水，特别是饮用水中的多环芳烃污染现状和风险 研究则较少。 12 第2 章l 虱内外研究结果综述 意大利某污水处理厂中检出多环芳烃总含量为1 1 2 0 4 6 2 0 n g l 【3 4 】。希腊某 两座城市污水处理厂出水中检出多环芳烃总含量为2 2 3 6 9 8 n l 【3 5 。熊毅等检 测出三峡库区6 个城市给水厂中多环芳烃总平含量从1 2 2 8 3 4 3 5 n g l 不等 3 6 1 。 彭华等分别在丰水期和桔水期对河南省主要城市饮水水源水中多环芳烃进行定 量分析，结果表明，探查1 8 个城市饮用水源水中多环芳烃的浓度范围为o3 5 9 9 3 n l 【3 “。朱利中等监测了1 9 9 9 2 0 0 2 年丰水期和枯水期杭州市地面水中1 0 种多环芳烃含量，结果表明，浓度范围为9 8 9 9 6 1 2 0 n 2 l 3 8 】。 2 3 样品前处理 样品前处理的一般要求是除去影响测定的干扰物、被测组分损失少、操作 简便、省时、成本低廉、对人体和环境无害。在现代环境痕量残留检测中， 提取、净化可一步完成，提取、净化的界限已十分模糊4 0 1 。一向十分费事的样 品预处理工作，正向着省时、省力、廉价、减少溶剂、减少对环境的污染、微 型化和自动化方向发展。 常用的样品富集方法有液液萃取( l l e ) 、索氏提取( s o x h e te x t r a c t i o n ) 、 固相萃取法( s p e ) 、固相微萃取法( s p m e ) 、基体固相分散萃取法( m s p d e ) 、 超临界流体萃取( s f e ) 、膜分离等。 液液萃取和索氏提取是两种经典的提取方法，这两种方法适用于大多数样 品，但由于这两种方法操作繁琐、费时、需耗费大量的溶剂、需进行进一步的 浓缩，因此逐渐被固相萃取法、膜分离、固相微萃取法等其他富集方法所取代。 固相萃取法是2 0 世纪7 0 年代初发展起来的样品前处理技术，是目前常用 的富集手段。它根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱 子后，样品中某一组分保留在柱中，通过再选择合适的溶剂把保留在柱中的组 分洗脱下来，从而达到分离、净化的目的。固相萃取法具有分离效率高、使用 方便、快速、重复性好、节省经费、安全等优点，因而得到了广泛应用”“。固 相萃取法为本论文所用前处理方法。 固相微萃取技术是种集萃取、浓缩、解吸、进样于体的样品前处理技 术。该技术以固相萃取为基础，保留了其全部优点，掘弃了需要柱填充物和使 】3 北象工业大学工学硕士学位论文 用有机溶剂进行解析的弊病。由于固相微萃取法具有样品用量少、对待测物的 选择性高、方便、快捷的优点，在有机化合物分析中应用广泛【4 2 】。 基体固相分散萃取法是一种在原有的固相萃取法的基础上改进的分离提纯 方法。这种方法样品用量少、耗时短、且节省溶剂 4 2 。 重组雌激素受体基因酵母法测定雌激素效应：此分析方法的前处理过程类 似于水中有机污染物的前处理。 多环芳烃：美国环保署对水体中多环芳烃的前处理有固相萃取和超临界流 体萃取两种规范方法【4 3 ，4 4 1 。水体中多环芳烃的样品前处理方法最常用的是固相 萃取( s p e ) 和固相微萃取( s p m e ) 【4 5 】。n i 衄a i e r 等在5 0 0 m l 水样中加入7 5 m l 的2 丙醇对8 种多环芳烃进行固相萃取，回收率高于7 5 【4 6 】。m a n i n e z 等人 用8 种不同的固相萃取剂对水体中1 6 种多环芳烃进行萃取比较，发现使用c 1 8 作为萃取相可以得到最高的回收率并且检出限为0 3 1 5 n g l 4 7 】。d o o n g 等使用 5 种s p m e 涂层分析水体中1 6 种多环芳烃表明， 8 5 “m 的聚丙烯酸酯( p ：a ) 和 1 0 0 m 的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 涂层对多环芳烃有很高的亲和力，并且p a 比p d m s 涂层更适合2 6 环的多环芳烃的测定，而对于6 环以上的多环芳烃的 分析，1 0 0 u m p d m s 富集效果更好【4 8 】。 2 4 样品测定 2 4 1 内分泌干扰效应测试 检测环境中内分泌干扰效应有化学检测和生物检测两种方法。化学检测能 准确检测各种环境介质中已知物质，环境部门对工业废水和城市污水的质量检 测还仅仅局限于有限化学浓度指标，由于有毒污染物为数众多，含量极低，不 可能对每一种污染物逐个进行化学分析。而生物检测方法可以检测环境中各种 物质的综合作用效应【4 叭。存在于环境中的内分泌干扰物浓度很低，直接监测往 往存在这样或那样的困难，因而需要寻求高效灵敏的间接监测方法 5 0 】。现有的 化学分析方法虽然能对环境或生物体内污染物含量进行定量描述，但仅凭含量 无法反映污染物对生物的效应。内分泌干扰物的种类繁多，化学结构差异较大， 难以从结构推测作用，就要从分子水平研究在不同污染物作用下生物体内各种 第2 苹圜内外硎冤结果综述 指标的变化【5 ”。具有内分泌干扰效应的环境化学品是最为常见也是研究最为深 入的内分泌干扰物，这些物质可与雌激素受体结合，作用于d n a 中的雌激素反 应元件激活基因的转录，然后产生内分泌干扰效应，内分泌干扰效应通过测定 内分泌干扰物活性来表达【5 2 】。应用体外测定环境雌激素与雌激素受体的特异亲 和力检测活性大小被美国环保署推荐作为内分泌干扰物初筛的方法【5 ”。 要评价某化合物的内分泌干扰效应，需考虑以下几方面因素m 55 j ：1 环境 化学物在环境中的暴露方式、降解和体内的代谢情况：2 环境化学物对靶细胞 的可得性以及与雌激素受体的亲和力；3 环境化学物在水相和脂相中的分配以 及在血循环中的运输情况；4 环境化学物对雌激素受体的激活能力：5 本身 固有的内分泌干扰效应。 目前评价内分泌干扰效应的几种方法几乎都是针对环境雌激素物质的【5 6 ： 2 4 1 1 在体子宫试验 子宫生长试验( u t e m sg r o 叭h t e s t ) 是最早建立的检测内分泌干扰效应的经 典方法。当外来化合物与雌激素受体( e r s ) 结合后，可使子宫的雌激素诱导蛋 白( i p s ) 含量增加，刺激子宫生长。因此测定动物子宫重量或计算其脏器系数， 可评价受试物的内分泌干扰效应及其强度57 1 。 常浩做整体动物试验表明五氯酚可干扰机体甲状腺素的正常功能，但对雌激 素和睾酮功能的影响并不明显。受体结合试验表明五氯酚能抑制酵母人孕酮受 体活性，抑制性激素和性激素受体的结合【5 8 】。 朱毅等利用体内大鼠子宫增重试验检测辛基酚的类雌激素活性显示大鼠子 宫湿重、子宫内皮细胞厚度、子宫腺数明显增加【5 9 。 g e l l e n 等用雌鼠做实验，用日剂量1 0 5 0 0 肛g 的滴滴涕注射处理幼鼠2 7 天， 发现在5 0 0 n d 组鼠阴道平均提前4 天开放，尸体解剖发现卵巢和子宫增重，同 对照组比较有显著差异 6 0 】。 在体子宫试验有如下优点 6 i 】： ( 1 ) 可以评价多种具有雌激素样作用的化合 物：( 2 ) 灵敏度高；( 3 ) 某些需在体内代谢活化才有雌激素样作用的化学物和中 间代谢产物可用本法评价；( 4 ) 较经济、方便、省时。但也有许多因素影响整体 动物试验【6 1 ，6 2 1 ，首先，动物对同一类雌激素的反应性个体差异很大，它受动物的 北京工业大学工学硕士学位论文 身体状况、年龄、品系等的影响。其次，试验受操作规范的影响。如处死动物， 取出子宫，吸干子宫表面液体，剔除附在子宫上的组织、脂肪，挤出子宫内液， 称重时间间隔等操作过程的人为差异均可影响子宫重量，从而影响试验结果。 再次，动物饲料中含有的雌激素样作用的植物及其副产品、农药和食品添加剂 也可影响评价结果。所以它不可能作为一种快速筛检方法实际应用。因此，需 要结合一种或多种可靠的快速短期鉴定雌激素能力的体外筛检方法 5 6 1 。 2 4 1 2 人类乳腺癌细胞培养 人类乳腺癌细胞m c f 一7 的雌激素受体e r s 受外界物质刺激后，可诱发胞 内反应，分泌一种分子量为5 3 千道尔顿( k d a ) 的外蛋白( e x o p r o t e i n ) 。该蛋 白的分泌受雌激素特异性调节，因此外蛋白的产生及其含量可用来判断受试物 是否具有内分泌干扰效应及其强度 6 3 。 马春艳等研究了双酚a 和1 7p 一雌二醇对人乳腺癌细胞m c f 7 增殖、细胞 周期以及核酸和蛋白合成的影响。结果表明：在3 1 0 。6 3 1 0 。8 m 0 1 l 范围内， 双酚a 和1 70 一雌二醇都能促进细胞增殖；在3 l o 1 4 m 0 1 l 时细胞增殖活性 达到最高值。统计结果表明双酚a 和1 7b 雌二醇对m c f 7 细胞生长特性的影 响有显著相似性1 6 “。 h a r r i s 等利用m c f 一7 细胞系研究二嗯英及其结构类似物对雌激素受体的 影响，认为在二嗯英及二嗯英类物质通过诱导基因表达而产生抗雌激素作用【6 ”。 c h a l o 坤k a 等在m c f 一7 乳腺癌细胞培养中，几种香烟成分一多环芳烃结合 于芳烃受体，降低了雌激素诱导的细胞增殖1 6 6 j 。 此评价方法优点为【6 l l ：( 1 ) 由于m c f 7 细胞及培养液中的血清都是人源性 的，因此其结果能可靠地预测类雌激素对人体健康的影响；( 2 ) 灵敏度高。培养 液中雌二醇浓度为3 1 0 。1 1 m 0 1 ，l 时，即能检测到其雌激素作用：( 3 ) 简单易行、 应用广泛，可以评价多种具有雌激素样作用的化学物。 2 4 1 3 肝细胞卵黄素( v t g ) 生成实验 卵黄素是由卵生脊椎动物肝细胞合成的一种复杂大分子蛋白，其合成依赖 于雌激素对肝细胞的刺激作用，因此v t g 的含量与雌激素作用有密切关系。根 据这一特性，检测雄性卵生脊椎动物肝细胞合成的v t g 可作为评价环境雌激素 第2 章国内外研究结果综述 作用的一个生物标志物，其含量可以反映外界物质的内分泌干扰效应强度怕“a 该法很灵敏，但由于v t g 在不同种属、不同品系动物中结构各异，使用放射免 疫法测定v t g 时需要制备不同的单克隆抗体和使用放射性，这就使该法很难被 推广使用【6 “。 p e l i s s e r o 利用培养雄性鲑鱼原代肝细胞检测不同浓度环境化学物的雌激素 样作用，用放射免疫法测定分泌入培养液中的v t g 浓度。评价了鸡豆黄素、黄 豆苷、染料木黄酮等的雄激素样作用，它们比雌二醇诱导的v t g 合成低1 0 0 0 2 0 0 0 倍【6 8 。 胡建英等对北京排污河天津段的野生和养殖鲫鱼血浆中的v t g 进行检测。 在捕获的1 2 尾野生鲫鱼中，都检测出了v t g ，浓度范围为o 2 8 4 5 9 7 1 m g m l ； 对同期捕获的3 5 尾天津养殖鱼包括l 尾雄性鲫鱼中的v t g 也进行了检测，浓 度范围为o 0 11 9 o 2 5 0 m m l 。而同期在实验室饲养的雌雄鲫鱼血浆中，均未 检出v t g 。结果表明，北京排污河天津段的野生鲫鱼受到了类雌激素物质的污 染【4 9 1 。 2 4 1 4 受体竞争。陛结合测定 该方法从受体水平来直接判断某物质的雌激素样作用。与雌激素结构相似 的化合物可与雌激素竞争e r s ，导致与e r s 结合的雌激素下降。用放射性物质 标记雌激素，与待测物共同孵育，测定受体复合物的放射活性即可推算出待测 物与e r s 的结合常数( k a ) ，根据受试物的结合常数可评价该物质雌激素活性的 强弱6 2 ，6 7 1 。 l u t z i 等利用蟾蜍的肝细胞进行研究，用已知类激素物质同放射性3 h 标 记的雌二醇的竞争性替换实验来估计评价物质的雌激素效应的等级。结果显示 各化合物内分泌干扰效应为雌二醇 四氯联苯 邻苯二甲酸二己酯 双酚a 壬基酚3 一t 一丁基一4 一羟苯甲醚4 一辛基酚 4 ，4 滴滴涕【6 9 】。 此方法可以测纯的物质或混合物所具有的潜在雌激素活性。而且利用其对 雌二醇的竞争性替换试验可以测出各种物质的类雌激素等级。利用分离的受体， 可以检测有细胞毒性的物质，得出细胞培养方法所不能测的物质的潜在类雌激 素能力。但其操作步骤繁琐，在一般实验室不易进行，而且使用放射性物质， 北京工业大学工学硕士学位论文 容易造成放射性污染。测定结果只能代表配体与受体的亲和力，而不能准确表 示配体的雌激素活性。因为有的化合物虽然与受体有很高的亲和力，却并没有 相应的雌激素活性，如抗雌激素化合物三苯氯胺6 7 1 。 2 4 1 5 乳铁蛋白m r n a 法 具有雌激素效应的化学物能使2 1 日龄小鼠子宫的乳铁蛋白m r n a 水平升 高几百倍，虽然乳铁蛋白生理作用还不清楚，但己将它用作雌激素对子宫作用 的指标【6 7 】。 2 4 1 6 荧光偏振实验 荧光性雌激素( f e s l ) 与e r s 结合后，分子体积增加，翻转速度减慢，因此， 具有较高的偏振性和向异性。当加入可与e r s 竞争性结合的化合物时，f e s l 被替换呈游离态，翻转速度快，偏振性下降，根据偏振值可判断加入受试物与 e r s 结合力的大小及其雌激素活性【6 2 】。 利用荧光偏振实验( f d ) 可进行大规模的雌激素活性物质的快速筛选，该方 法具有明显的优点【6 2 】：( 1 ) 不需要放射物质，避免放射性危害；( 2 ) 在室温条 件下进行，能更好地反映出待测物在常温下的雌激素活性；( 3 ) 可以直接进行 结合型和游离型e r s 测定，避免了将两者分离的繁琐步骤和人为损失；( 4 ) 样 品可进行再测定，不浪费样品和e r s 。但由于f d 法对e r s 纯度要求较高，而 且价格昂贵，因此尚未被广泛采用。对于自然界中具有自发荧光的物质，f d 法 的敏感性降低。 2 4 1 7 重组雌激素受体基因酵母检测法 重组受体基因和报道基因的酵母测定化学品内分泌干扰效应的原理是酵母 中的雌激素受体基因被雌激素活性物质激活，从而在蛋白质转录和合成过程中， 报道基因也同时被激活，转录成0 半乳糖苷酶，通过测定b 一半乳糖苷酶的 活性就可定量检测出暴露化学品的类雌激素活性【7 0 7 “。张庆华等采用9 6 孔培养 板替代三角锥瓶对此法进行了改进，改进后的方法更加简便，节省了大量试 剂。 吴文忠等介绍了利用重组基因酵母细胞检测内分泌干扰物的生物测定方 法，结果表明，此法对雌激素类化合物有较高的灵敏度。研究测定了污泥、底 第2 章国内外研究结果练述 泥、土壤和烟尘等各种样品的粗提取物的雌激素活性，以及各样品不同分离馏 分中的内分泌干扰效应。结果发现，污泥和烟尘中有较强的内分泌干扰效应【7 ”。 王敬贤等采用重组基因酵母法测定了烟尘和烟气中内分泌干扰效应1 7 。 当存在不同极性内分泌干扰物时，某种极性内分泌干扰物可能加强另一种 极性内分泌干扰物的内分泌干