杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT课件.ppt

,单克隆抗体的杂交瘤制备,单克隆抗体（McAb）：经过免疫的哺乳动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，这种具有特异性的、同质性的抗体，称为单克隆抗体。特点：理化性状高度均一效价高只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一具有高度特异性又易于大量制备,理想的抗体分泌细胞：具有合成和分泌抗体的能力具有大量无限生长的特性,利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。,杂交瘤技术的基本原理,杂交瘤技术的基本原理,处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞或浆母细胞动物：612周龄20g25g体重,免疫脾细胞,对骨髓瘤细胞的要求：（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。）（2）选择HGPRT株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。）(3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。,2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择,1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般在10%20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形式生长繁殖，直接用吸管吹打即可使细胞分散，每35天传代一次。（一般扩大培养以1:10稀释传代。）,骨髓瘤细胞的培养,HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,HAT选择培养基的原理,杂交瘤细胞的选择性培养,细胞DNA合成途经：,1.正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA(可被A-氨基蝶呤阻断)2、补救途径：核苷酸前体核苷酸DNA（需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶-HGPRT和胸腺嘧啶核苷激酶-TK两种酶的参与）,HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT和TK缺乏，DNA合成的替代途径受阻融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基上存活和繁殖。,细胞融合剂：PEG（聚乙二醇）:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果,细胞融合,细胞融合的步骤,(1)将1ml40的PEG液，逐滴加入细胞团中，在60秒内加完，同时不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50l；(7)送入5CO2培养箱，37培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。后每隔23天半量换HAT一次；36天后出现杂交细胞集落。,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是从细胞群体中选育出遗传稳定的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，淘汰非特异性的，或遗传不稳定的杂交瘤细胞。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次,阳性杂交瘤细胞的克隆化培养,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩