（材料学专业论文）大分子印迹交联聚乙烯基吡咯烷酮微球的制备与特性研究.pdf

摘要 以n 乙烯基吡咯烷酮( n v p ) 为单体，羟乙基纤维素( h e c ) 为分散剂， n ，n 亚甲基双丙烯酰胺( b i s a m ) 为交联剂，过氧化苯甲酰二甲基苯胺 ( b p o d m a ) 为引发剂，牛血清蛋白( b s a ) 为模板，采用低温悬浮聚合方法， 制备了平均粒径为2 0 0 9 m 的牛血清蛋白大分子印迹交联聚乙烯基吡咯烷酮微球 ( b s a - i m s ) 。讨论了影响b s a l m s 粒径大小、分布和形态的各种因素：水油比、 分散剂的种类及加入量、搅拌速度、引发剂的用量及加入方式、反应温度等。 b s a i m s 的重结合行为测试结果表明，对牛血清蛋白有较好的特异选择性能，吸 附平衡时的印迹效率( i e ) 可达到3 2 5 。反应温度、b s a 中加入盐的浓度、b s a 溶液p h 值、凝胶微球中模板的洗脱方式对b s a i m s 的吸附量和印迹效率都有不 同程度的影响。反应温度会影响微球的形态进而问接影响吸附性能，随着反应温 度的升高印迹效率稍有下降；b s a 溶液中盐浓度达到某一值时，b s a 1 m s 的吸附 量出现了极大值，而印迹效率呈现出逐渐下降的趋势；b s a 溶液的p h 值越低， b s a i m s 的吸附量也越大，但印迹效率逐渐降低；模板的洗脱方式对b s a i m s 的 吸附量也有很大影响，用含1 0 s d s 的1 0 乙酸( v ) 水溶液洗脱液对b s a i m s 进行洗脱，b s a i m s 体现出了较高的吸附量和印迹效率。 关键词：大分子印迹；分子印迹交联聚乙烯基吡咯烷酮微球；低温悬浮聚合；牛 血清蛋白；重结合；平衡吸附量；印迹效率 a b s t r a c t u s i n gn v i n y l p y r r o l i d o n e ( n v p ) a st h ef u n c t i o n a lm o n o m e r , n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e ( b i s a m ) a sc r o s s l i n k e r , b e n z o y lp e r o x i d e a m i n e ( b p o d m a ) a st h e r e d o xi n i t i a t o rs y s t e ma n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a st e m p l a t e ，v i as u s p e n s i o n p o l y m e r i z a t i o n ，w ep r e p a r e dp r o t e i n - i m p r i n t e dc r o s s l i n k e dp o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( p v p ) h y d r o g e lm i c r o s p h e r e sa n dw i t ht h ed i a m e t e ro ft h em i c r o s p h e r e sb e i n g2 0 0 p m t h ee f f e c t so ft h er a t i ob e t w e e nt h ec o n t i n u o u sp h a s ea n dt h ed i s p e r s ep h a s e ，t h e s t i r i n gs p e e d ，t h ek i n da n dq u a n t i t yo ft h es t a b i l i z e r s ，t h ep o l y m e r i z a t i o nt e m p e r a t u r e o nt h es i z e ，s i z ed i s t r i b u t i o na n dm o r p h o l o g yo ft h ec r o s s l i n k e dp v p m i c r o s p h e r e si n t h ep r o c e s so fp o l y m e r i z a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d t h ea d s o r p t i o na n dr e c o g n i t i o np r o p e r t i e so ft h em i c r o s p h e r e sw e r es t u d i e d ，a s w e l la st h ei m p r i n t i n gm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d t h es e l e c t i v i t yt e s to fi m p r i n t e d m i c r o s p h e r e ss h o w e dt h a tt h ei m p r i n t e dm i c r o s p h e r e se x h i b i t e dg o o dr e c o g n i t i o nf o r b s a t h ea d s o r p t i o nc a p a c i t yo fb s a i m p r i n t e dm i c r o s p h e r e sw a s3 2 5t i m e sm o r e t h a nt h a to fn o n i m p r i n t e dm i c r o s p h e r e s i tw a sc o n s i d e r e dt h a tt h ef o 加a t i o n o f m u l t i p l eh y d r o g e nb o n d sa n dc o m p l e m e n t a r ys h a p eb e t w e e nt h ei m p r i n t i n gc a v i t i e s a n dt h et e m p l a t ep r o t e i n sw e r et h et w of a c t o r st h a tl e dt ot h ei m p r i n t i n ge f f e c t t h ep ho fb s a s o l u t i o n ，t h ei o n i cs t r e n g t h ，t h er e m o v i n gm e t h o d s ，t h ei n i t i a l b s ac o n c e n t r a t i o na n dt h ep o l y m e r i z a t i o nt e m p e r a t u r ea l l d e e p l yi n f l u e n c e dt h e a d s o r p t i o nc a p a c i t ya n dt h ei m p r i n t i n ge f f i c i e n c y ( i e ) o ft h eb s a i m s a d d i n g n a 2 h p 0 4t ob s as o l u t i o n ，b o t ho ft h eb s a i m sa n dn o n i m s e q u i l i b r i u m a b s o r p t i o nc a p a c i t i e sa l li n c r e a s e da n dt h e r ew a sap e a kv a l u ea s n a 2 h p 0 4 c o n c e n t r a t i o ni nt h eb s as o l u t i o ng o tt oac e r t a i nv a l u e ，b u tt h ei ew a sg r a d u a l l y d e c r e a s e d a st h eb s as o l u t i o np hi n c r e a s e d , t h ee q u i l i b r i u ma b s o r p t i o nc a p a c i t yo f t h em i c r o s p h e r e sd e c r e a s e d g r a d u a l l y w i t h t h ep o l y m e r i z a t i o nt e m p e r a t u r e i n c r e a s i n gb o t ht h ea d s o r p t i o nc a p a c i t ya n dt h ei m p r i n t i n ge f f i c i e n c yd i m i n i s h e d b o t ht h ea d s o r p t i o n c a p a c i t y a n dt h e i m p r i n t i n ge f f i c i e n c y w e r el a g e r u s i n g 10 0 h a cs o l u t i o ni n c l u d i n g1 0 s d s ( w n ) a st h er e m o v i n gs o l u t i o nt h a nt h a t u s i n g0 0 5 m o l lt r i ss o l u t i o ni n c l u d i n g1 o c a c l 2 k e y w o r d s ：m c r o m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ；m c r o m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dc r o s s l i n k e d p v pm i c r o s p h e r e s ；l o wt e m p e r a t u r es u s p e n s i o np o l y m e r i z a t i o n ；b s a ；r e b i n d i n g ；t h e e q u i l i b r i u ma b s o r p t i o nc a p a c i t y ；i m p r i n t i n ge f f i c i e n c y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 一签锯肜牛一期7 年尸日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘盗盘茔有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位敝作者签名力够牛 签字日期：弘力7 年f 月f 矿日 导师签名： 月 第一亭绪论 第一章绪论 1 1 分子印迹技术与分子印迹聚合物 1 1 1 引言 分子识别和专一性结合是自然界普遍存在的现象：例如广泛存在于不同的生物 大分子之间：抗原与抗体之间，蛋白质类激素、植物凝集素、外源凝集素或药物与受 体之间，蛋白酶与蛋白质底物之间等，是从分子水平研究生物现象的莆要化学概念， 已成为当今生物学研究的热点课题之一【1 。6 1 。 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ) 是从仿生角度，采用人工方法 制备对特定分子( 模板分子) 具有专一性结合作用的聚合物的技术1 7 - 1 0 】，这种聚合 物被称为分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) ，已在分离提纯 1 1 - 1 4 、免疫分析1 6 】、酶模拟1 1 7 1 以及生物模拟传感器1 1 8 - 2 1 1 等方面显示出广泛的应用 前景，成为新世纪最具潜力的新材料之一1 2 2 1 ，m i p s 也冈此被誉为“万能的分子识别 材料”。 分子印迹材料和技术的思想起源 2 3 , 2 4 可以追溯到1 9 3 0 s 的p o l y a k o v 研究组采用 硅胶制备了分子印迹材料，以及f i s c h e r 的“锁和钥匙”、p a u l i n g 的“抗原一抗体” 以及d i c k e y 的“专一性吸附”的概念。现代分子印迹聚合物技术的建立应归功于 w u l f f 【2 5 。6 1 和m o s b a c h t 3 7 - 4 3 1 ，他们开创性的工作使得分子印迹聚合物及技术得到了突 飞猛进的发展，并在世界范围内掀起了研究热潮。目前，全世界有十几个国家上百 个学术和研究机构正在从事分子印迹聚合物的研究及开发工作，发表的论文和申请 的专利数目也与日剧增。 m i p s 之所以发展如此迅速，主要是因为它有三大特点【2 4 刖】：预定性 ( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、识别性( r e c o g n i t i o n ) 和实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。预定性决定 了人们可以根据不同的目的制备不同的m i p s ，以满足各种不同的需要；识别性是凶 为m i p s 是按照模板分子( t e m p l a t em o l e c u l e ) 定做的，它具有特殊的分子结构和官 能团，能选择性地识别模板分子；其实用性表现在它与天然的生物分子识别系统如 酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的 稳定性和长的使用寿命，且制备过程较简单。 2 分子印迹识别原理 分子印迹聚合物的制备一般包括如下三个过程1 2 7 4 2 部l ：( 1 ) 使模板分子与功能 单体之间通过共价键( c o v a l e n t ) 或非其价( n o n c o v a l e n t ) 作用结合，形成土客体 配合物( h o s t - g u e s tc o m p l e x ) ：( 2 ) 加入交联单体( c r o s s - l i n k e r ) ，在引发剂、热或 光引发下，往摸板分子功能单体配合物周闹产生聚合反麻聚合物链通过自由基浆 台将模板分子和单体的配合物“捕获”到聚台物的立体结构r 卜：( 3 ) 将聚台物巾的模 板分子洗脱( e l u t i o n ) 或解离( d i s s o c i a t i o n ) 山来，在聚台物巾便留下可识别模板 分子的“印迹孔穴”。其基本原理如图1 1 所示m i 。 气f 簿避园 d 芸园 幽l - 1 分子印迹的犟本原理意图。叫 f i 9 1 - 1s c h e m t i cd i a g r , u no r m 。p r i n c i p l eo f m o l e c u l a r i m p r i n t j n 一” 1 i3 分子印迹聚合物与模板分子的结合作用 分子印迹罪台物与模板分子之问的结合作用主要是孔穴内圊定排列的结合基团 与模板分子问的相互作用。在制备分子印迹聚台物的过程巾，对结合基团有以下几 个要求：第一，模板分子与圭卉台基团问要有足够强的键合作用，以便在聚合过程中 把模板分子牢周地固定住，在交联时把结合基团按确定的空日j 位置同定排列。第二， 生成聚合物后，模板分子要尽可能地完全除去，渊为残留的模扳分子会降低m i p s 的使用效率。第三，结合基团与模板分子的相互作用要尽可能地佻以便用于快速 色谱分离和催化；l 剧时还要其有很好的可逆性这样才能多次反复使用。对于第 嚣垒 第一章绪论 一种要求，希望结合作用有较高的活化能，可是对后两个要求，则希望有较低的活 化能。因而，实际选材中要从这两方面综合考虑。 结合基团和模板分子之间的结合作用 2 7 , 4 7 - 6 1 1 主要有：( 1 ) 共价键；( 2 ) 兀- 兀键作 用；( 3 ) 氢键；( 4 ) 疏水范德华力作用；( 5 ) ( 过渡) 金属配基结合作用；( 6 ) 冠 醚与离子作用；( 7 ) 离子键。 借助共价结合作用和金属络合作用可在聚合物中获得空间精确固定的结合基 团，对模板分子的选择性较好。如果模板分子能比较完全地除去，这两种结合方式 就占有优势。非共价结合作用在聚合物反应中则要求有过量( 至少4 倍以上) 的结 合基团，因而有相当多的结合基团是无规分布的。在这种情况下模板分子一般很容 易除去，原则上这种聚合物与底物的可逆性结合作用也快。 不| 一结合类型的结合专一性也是不一样的。共价键的限制性最强，它只对专门 的功能基团有专一的结合作用，而离子键和疏水作用可对大范同的化合物有作用， 冈而他们的专一性较差。共价键一般有较强的方向性，而离子键和疏水作用则小得 多。因此共价结合的方法应能产生专一性最好的m i p s 。但其结合不可逆，且结合速 度较慢，这在实际应用中，特别是快速结合过程( 如色谱) 是难以接受的。而离子 键和疏水作用则是极为快速的。利用7 c 讯键作用和氢键作用( 它们总有一定的方向 性) 在许多情况下是一个较好的折衷方案。 模板分子的结构和印迹环境决定了印迹中哪种作用最有利。如果要制备用于分 析作用的色谱材料，一般优先考虑非共价键作用，因为该作用的结合速度较快，但 过量的结合基团对分离过程有不利的影响。而对催化方面的应用来说，结合基团的 方向和孔穴中起催化作用的活性基团更为晕要，此时共价结合作用就较为有利。 1 1 4 分子印迹聚合物识别性能的表征 分子印迹聚合物性能的表征到目前还没有一个统一的理论描述，主要原因是凶 为分子印迹聚合物的应用范围很广泛，在不同的应用领域，可以有不同的表征方法， 例如在色谱固定相1 6 2 1 、手性分离1 6 3 】和同相萃取【删应用中，一般用分离系数a 、分离 度黜、保留时间t r 、结合常数k a 、富集系数等来表征m i p s 的选择性的好坏。采用 的仪器方法有高效液相色谱( h p l c ) 、质谱( m s ) 、核磁共振波谱( n m r ) 、傅立 叶变换红外光谱( f t i r ) 和紫外光谱( u v ) 等；而在化学传感器的应用中，则需 要借用各种电化学参数如电流、电容、电导、电压以及各种光学参数和质量参数如 光强度和质量等来表征。在催化应用领域r f l 则以催化效率、反应速度、结合量等参 数来描述分子印迹聚合物的催化活性。 第一章绪论 1 1 5 分子印迹聚合物的应用 典型的源于合成聚合物的 v i i p s 具有制作简单、成本低廉、功能可设计、坚同 耐用且适用范围广等优点，因而被誉为“万能的分子识别材料”。过去一段时期， m i p s 的应用研究主要集中在亲和分离、抗体结合模拟、酶模拟以及生物模拟传感器 上。但最近两年来，科学家们已开始探索m i p s 的一些新的应用领域。其中在痕量 物质的富集、反应过程平衡转移的控制、反应产物的提纯、组合化学库的筛选、反 应催化和免疫测定( i m m u n o a s s a y ) 等方面已取得了一定的进步。 1 2 蛋白质分子印迹聚合物 1 2 1 蛋白质基本特性6 5 6 7 】 1 2 1 1 蛋白质的基本组成单位 蛋白质分子基本结构单位是氨基酸。其结构可用图1 2 表示。 r 基团通常是氨基酸的侧链。在中性p h 值的溶液中氨基酸主要是偶极离子( 或 两性离子) ，而不是未电离的分子。在氨基酸的偶极形式中，氨基酸被质子化( n h 3 + ) ， 羧基离解成( - c o o 。) ，氨基酸的电离状态随p h 值而改变。在酸性溶液中，羧基不电 离，而氨基电离；在碱性溶液中，羧基离解，而氨基不解离。 h r c c 0 0 一 n h 产 图l 一2 氨基酸的化学结构式 f i g 1 - 2s t m c t u r a lf o r m u l a so fa m i n oa c i d 氨基酸中的q 碳原子周围的4 个不同的基团按照四面体排布，使氨基酸取得旋 光性。两个互为镜象的形式称为l 一异构体和d 异构体。只有l 氨基酸参与蛋白质 的组成。一般在讲到蛋白质时指的都是l 异构体，除非另有说明。 从细菌到人类的所有物种中，一切蛋白质都是由2 0 种氨基酸构成的。这2 0 种 氨基酸其侧链在大小、形状、电荷、形成氧键能力和化学活性方面都存在差异。蛋 4 第一章绪论 白质实现的功能范围所以如此之广，就是由于这2 0 种氨基酸的差异，以及它们各种 组合变化的结果。 1 2 1 2 多肽链 h n 一 娼+ 懈s 一+ r 1 ： 他芏一寻i锵il l i r l h 3 丫一气弋带彳一 h 、，、h i 矗2 矿o c+ h 。0 o 一 。 图卜3 一个肽键的形成 f i g 1 - 3t h ef o r m a t i o no f p e p t i d e 蛋白质合成时，一个氨基酸a 羧基和另一个氨基酸的c 【氨基连接起来形成的酰 胺键通常称为肽键。很多个氨基酸由肽链相连形成一个多肽链，它是一个没有分支 的结构，在多肽链中一个氨基酸单位称为一个残基。蛋白质具有由基冈规定的氨基 酸顺序。在1 9 6 0 年前后进行的一系列深入的研究指明，蛋白质的氨基酸序列是由遗 传决定的，基因编码各种蛋白质巾氨基酸的排列顺序。 两个氨基酸缩去一个水分子后生成一个二肽的情况示于图1 3 。 通过一系列实验人们得到了分子生物学的一个中心原理：序列规定构象，即规 定蛋白质复杂的三维结构所需要的信息包含在它的氨基酸序列中。 1 2 1 3 蛋白质的结构层次 如图i - 4 表示蛋白质结构的六种水平。图中a 代表组成一级结构的各种氨基酸； s 和s s 分别代表蛋白质中的二级结构和由它们组合成的超三级结构；d 厂r 表示蛋白 质的结构域，如果是单结构域的蛋白质，此结构域即蛋白质的三级结构；同样，t i m 表示由结构域构成的蛋白质的三级结构或n 矿基；q 代表蛋白质的四级结构，可以是 n 个相同亚基装配成的同源聚集体，也可以是1 1 个亚基和m 个1 3 亚基( 甚至更 多种、l e 基) 形成的异源聚集体。 p d h 0 i 一圃 第一章绪论 q ( 4 a 搴 图卜4 蛋白质结构层次及其关系的示意图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cd i a g r a mo fp r o t e i ns t r u c t u r e 三短结约亚薹 蛋白质的一级结构一般是指构成蛋白质肽链的氨基酸残基的排列顺序，有时也 称为残基的序列。这一定义对只含氨基酸的简单蛋白是适用的。但是在生物体内还 有很多复合蛋白，它们除了氨基酸外，还有其他的组成。对复合蛋白，完整的一级 结构概念应该包括肽链以外的其他成分( 例如糖蛋白上的糖链，脂蛋白r f l 的脂质部分 等) 以及这些非肽链部分是以何种方式，接在肽链巾哪些残基上。蛋白质的一级结构 是一个无空间概念的一维结构。 蛋白质肽链中局部肽段骨架形成的构象，被称为二级结构。蛋白质的二级结构 有不同的类型，包括0 【螺旋、b 折叠、转角、环形和任意性较大的卷曲。这些二二级 结构按其规则的程度可以归纳为3 类：a 螺旋和p 折叠是具有严格规则的一类；任 意性较大的卷曲当然是没有规则的一类；转角和环形则是介乎两者之问的第三类。 在一个蛋白质的肽链中，不是所有的肽段都是有规则的二级结构。一个蛋白质的构 象，即肽链中的规则的二级结构和其他无规则的肽段一起，构成的完整立体结构则 是蛋白质的三级结构。就这点而言，蛋白质的二级结构是构成蛋白质三级结构的部 件。一条肽链或少数几条肽链通过共价键构成的蛋白质立体结构通常是指它们的二 级和三级结构。 在二级结构和三级结构之间，还存在一些已被公认的过渡的结构层次。一个是 超二级结构，另一个是结构域。在蛋白质结构中，常常发现两个或几个二级结构单 元被多肽连接起来，进一步组合成有特殊的几何排列的局域空间结构，这些局域空 6 p 晴 l 口 眦 一，s m 第一章绪论 间结构称为超二级结构( s u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ) 或简称m o t i f 结构域的概念由p o r t e r 提出于2 0 世纪6 0 年代后期到7 0 年代初期，可理解为蛋白质中构象单元组成的一些 实体，它们有一定的三级结构，而且往往还具有特别的，但还不完全的生物活性。 蛋白质的四级结构可以定义为一些特别三级结构的肽链通过非共价键而形成的 大分子体系时的组合方式。作为蛋白质四级结构组分的肽链被定义为亚基，也有人 称为亚单位。在亚基问并不存在共价键，亚基问的相互作用都是非共价键。 1 2 1 4 蛋白质之间的识别作用 在不同的生物大分子之间，普遍存在着一种专一性结合现象。例如：抗原与抗 体的专一结合，蛋白质类激素、植物凝集素、外源凝集素或药物与受体的专一结合， 蛋白酶与蛋白质底物的专一结合等。生物大分子之间的这种专一性结合，称为分子 识别。分子识别是通过两种蛋白质分子各自的结合部位来实现的。要实现分子识别， 就必须具备下列两个条件： ( 1 ) 在两种蛋白质分子的结合部位之间，其微区构象要能够相嵌互补，形成相当 大的接触面积，或者经过构象变化达到这一日的； ( 2 ) 两个结合部位各有相应的化学基团，相互之间能产生足够的结合力，使两种 蛋白质分子结合起来。 抗体分子的抗原结合部位与抗原分子的抗原决定簇之问，其空间互补性是抗原 与抗体专一性结合的结构基础。抗原决定簇于抗原结合部位空间上如果能够互补， 二者的基团分布能彼此配合。即带正电荷的基团与带负电荷的基团对应分布，形成 离子键；质子供体与质子受体对应分布，形成氧键；一个偶极子的正电荷重心与另 一个偶极子的负电荷晕心对应分布，形成范德华力；一个非极性基团与另一个非极 性基团对应分布，形成疏水作用。如果抗原决定簇的形状改变，但其基团形状分布 没有改变，就不能形成足够强的结合力；同样如果互补性很好，但是基团改变，彼 此不能吸引，甚至互相排斥，i 司样不能形成专一结合。我们在设计蛋白质分子印迹 聚合物借鉴抗原与抗体的结合机理。 1 2 1 5 蛋白质的变性作用 天然蛋白质冈受化学或物理凶素的影响，其分子内部原有的高度规则性的排列 发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，这种作用称为蛋白质的变性作用。 天然蛋白质分子是由肽链所组成，分子的规则性紧密结构是由分子中的次级键维持 7 第一章绪论 的，所以很容易被物理和化学力量所破坏。变性作用是天然蛋白质分子组织的松解， 也就是从有规则的紧密结构变为开链的不规则和敞漫的形式。用近代蛋白质术语来 说，蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规则性紧密排列方式( 包括螺旋 肽链的折迭卷曲) 因氧键及其它次级键的被破坏而变为不规则的松散排列方式( 包括 肽键的伸展) 。使天然蛋白质变性的因素很多，热( 6 0 7 0 c ) 、酸、碱、有机溶剂( 如 乙醇、丙酮等) 、光( x 光、紫外线、甚至在有光敏剂存在下的可见光) 、尿素浓溶液、 盐酸胍、水杨酸负离子、某些去垢剂( 如十二烷基硫酸钠) 、高压、剧烈振荡及表面 张力等均可引起蛋白质的变性。 1 2 2 蛋白质分子印迹聚合物的制备 1 2 2 1 蛋白质分子印迹的特点和难点 由于蛋白质分子体积庞大、本质脆弱、空间结构和化学性质十分复杂，所以对 蛋白质分子印迹的研究思路和试验手段都还处于摸索阶段，试验结果的苇现性差， 水环境的识别机理也不清楚。当前蛋白质m i p s 的制备主要受以下因素的影响【6 8 1 。 空间因素 体积庞大的蛋白质模板难以自由出入聚合物母体，需要设计具有合适交联孔结 构的m i p s 使之适合庞大的蛋白质分子的传质。 热力学因素 处于热力学上的考虑，为了准确地“记忆”印迹分子的形状，所选的印迹分子 必须具有一定的刚性，其在印迹过程中的构象形式应尽量保持不变或变化较小，这 对于形成具有良好识别能力的作用位点是十分重要的【6 9 】；单从这一点上看，与结构 刚性的有机小分子相比，水溶性的蛋白质分子具有明显的不足，其柔软的结构和多 变的构象对聚合过程提出了苛刻的要求。一方面，蛋白质分子构象在不同的环境下 的可变性，使在分子印迹聚合物中很难产生确定的识别位点；另一方面，通常烯类 单体在打开双键时所释放的大量反应热，将会直接破坏蛋白质分子的三维结构和稳 定性。 溶解度上的要求 聚合前的预组装过程要求印迹分子和功能单体之间要有充分的接触机会和作用 环境，以便各相关基团能为将来的特定识别作用取得必要的空问排列和组合方式， 因此要求印迹分子在单体和交联剂中或是包含单体和交联剂的溶剂体系中具有一定 的溶解度；而众所周知，在常见的各种用于聚合的烯类单体巾，可供挑选的能与水 第一章绪论 溶性的生物大分子具有良好互溶效果的单体不多，而可供选择的交联剂则更少。凶 此，寻找或是合成与水溶性生物大分子具有良好互溶效果的单体和交联剂是制备理 想印迹聚合物材料的一个基本前提。 作用环境对识别效果的影响 由于生物体内高度特异性分子识别作用大多是在水介质巾进行的，因此水环境 中的分子识别作用一直是各相关领域的热门研究课题，但是，由于影响识别作用的 因素数目众多且互相牵连，致使对该问题的深入研究相当困难。因此，如何在没有 成熟理论或是大量经验数据支持的情况下，有效地实现水环境下的蛋白质分子与印 迹聚合物之间的特异识别作用，规避不利因素的影响，设计合理的聚合物结构，营 造有利于识别作用发挥的局部微环境，是摆在蛋白质分子印迹研究前面的一个十分 莺要的问题。 氢键作用的发挥 在采用弱相互作用方式的几种识别模式中，氢键扮演着十分重要的角色。与静 电相互作用、v a nd e rw a a l s 力和疏水作用相比，由于具有一定的方向性，氢键的识 别选择性要明显地高于前三者。因此，如何协调几种非共价键作用模式，充分发挥 氢键所具有的分子识别能力，是值得深入研究的课题。事实上，自然界中高度有序 的d n a 三维结构，就是氢键作用向人们所展示的一个杰作。但是，对绝大多数的人 工合成识别材料来说，当分子识别的环境在水介质中，由于水分子的强大水合能力， 氢键在水环境巾的作用通常会被大大削弱。根据文献，如果要想加强水环境中氧键 的效能，通常有两个方法可以采用【7 0 】。一是通过协同作用来克服周围水分子的不利 影响，二是改变作用点附近的局部微环境，以创造出一个利于氢键发挥其作用的外 部环境。 1 2 2 2 蛋白质分子印迹的策略 尽管蛋白质的印迹非常因难，但迄今为止人们仍对蛋白质印迹进行了有益的尝 试。总结起来，采用的主要印迹策略有【7 l 】： ( 1 ) 通过功能单体与蛋白质分子某些基团较强的作用力进行印迹和识别，主要的 作用力有金属一螯合作用或强的静电力； ( 2 ) 通过印迹孔穴与蛋白质分子的形状互补和形成多点弱作用力来进行识别，这 些多点作用主要为氢键、范德华力或疏水作用等； ( 3 ) 根据抗体抗原结合原理，通过印迹蛋白质的部分片段来识别整个蛋白质。 我们认为，其中只有( 2 ) 为严格意义上的分子印迹。 9 第一章绪论 1 2 2 3 蛋白质印迹的功能单体和交联剂 功能单体和交联剂聚合后构成印迹聚合物网络的骨架。对于蛋白质大分子的印 迹目前经常采用的功能单体有3 氨基丙基三乙氧基硅烷、丙烯酰胺和丙烯酸的衍生 物等，而根据选用的功能单体可采用不同的交联剂，如四乙基硅酸盐、n ，n 亚甲基 双丙烯酰胺和n ，n 1 2 羟基亚甲基双丙烯酰胺等。丙烯酰胺是色谱和电泳中常用的 惰性凝胶单体，来源方便，适于生物物质的分离纯化。它拥有的酰胺官能团即使在 极性溶剂中也可形成较强的氢键，另外，和羧酸基团不同，在水溶液中酰胺基团不 会离子化。以蛋白质为模板分子时，蛋白质中的肽键和酰胺基团可形成较强的作用 力。因此丙烯酰胺及其衍生物作为蛋白质分子印迹的单体具有良好的发展潜力。 此外天然聚合物如蛋白质也可作为基质对其它分子进行印迹。d a b a l i s 等人就研 究了蛋白质及其它大分子物质作为印迹材料的情况，并以牛血清白蛋白对苹果酸进 行印迹，得到了在乙酸乙酯中具有特异亲和性的蛋白聚合物。一些天然的多糖物质 如壳聚糖也被用作蛋白质印迹的基质，制成的血红蛋白印迹聚合物具有特异性识别 能力。但一些天然的中性多糖作为生物大分子印迹的介质可能并不理想，如琼脂糖 的印迹聚合物没有很好的识别效果。 用多种单体、交联剂及交联方式来印迹蛋白质可能是一种很有前景的方法、聚 合物可以增加识别作用力的种类，从而可以提高对印迹分子的选择性。 w u l l f 认为一种理想的分子印迹聚合物应具以下性质：( 1 ) 聚合物的结构应具有 一定的刚性以确保印迹孔穴的空间构型和互补官能团的位置；( 2 ) 其空间结构具有一 定的柔韧性以确保亲和动力学能尽快达到平衡；( 3 ) 亲和位点的可接近性；( 4 ) 机械稳 定性，以便m i p s 可以在高压下应用；( 5 ) 热稳定性。 但与小分子印迹不同的是，对于蛋白质印迹聚合物的功能单体与交联剂的选择 以及聚合的条件还要充分考虑到蛋白质的特殊性，应保证聚合后蛋白质的生物活性 和空间构象。蛋白质表面存在的众多类型的结合位点使得一般的聚合物容易产生非 特异性的吸附。此外其巨大的体积使得其在聚合物中的传质和洗脱都存在一定的难 度，因此对聚合物孔径的要求也比对小分子印迹聚合物更高。 1 2 2 4 蛋白质分子印迹的方法 目前常用的制备蛋白质分子印迹聚合物的两种方法如图1 5 所示： 1 0 第一蕈绪论 a 包埋法b 表面印迹 图1 5 蛋白质分子印迹常用的两种方法7 2 】 f i g l - 5 t w oc o m m o nm o l e c u l a ri m p r i n t i n gm e t h o d so f p r o t e i n a 蛋白质包埋法 目前采用最多的聚合方法，即聚合后印迹分子被包埋在本体聚合物中，然后再 粉碎成小颗粒或形成球形聚合物进行后续操作。印迹的蛋白质往往通过蛋白酶的降 解或洗脱溶液而去除，使得产物即分子印迹聚合物可以晕新吸附印迹分子，这种介 质制备方法相对比较简单，一般研究中人们仍多采用此法。 h j 6 r t e n 7 3 - 7 4 等采用该法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红蛋 白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹，得到了具有良 好选择性的m i p s ，不同的印迹分子能被相应的凝胶所吸附，而非印迹蛋白质则不被 这种惰性的凝胶所吸附。t - l j 6 r t e n 还对一种介质同时印迹若干种蛋白质、改善印迹聚 合物的操作性能等进行了研究。 v e n t o n 7 5 】等合成了印迹分子分别为脲酶和牛血清白蛋白的聚硅氧烷聚合物，印 迹蛋白分子用链霉蛋白酶降解。每种聚合物都对其印迹分子显示出了较弱的特异性 吸附能力，聚合物对印迹分子的结合量比非印迹分子多5 0 ，而且用血红蛋白和肌 红蛋白显示了其中印迹分子与聚合物的结合力更强。 b 微球表面印迹法 表面印迹具有分子迁移方便等优点。例如，蛋白质首先与功能单体在衍生硅石 的微球表面上进行预排布，然后加入交联剂，围绕微球表面形成蛋白质部分包埋的 聚合物层，洗脱蛋白质后，形成与蛋白质在形状和功能上有互补表面的模板结合孔 穴。这些具有窄分布的球形粒子非常适合用于色谱。 第一章绪论 在g l a d 7 6 - 早期对蛋白质印迹的尝试中，使转铁蛋白在水溶液中与硼化硅烷相互作 用，然后在硅石粒子表面聚合，得到的聚硅氧烷覆盖的硅石在用b s a 作为对比分子 时对转铁蛋白表现出一定的选择性。 表1 - 1 已被用于印迹的蛋白质分子 t a b 1 1p r o t e i n su s e da si m p r i n t i n gt e m p l a t e s p r o t e i n su s e d b s a ( b o v i n es e r u l t la l b u m i n ) e c o r l t r y p s i nc h y m o t r y p s i n h e m o g l o b i n ，c y t o c h r o m ec ，r n a s e ，h u m a ng r o w t hh o r m o n e ，t r a n s f e r r i n a n g i o t e n s i ni io c t a p e p t i d e u r e a s e i m m u n o g l o b u l i ngf i b r i n o g e n ，l y s o z , y m e g l u c o s eo x i d a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，m i c r o p e r o x i d a s e ，l a c t o p e r o x i d a s e ，c 妒o c h r o m ec b o v i n el e u k a e m i av i r u sg l y c o p r o t e i n r i b o n u c l e a s ea c - r e a c t i v ep r o t e i n ，l y s o z y m e ，h u m a ns e r u ma l b u m i n f e r r i t i n 另外一种表面印迹方法是基于金属的配位相互作用【5 】。在金属离子和核糖核酸 酶a 存在下，一个可聚合金属螯合单体在甲基丙烯酸酯衍生的二氧化硅粒子上聚合。 由于r n a s e a 含有表面暴露的组氨酸，金属离子同时与组氨酸含有咪唑基团以及金 属螯合单体进行配位，通过聚合将这种空间配合作用固定，去除蛋白质后得到的分 子印迹聚合物能优先结合r n a s ea 。相关的研究表明【77 1 ，在一个络合物中，只有两 个金属离子的适当定位才能对互补的蛋白质类、生物咪唑提供强的结合和高的选择 性。但是金属的配位络合只能用于表面暴露片断含有组氨酸的蛋白质的模板印迹。 微球表面印迹技术也被报道用甲基丙烯酸和丙烯酰胺在二氧化硅粒子上共聚合形成 对葡萄糖氧化酶模板具有印迹识别点的m i p s i7 8 】。 此外，p i l e t s k y 7 2 1 z c t ! 聚苯乙烯微球及模板蛋白质存在条件下，3 氨基苯硼酸 1 2 第一章绪论 ( a p b a ) 或3 咪唑硼酸( t b a ) 引发聚合后得到表面覆盖p - a p b a 的聚合物微球，洗脱 蛋白质后，所得微球对模板蛋白质有特异性识别作用。 1 3 蛋白质分子印迹技术存在的问题 人们更多地专注于m i p s 的制备方法，对蛋白质分子和聚合物单体官能团问的 相互作用还缺乏系统研究，在识别过程中是孔穴的三维空间结构还是功能基团或其 它方面起更主导作用还存在分歧。v e n t o n i 。7 5 1 推测蛋白质与聚合物作用力是在聚合中 蛋白质表面多余的基团与单体发生了结合作用而生成；另一种观点认为蛋白质印迹， 其识别作用力应是数日众多的遍及介质的较弱作用力，包括氧键、电荷转移、微弱 的诱导偶极作用和非极性作用等，在蛋白质与底物高度互补，相互接近进才能大量 形成从而较稳固地吸附。机理不清使m i p s 的研究受到一定的制约。 1 4 聚n 乙烯基吡咯烷酮( n v p ) 及其聚合物凝胶 1 4 1 乙烯基吡咯烷酮 n v p 是聚乙烯基吡咯烷酮( v i n y l p y r r o l i d o n e ) 的简称，是合成p v p 的单体。n v p 常 温下是一种无色或者淡黄色、略有气味的透明液体，易溶于水，其主要的物理性质 如下： 相对密度：1 0 4 ( 2 5 。c ) ；溶点：1 3 5 折光率：1 1 d = 1 5 1 2 0 闪点：9 8 3 3 沸点：1 4 8 。c ( 1 3 3 3 2 2 4 p a ) ，5 8 6 5 。c ( 1 3 3 2 6 6 4 p a ) , n v p 除易溶于水外，还易溶于许多有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、 三氧甲烷、乙酸乙烯酯等，所以n v p 具有优良的溶液特性，这也为n v p 溶液聚合的 溶剂提供了较大的选择范围。 n v p 的分子是一个含有n 原子的五元环，属于内酰胺类化合物，在n 原子上连有 一个乙烯基，这是n v p 分子重要的基团，n 原子上的这个基团给n v p 的聚合和应用 提供了比较特殊的性质。 h c c h 2 k l 0 图1 6 n v p 的结构式 f i g 1 6s t r u c t u r ef o r m u l a so fn v p 第一章绪论 n v p 的交联聚合物有两种，一种是通过单体聚合成线性大分子p v p ，然后再进 行交联生成交联聚合物( p o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e 简称p v p p ) ；一种是在单体中加 入交联剂，通过聚合生成的交联聚合物( c r o s s l i n k e dp o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 简称 c r - p v p ) 。两种交联聚乙烯基吡咯烷酮的交联机理并不相同，