（环境科学专业论文）四种典型天然雌激素体外生物实验复合效应研究.pdf

摘要 关键词：重组基因酵母实验m c f 7 细胞增殖实验复合效应浓度加和独立反 应 a b s t r a c t ab s t r a c t n u m e r o u se p i d e m i o l o g i cs t u d i e sh a v ef o u n dt h a taw i d er a n g eo fc h e m i c a l s d e r i v e df r o mn a t u r a la n ds y n t h e t i co r i g i n si n c l u d i n ge n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a n t s ， p h y t o e s w o g e n s ，f u n g a lp r o d u c t s ，p h a r m a c e u t i c a l s ，i n d u s t r i a l l yr e l e v a n tc o m p o u n d s a n dp e s t i c i d e sp o s s e s sh o r m o n ea c t i v i t i e s t h e s ec h e m i c a l sw h i c ha r ed e f i n e da s e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ( e e d c s ) h a v et h ep o t e n t i a lt oi m p a c t h e a l t hb yd i s r u p t i n gt h ep r o d u c t i o n ，r e l e a s e ，t r a n s p o r t , m e t a b o l i s m ，b i n d i n g ，a c t i o n o re l i m i n a t i o no fn a t u r a lh o r m o n e si nt h eb o d yr e s p o n s i b l ef o rm a i n t e n a n c eo f h o m e o s t a s i sa n dt h e r e g u l a t i o no ft h eb o d yr e s p o n s i b l ef o rt h em a i n t e n a n c eo f h o m e o s t a s i sa n dt h er e g u l a t i o no fd e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s t h es t u d yw o u l di n t r o d u c ey e a s te s t r o g e ns c r e e na s s a y ( y e s ) a n de - s c r e e n a s s a yt o d e t e c tt h es i n g l ea n dc o m b i n a t i o n a le f f e c to ff o u rs y n t h e t i cn a t u r a l e s t r o g e n s ( e f f e c ts u m m a t i o n 、c o n c e n t r a t i o na d d i t i o n 、i n d e p e n d e n ta c t i o nt o x i c i t ya n d e q u i v a l e n c yf a c t o r ) a n db yc o m p a r i n g t h er e s u l to fe x p e r i m e n t sa n dt h ea n t i c i p a t i o n o ff o u rd i f f e r e n tm o d e l s ，ar e l a t i v e l yp r o p e rm o d e lw a sc h o s e n i nt h ey e sa s s a y , f i r s t l y ，s o m ei m p o r t a n te x p e r i m e n t a li n e x e sw e r ed e t e c t e d ， s u c ha se x p a t i o n a lt i m e ，d i l u s i o nt i m e s ，e e d c se x p o s u r et i m ea n de n z y m er e a c t i o n t i m e a n dt h e nt h ed o s e - e f f e c tc u r v e so ff o u re e d c sw e r ed e t e r m i n e d t h ea c t i v i t y o f p - g a l a c t o s i d a s ew a su s e dt oe x p r e s st h ee f f e c t f i n a l l y , t h em u l t i p l ee f f e c t so ft w o o rf o u re e d c sw e r et e s t e d ，a n dt h er e s u l t so fe x p e r i m e n t sw e r ec o m p a r e dw i t ht h e p r e d i c t i o nb a s e do nc aa n di am o d e l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a to n l y19 o f t w o - e e d c s - t e s t sa n d2 5 f o u r - e e d c s - t e s t sb e h a v e da ne f f e c t e x c e e d i n gt h e m a x i m u me f f e c to fe 2 i ts e e m e dt h a tc am o d e lc o u l dm o d u l a t et h ee x p e r i m e n t r e s u l tb e r e r i nt h ee - s c r e e na s s a y , f i r s t l y , s o m ei m p o r t a n te x p e r i m e n t a li n d e x sw e r e d e t e c t e d ，s u c ha se x p a t i o n a lt i m e ，c u l t u r et i m ei nc d - n b s r e df r e ed m e m ，s o l v e n t e f f e c t ，a n de e d c se x p o s u r et i m e a n dt h e nt h ed o s e e f f e c tc u r v e so ff o u re e d c s w e r ed e t e r m i n e d p r o l i f e r a t i o ne f f e c t , p e ，w a su s e dt oe x p r e s st h ee f f e c t f i n a l l y , t h e m u l t i p l ee f f e c t so ft w oo rf o u re e d c s w e r et e s t e d ，a n dt h er e s u l t so fe x p e r i m e n t s 1 1 i w e r ec o m p a r e dw i t ht h ep r e d i c t i o nb a s e do nc aa n di am o d e l s t h er e s u l t ss h o w e d t h a to n l y6 o ft w o e e d c s t e s t sb e h a v e da ne f f e c te x c e e d i n gt h em a x i m u me f f e c t o fe 2 i ts e e m e dt h a ti am o d e lc o u l dm o d u l a t et h ee x p e r i m e n tr e s u l tb e a e r k 呵w o r d s ：y e a s te s t r o g e ns c r e e na s s a y e - s c r e e n m u l t i p l ee f f e c t s c o n c e n t r a t i o na d d i t i o n i n d e p e n d e n ta c t i o n i v 符号说明 缩写 e c e p 管 i o a e c n o e c o d p b s r p m s c 符号说明 英文 e 丘e c tc ：o n c c n t r a f i o n e p p c n d o r fm i c r ot e s tt u b e s n oo b s e r v e da d v e r s ee f 诧c tc o n c e n t r a t i o n n oo b s e r v e de f i e c tc o n c e n t r a t i o n o p t i c a ld e n s i t y p h o s h a s cb u f f e rs o l u t i o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s e l e n i t ec y s t i n eb r o t h 中文 效应浓度 聚丙烯微型离心管 无观测不良效应 无观测效应浓度 光密度 磷酸盐缓冲液 辕 食铵 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者繇丽奄 v 加c ；年j 月以e t 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：蔼辞 湖了年j 月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 4 一一一“一一“一一一一_ “一一“_ “ 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于l o 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) j 一一 第一章引言 第一章引言 第一节环境内分泌干扰物污染概述 环境污染物中的环境内分泌干扰物质( e e d c s ) 是指一类外源性化合物进入 机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、转运、代谢和结合等过程， 激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏内分泌系统维持机体稳定性和调控作 用的物质。这类物质具有种类多，数量大，暴露计量小( p p b p p t 级) 等特点。 内分泌干扰物按其生物活性可分为类雌激素及抗雌激素、类雄激素及抗雄激素、 类甲状腺素及抗甲状腺素等，目前研究最多的是类雌激素【l 】。迄今已发现1 0 0 多 种具有内分泌干扰作用的化学物质，大致可分为农药、防腐剂、增塑剂、洗涤剂、 燃烧副产物、某些重金属、其它化合物等几类( 表1 1 ) 1 - 2 。 表1 1 常见类雌激素种类及其代表物 类别代表物质 除草剂阿特拉津、除草醚 农药 杀虫剂六六六、马拉硫磷 杀菌剂苯菌灵、六氯苯 防腐剂五氯酚、三丁基锡 增塑剂邻苯二甲酸二乙酯 洗涤剂壬基苯酚、辛基苯酚 燃烧副产物二嗯英类、苯并( a ) 芘 某些重金属 铅、汞 其它化合物双酚a 和多氯联苯类 随着研究的深入，更多的环境内分泌干扰物质被认定。并且大部分环境内 分泌干扰物质虽然能与天然1 7 1 3 一雌二醇竞争雌激素受体，产生雌激素样效应， 但在结构上与1 7 1 3 一雌二醇没有相似性。这就使得从化学结构上对其进行筛选分 类颇为困难。 环境内分泌干扰物( e e d c s ) 大多数是脂溶性的，且化学性质稳定，可通 第一章引言 过食物链富集，进入机体以后半衰期较长，可在机体内长期蓄积，难以生物降 解，不易排出甚至不排出体外。环境内分泌干扰物具有毒物的一切性质，即使 微量也可对正常的激素作用产生影响，干扰内分泌机能【3 1 。主要体现在干扰生 殖器官的成熟和功能，对其它腺体也有不同程度的影响无论动物还是人类都 会受到这一类物质的干扰。环境内分泌干扰物除了生殖毒性外，还可引起哺乳 动物的病理性损伤。 环境内分泌干扰物的种类繁多，且分布范围广，加之对物 种性别平衡的影响，势必会造成物种减少，生态失衡，甚至影响人类和动物的 繁衍1 4 j 。内分泌干扰物作为典型的低剂量复合作用污染物，已引起各国政府、科 研机构及公众的广泛关注，成为当前公共卫生和环境保护研究工作中的一个热 点。 第二节环境内分泌干扰物研究方法概述 e e d c s 的健康效应的评估方法通常分为流行病学调查和实验方法两个方 面，前者主要通过调查问卷获取信息，得出的结论可能与真实效应存在偏差； 后者在外推至高等生物时存在明显的不足。实验方法主要包括化学方法和生物 方法( 表1 2 ) i 删。化学方法可能在样品预处理过程中造成有效组分的流失，因 此造成结果的偏差；生物测试由于具有灵敏、快速、廉价等特点，成为环境内 分泌干扰物低剂量复合作用评价的重要手段。其中主要包括受体竞争法，酶活 性分析法，基因表达分析法等体外实验以及以哺乳动物、非哺乳动物、无脊椎 动物为受试对象的体内实验1 7 1 j 表1 2 环境内分泌干扰物检测方法 分类 方法优点 缺点参考文献 快速，精确， 理化方法g c m s 、i - i p l c 等成本高 r e f 8 ，9 灵敏度高，重复性好 生 体内子宫增重、 能反映出e e d c 在生 物体内的代谢情况，因此 重复性差， r e f 1 0 物 实验g 表达等实验周期长 r e f 1 1 更接近真实暴露的情况 实重组酵母实验，不能反映出r e f 8 ，1 2 验体外e s c r e e r l ( 如m c f 7 快速，简单易操作， e d c 在体内的代r e f 9 法实验细胞增殖实验) ， 重复性较好谢情况，因此只 受体竞争实验等适用于筛选过程 r e f 1 2 2 第一章引言 1 9 9 4 年之前，由于复合毒理学研究理论认识不够深入，实验方法不够成熟， 超过9 5 的相关研究都是围绕单一内分泌干扰物开展的【”】。由于上述限制，早期 有关复合效应的研究并不成功。以下主要对于1 9 9 4 年之后有关雌激素类物质生 物实验法复合效应研究进展进行介绍。 1 2 1e r 激活反应( e ra c t i v a t i o n ) 1 2 1 1 基因重组酵母实验( y e a s te s t r o g e ns c r e e na s s a y 。y e s ) y e s 实验最先由s u m p t e r 及其同事在1 9 9 6 年提出【1 4 】，在重组基因酵母检测法 中，将人类雌激素受体基因( i - m r ) 、雌激素应答表达子( e r e ) 质粒和编码旷半乳 糖苷酶的l a c z 基因转染入酵母中，前两者组成转录因子，具有调节l a c z 基因 表达的作用。当外界物质与雌激素受体( e 凡) 结合的时候，可以激活转录因子， 进而使l a c z 基因表达，生成d 一半乳糖苷酶，该酶可以使p d - i i i = l = 喃半乳糖苷氯 酚呈红色。因此，通过检测p 一半乳糖苷酶的量就可以定量检测出化学品的类雌 激素活性。由于该方法具有快速；操作简单，易于重复等有点，为越来越多的 科学家应用与e e d c s 的复合效应研究中。1 9 9 9 年，k l a u sg r a u m a n n 掣1 5 】采用y e s 法对硫丹、狄氏剂、阿特拉津及其两种主要代谢物的雌激素复合效应进行了研 究，并同时对植物雌激素进行了测试。结果表明，对于外雌激素以及植物雌激 素，均并未发现明显复合效应，并指出y e s 体系在体外测试雌激素效应方面是行 之有效的工具。而对于各种雌激素类似物作用于生物体后，所产生的复杂效应 可能还会受到诸如代谢补偿、固醇类物质干扰等诸多代谢机制的干扰影响。 在重组基因酵母法测定雌激素复合效应研究中，e l i s a b e t es i l v a 、j o a c h i m p a y n e 等【临17 】通过剂一效反应结果与模型拟合结果的对比，发现四种模型中c a 、 i a ( 有关复合作用模型介绍见1 3 2 ) 在较高浓度范围内两种模型的预测效果都 比较理想。而由于c a 模型对各组分独立效应要求在重叠范围内，故对于雌激素 效应相距悬殊的环境雌激素类似物而言，c a 很难胜任包含这类物质的复合作用 研究：而认模型与实际实验结果相比，有时会低估复合效应。另外，由于过高 e e d c s 浓度会对酵母细胞产生明显细胞毒性，故此范围内的复合效应无法由c a 或认模型计算。 1 2 1 2 其他e r 激活反应 m c f - 7 细胞内的e r - a 基因报告系统也被用于e e d c s 的研究。2 0 0 2 年，c h a r l e s 第一章引言 掣1 8 】利用该方法对雌二醇，乙炔雌二醇以及己烯雌酚复合效应进行了研究，当各 组分浓度落在各自剂一效曲线线性范围内时，实验结果与c a 模型预测结果基本一 致；当受试物浓度较高时，由于饱和现象实验结果会低于c a 模型预测结果。 c h a r l e s 等还对各种比例的苯并 a 芘，1 ，2 一苯并葸，屈以及甲氧d d t ，邻一对d d t 组成的三元混合物复合效应进行研究，实验结果仍然和c a 模型预测结果高度吻 合。另外，他们还发现e 2 ，三羟基异黄酮以及邻一对d d t 之间在低浓度或高浓度 范围均表现出拮抗效应。 另外，h e n e w e e re ta 1 等【1 9 】曾以具有雌激素效应的可过滤紫外线物质为研究 对象，通过测定t f f l 基因的表达来评估e r - a 的活性。结果表明，2 一羟基一甲氧基 苯酚及其代谢物2 ，4 一二羟基苯酚的二元混合物表现出的加和效应与c a 模型预测 结果一致。 e r 激活反应对受试物进行雌激素活性测定的同时，也揭示了其作用机制。 后两种方法对实验条件要求较高，在一般实验室不易进行，而且也易造成放射 性污染。因此y e s 法由于具有简便、快速、重复性高等特点得到了更加广泛的应 用。 1 2 2m c f 一7 细胞增殖( e s c r e e n ) m c f 7 细胞是一种e r + 的人类乳癌细胞，常被用于e e d c s 研究。该细胞e l l s 受外界物质刺激后，可诱发胞内反应，分泌一种5 3 k d a 的外蛋白( e x o p r o t e i n ) 。该 蛋白的分泌受雌激素特异性调节，因此外蛋白的产生及其含量可用来判断受试 物是否具有雌激素活性及其活性强度1 2 0 。 p a y n e 等【2 l 】釉j m c f 一7 细胞增殖实验对d p ，- d d t ，p , p - d d t ，p , p - d d e ，以及 六六六的等的二元复合效应进行了研究，结果发现c a 和i a 模型均能较好地预测 实验结果。2 0 0 4 年r 萄a p a k s e 等【2 2 】同样采m e s c r e e n 法对雌二醇，乙炔雌二醇，双酚 a ，三羟基异黄酮，4 壬基酚以及4 辛基酚的复合效应进行了研究。c a 模型预测 结果与部分实验结果有小幅偏差，但由雌二醇，乙炔雌二醇以及三羟基异黄酮组 成的三元混合物，雌二醇，乙炔雌二醇，三羟基异黄酮以及双酚a 组成的四元混合 物实验结果与c a 模型预测结果高度一致。 1 2 3 鱼虾类卵黄蛋白原表达 在鱼类虾类体内，卵黄蛋白原( v t g ) 的表达是受到e r - q 控制的，因此v t g 4 第一章引言 测定常用于幼体或雌性水生生物雌激素暴露研究。2 0 0 1 年，1 1 1 0 r p e 等【2 3 】首先提 出以这一毒性测试终点来研究二元混合物复合效应的。他们对彩虹鲑鱼暴露与 不同浓度的雌二醇，4 一壬基酚混合物后产生的v t g 进行测定，发现实验结果与c a 模型预测相一致。但暴露于雌二醇及d d t - - 元混合物时，则未表现出加和效应。 2 0 0 3 年t h o 巾e 等【2 4 】又采用v t g 测定法对雌二醇以及乙炔雌二醇二元混合物进行 了研究，结果也对c a 模型进行了充分肯定。但后来也有一些研究发现v t g 实验 控制比较困难，稳定性不易保证。 2 0 0 6 年k a r e nl t h o r p e 掣趵j 对英1 垂1 4 3 个污水处理厂出水中的雌二醇、雌酮、 乙炔雌二醇和壬基酚等主要雌激素类化学污染物进行了检测。并同时采用体外 y e s 测试体系和体内彩虹鱼卵黄蛋白原诱导测试对c a 模型预测效果进行评估。 结果表明y e s 体外实验结果与c a 模型预测结果相去较远，究其原因，可能是出 水中不同物质间的相互作用，以及水样前处理过程中有效组分的流失。当对两 种生物测试法进行比较时，发现二者存在一定差异。y e s 测试结果低于v t g 两倍 左右。但由于鱼体代谢作用，v t g 结果是不稳定的。h u g g e t t e ta l 2 6 】以及a e r n ie t a 1 口7 】也同样对两种方法进行了比较但得到的结果却截然相反：前者认为y e s 测 试结果是v t g 结果的三十五分之一，而后者在y e s 测试出现阳性结果的同时却并 未发现测试雄性鱼类出现卵黄蛋白原诱导效应。虽然不同研究中采用的鱼类品 种有所差异，但仍反映出v t g 方法相对y e s 法而言，稳定性尚待商榷。 1 2 4 哺乳动物子宫增重 子宫增重实验【2 8 l 是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，且为整体实验， 被称为雌激素检测的“金标准”。其原理为子宫中含有丰富的雌激素受体，具 有雌激素样作用的外来化合物与雌激素受体结合后，可引起子宫中雌激素诱导 蛋白含量增加，刺激子宫的生长，通过测定实验动物的子宫重量或计算其脏器 系数来评价化学物的雌激素活性。 2 0 0 2 年c h a r i e s t l 8 l 首次采用c d 1 小鼠子宫增重法对雌二醇、乙炔雌二醇以及 己烯雌酚的复合效应进行研究。按三个剂量组进行实验后，认为上述三种物质 表现出了加和效应。2 0 0 4 年t i n w e l la n da s h b y1 2 9 以该方法对八种物质的雌激素 效应进行测定，发现了这些物质的复合效应都要超过各组分大都作用所能观察 到的效应。 体外实验虽然更接近真实暴露情况，并且能反映出e e d c s 在生物体内的代 第一章引言 谢情况，但重复性不强，实验周期也比较长，故不适合于大样本量的筛选要求。 第三节低剂量复合效应毒理学发展概述 1 3 1 环境毒理学发展趋势低浓度毒理学研究 环境毒理学发展有史以来，其研究重点都是高剂量暴露下单一化合物对生 物体的负作用机理，并在此基础上建立风险安全评估。近年来，随着人类对环 境保护的重视程度与日俱增，环境污染治理取得了长足的进展。环境实体中的 高浓度污染问题逐渐被低浓度污染问题取代；单一污染问题逐渐被复合污染问 题取代1 3 邺2 。低剂量毒理学的发展，必须要考虑毒性作用的内在机理，进行风 险效益评价，并且解释在现实暴露剂量中化合物之间的相互作用，特别是在以 人为最高营养级的食物链和食物网中的各种污染物在低剂量暴露时的相互作 用。这是由于在低剂量暴露时的生物学效应并不只是具有不利效应也可能产生 有利作用，取决于靶器官、实际的研究终点，受体的活性；和( 或) 基因的表 达，蛋白质和代谢物形式【3 1 】。从高剂量效应到低剂量效应的转变使得科学研究 从关注不利效应逐渐变为研究化合物对生物体的生物学效应，在现实中化学物 质的最终生物效应可能因其剂量不同而变化，同时也要考虑实际终点和靶器官， 以及与其它化合物的联合作用。通过在生理学的相关暴露水平确定化学物对生 物体的效用，毒理学家可能不仅对更好的风险安全评价，环境预警机制建设有 所贡献，并可能会在预防医学、食品安全、药学等相关学科的发展提供支持【3 1 1 。 首先，风险安全评估不再被错误地认为是确定某种生物活性物质是否有毒， 因此在现代毒理学领域特别是在低剂量毒物学发展应进行不断的更新【3 l 】。这在 某种程度上也是p a r a c e l s u s 所提出的概念的延伸，即毒性是由剂量决定的。一个 化学药品可能会再相对高剂量时产生不利作用( 女i p a r a c e l s u s 所述) 但是在低剂 量时是无毒性的或甚至是有益的。这意味着更强调非线性剂量响应曲线，u 形剂 量响应曲线和刺激以及毒物兴奋效应现象。此外，化学品的效用随剂量不同而 变化同时也与归宿终点、细胞类型、组织或种类有关。 随着毒理学对化合物在低剂量下的不良反应和有利作用下定义，“毒物兴奋 效应的概念引起人们的注意。在过去几年里，人们对“毒物兴奋效应”的关 注有增无减，甚至有文章宣称它会对风险评价理论的实践产生深刻的影响 3 3 , 3 4 1 。 “毒物兴奋效应”是一种低剂量时对生物体产生刺激作用，而高剂量时则产生 6 第一章引言 抑制作用的剂量反应现象 3 3 , 3 4 】。“毒物兴奋效应”主要表现在对应激的适应性反 应上，应激能够引发细胞修复和系统维护。一定程度的过度补偿导致了有利的 低剂量效应的产生。理论上这表明了化学物的不良反应可能会导致一定的有利 作用的产生。 在研究某种有毒物质对机体产生效应时，若想转变其“毒物”本质，首先 必须对体内作用机制和反应模式进行探究。通过对实际反应机理的研究，负面 效应完全有可能转换成正面效应。 另外，低剂量的药物对于生物体作用的效果不是很明显，所以，当有毒物 质的剂量较低时，必须要同时考虑到那些不同的生物活性化合物在一定生理浓 度下对这些有毒物质的不利作用或有利的作用，即多元混合物的复合( 联合) 效 应得研究。有时，当考虑到其他化合物的作用时，对生物体有利的化合物有可 能对机体产生不利作用，而某些曾被公认的有毒物质则可能会产生对机体有利 的作用。无论是有利作用和不利作用，都必须通过合理的复合作用模型进行表 征。 ， 1 3 2 环境污染物复合作用理论 早期e e d c s 复合效应研究主要采用“整体混合方法1 3 5 这种方法将混合物 视为一种物质，而对单一物质的效应不予评估。该方法比较适合于组分清晰的 具体案例，然而当实验结果需要外推至其他不同配比或组成时，就不再适用。 其另一大缺点是不能明确指出复合效应属于协同、加和、拮抗等之中的哪一种。 针对协同、加和、拮抗等不同类型复合效应的研究要求准确掌握各组分基 本信息，但在实际研究中却很难保证，另外，某种化学物质所表现出的类雌激 素特性可能受到其他因素的影响，比如混合物中其他组分的性质，环境因素等 等，综合上述问题，选取适宜的复合效应预测模型，从而有效地界定加和效应 与协同、拮抗效应的分界点然后将预测结果与实验结果相比对后得出结论，这 种方法应该更为可取。 1 3 2 1 复合作用模型简介 描述多元混合物的复合( 联合) 效应理论有很多，如效应叠加法( e f f e c t s u m m a t i o n ，e s ) 、浓度加和法( c o n c e n t r a t i o na d d i t i o n ，c a ) 、独立作用法 ( i n d e p e n d e n ta c t i o n ，i a ) 和毒性等效因子法( t o x i c i t ye q u i v a l e n c yf a c t o r , t e f ) 7 第一章引言 等【3 6 】。各方法基本公式列于表1 3 。 首先，最早出现的e s 理论有着明显的缺陷，因为独立实验效应总和不会超过 1 0 0 ，所以单纯的将各组分效应相加得到复合效应在大多数情形下是不准确的 3 7 , 3 8 1 o 另外，描述复合效应就要明确不同效应的分界点。由于目前e e d c s 复合效 应的研究对象往往选取同一类内分泌干扰物，因此相对于协同和拮抗效应，各 组分之间往往表现出的是加和效应。在毒理学中，“加和效应”是指不同化学 物质作用在一起产生的除相互增强或削弱以外的情形，即介于协同、拮抗效应 之间的一种复合效应。因此准确描述加和效应才能界定协同、拮抗效应。 于是出现了两个用于描述加和效应的基本概念浓度加和( 即c a ，通常 也被称作剂量加和) 以及独立反应( 从) 。c a 模型f l 了l o e w e 和m u i s c h n e k 提出【3 9 】， 该方法可以防止因目标化合物的非线性剂量一效应关系造成的结果误判。而由 b l i s s 提出的独立作用法( 认) i 4 0 j 则主要针对各组分作用途径不完全相同的混合 体系中的复合效应。近年来这两种方法在严格的多元化合物复合效应研究中得 到广泛应用。+ 浓度加和模型假设参与构建模型的化学物质的生物学作用机制是相似的， 一种物质产生的效应值可以被其它组分部分或全部取代。单一化学物质在混合 物中的贡献值与各自浓度成正比，并且认为低于检测阈值的浓度效应仍符合浓 度加和假定，利用此方法可以研究在低于无观测效应浓度( n o e c ) 时内分泌活 性物质对整体生物学效应的影响情况。毒性等效因子法是c a 模型的变形，在毒 理学复合效应研究中往往起着辅助c a 模型的作用。 独立作用模型假设参与构建模型的化学物质作用于生物体不同的亚系统 中，且亚阈值剂量化学物质对混合物效应值没有贡献。适用于混合体系中各组 分通过不同途径发生作用的情况，因此在复杂混合体系中有其特殊的优越性， 与浓度加和法不同，该方法并不假设各组分在低于其阈值浓度时仍对混合体系 的复合效应有贡献。 c a 和队模型在混合物浓度偏大时都不会出现与e s 相似的问题。m v i g h i 等 1 4 1 1 研究表明，对于反应模式相同的混合物，c a 模型与实际剂一效曲线更为相似； 而对于反应模式不同的混合物，队则是更理想的预测模型。 第一章引言 表1 3 四种污染物复台作用模型 模型名称复合模型基本公式 效应叠加法 k = 局 浓度加和法 喜岳= - 独立作用挂 k = l 一兀n 一旦) 毒性等效因子法 嘻q 器 132 2 复台作用模型在e e d c s 研究中的应用 近十年来，c a 、i a 模型被大量应用于皿c s 复合效应研究。图1 1 为e l i s a b 咖 s i l v a 等 1 q 对双酚 等8 种唧c s 进行基因重组酵母实验得到的复合效应剂效曲线 以及不同模型拟合结果。结果表明c a 模型预测效果最佳。采用不同实验方法的 e e d c s 复合效应研究进展见1 2 1 。 1 巾1 p1 萨 c _ 岣明呐如n “蚺l 圈1 1 双酌a 等八种e e d c s 以低于各自无理爿效应浓度( n o e c ) 混合后的复合散虚及各种模型预测结果。日n 弭法拟台出的曲线与 c a 曲线几乎重台，固图中未标出 协协”雌仰 ，s8c女暑荽暮毒篁-8 第一章引言 1 3 3 低剂量复合效应与环境内分泌干扰物 传统的毒理学理论对于环境内分泌干扰物可能不甚科学。因为其在接近甚 至低于无观测不良效应浓度( n o a e l ) 或对应的安全剂量时仍可诱发生物学效 应，且存在非单调剂量效应关系。非单调剂量一效应关系是指效应随着剂量的增 加会发生反转的一类剂量效应关系，其曲线类型包括u 型或倒u 型f 4 2 】等。存在低 剂量效应大于高剂量- 效应的现象或低剂量与高剂量的作用效应和机理有所不 同。k a i s e r l 4 3 】通过研究指出，有的物质诱发内分泌毒性所需剂量远小于诱发常规 毒性的剂量，但是危害却更大。 低剂量效应的研究报道虽多，但由于存在相互否定的研究结果、实验的重 复次数不够、说服力不强等情况，目前科学界对低剂量效应及其意义还存在争 议。有观点认为体内天然激素本底值已经足以诱导产生相应的生物效应，在此基 础上，即使极低剂量的环境类雌激素暴露也能够进一步引发划悼1 6 1 。另一类观 点则认为内源性激素的活性远远大于环境中的类激素物质，因此，低剂量的类 激素物质暴露不会影响高活性内源激素的调控作用，除非暴露超过一定阈值【州。 环境雌激素复合效应研究在近几年逐渐成为研究热点。在现有低浓度e d s 的 研究中，“低剂量”的界定往往是不一致的。不同文献对“低剂量”定义包括“低 于常规毒理学实验设定剂量”、“相当于人体接触水平”、“产生低效应的浓度” 等掣4 5 1 。但这些界定都是模糊的，并且很难应用于所有受试物。 c a 模型中，任一组份或多或少都会对复合效应有所贡献，这就意味着，即 便受试物中某一组分浓度在某特定实验的n o e c 以下，在复合效应中其仍然占据 一定比重。针对c a 模型的这一特点，当混合物中组分数目较多时，即使各组分 独立作用时在低剂量范围内产生的效应很弱，但复合起来产生的效应确实不可 忽视的。只要保证有足够的组分数目，低剂量( 甚至是接近无穷小的剂量) 的 复合效应都可以通过c a 模型预测出来i 圳。 2 0 0 2 年e l i s a b e t es i l v a 等【1 6 】在对八种雌激素类物质的复合效应研究中就发 现，在无观察效应浓度( n o e c ) 以及e c r u 剂量下，各受试物复合实验结果仍 反映出明显阳性结果，c a 和认模型均能比较好地模拟实验结果。同年他们的 另一项研究表明，1 1 种低水平( 各组分浓度在n o e c s 附近) 的外雌激素混合物 表现出两倍于e 2 的雌激素效应。 2 0 0 7 年j a y n ev b r i a n 等m j f 氐剂量浓度下典型环境内分泌干扰物复合效应进 行了深入研究。雌二醇、乙炔雌二醇、双酚a 、壬基酚、辛基酚等样品以不同比 1 0 第一章引言 例进行混合，实验对象选取黑头呆鱼，暴露后观测的实验重点更为多样，包括 产卵量、雄性第二性征表达程度、躯体系数以及v t g 。结果表明，即便某种受 试物质在水体中的含量不足以产生雌激素效应或其他毒害效应，但多种物质同 时存在的情况下，鱼类产卵量以及健康状况测试结果都足以繁殖性能受到了干 扰和影响。低剂量复合测试v t g 结果中，雄性鱼类表现出明显生殖系统抑制效 应，而对于雌性鱼类结果则不是十分稳定。而对于c a 模型，则可能只适用与作 用类型相似的物质，诸如雌二醇、乙炔雌二醇等典型雌激素。而对于辛基酚、 双酚a 等非单一作用途径的物质，b e r e n b a u m 评价提出的“g e n e r a ls o l u t i o n 理论 可能能够更好地解释其作用效果【4 1 7 1 。因此，要想更深入地研究不同化学物质对 生殖系统的复合效应，不同物质的作用机制将成为研究重点。其中可能涉及到 性质不同的化学物质的交互作用，比如抗雌激素和雄性激素，或者在雌激素系 统表征出独立作用的各种物质。而在进行真实条件下复合效应研究时，还要考 虑许多能对实验结果产生不同程度干扰的各种因素，诸如温度，暴露时间长度 等等。 上述研究结果表明，对于反应模式相近的雌激素类似物，即使以混合物中 的浓度单独作用并不会产生可观察到的效应，共同作用时却能产生足以引起重 视的复合效应。且大多数实验结果与c a 模型预测结果是很接近的。但所有的实 验效应能否在现实环境中发生尚不可知，因为环境因素是十分复杂的，实验方 法所能获得的信息相比于真实环境各种生物的暴露和代谢过程而言尚显不足。 e l i s a b e t es i l v a 等1 1 6 j 认为，更好地评价雌激素低浓度混合效应与以下因素息 息相关： 1 生物测试重复性的提高； 2 内分泌干扰物自身性质的明确； 3 实验终点的确定：不能仅凭借分子级实验结果断定复合效应，而要充分考虑 细胞组织个体级别上的效应； 4 低浓度研究意义的探究：相对个体自身分泌的天然激素，外源激素类似物含 量是很低的，那么这些只占很低比重的成分是否能产生影响大局的效应，尚 有待探讨。 第一章引言 第三节本文的研究内容及意义 1 3 1研究内容 本文选取1 7 1 1 雌二醇( e 2 ) ，乙炔雌二醇( e e 2 ) ，雌三醇( e 3 ) 、雌酮( e 1 ) 等四种典型天然雌激素作为研究对象。这四种物质在结构较为相似，在现代医 学妇科疾病领域治疗广泛应用( 表1 4 ) 。国内外针对这四种物质的复合效应模 型研究较为少见。本文主要采用重组酵母测评系统以及m c f 7 增殖实验这两种 体外实验方法，首先优化实验条件，然后进行单一物质的剂量一效应曲线测定， 后按照不同数目、剂量配比进行复合实验；同时采用各模型对实验结果进行预 测，通过实验结果与预测结果的比对得出最佳模型结论。 1 3 2 研究意义 目前，国际上三大饮用水水质指标( 美国、欧盟和世界卫生组织) 和我国饮用 水水质指标中只对一些农药和少数酞酸酯设置了浓度限制，但对日益频繁检出 的雌激素、烷基酚和双酚a 等e e d c s 还未设置限定。虽然国内外有关e e d c s 存在 水平及其给生态环境带来显著内分泌效应的报道较多，但缺乏一种有效的限制 标准来判断这类物质对人体健康带来的影响，导致衡量e e d c s 的污染水平只能 通过相对比较来判定。在这个问题上，美国科研工作者已经在几年前率先迈出 重要一步。通过对上述各种实验手段进行比较、筛选、优化组合，美国已初步 制定出对人体和动物中雌激素、雄激素和胸腺激素干扰能力的测试体系。该测 试体系分为三个阶段，第一阶段为大通量预筛选试验：第二阶段为第一层面试 验，包括雌激素、雄激素受体结合和转录活化等实验室试验和啮齿动物、青蛙、 鱼类等活体试验：第三阶段为第二层面试验，包括哺乳动物和非哺乳动物的生 殖和生命循环试验。制定符合我国国情的分泌干扰物测试体系，并尽快将其应 用到我国各级别水质目标建设实际操作中，最终制订安全饮用水中雌激素活性 的浓度限定值，已成为我国环境毒理学研究当务之急。饶凯锋等【4 8 】在深圳和天 津水厂发现，经混凝沉淀处理后，水中极性组分的雌激素活性显著升高。虽然研 究人员在不断地开发新技术、新工艺来去除饮用水中的e e d c s l 4 9 巧0 1 ，但对e e d c s 的去除效果达到何种程度才能不影响人体健康还是未知的，因此需要能反映水 中雌激素物质的指标来进行控制。 1 2 第一章引言 鉴于此，本文进行了如下具体的研究工作：结合我国环境污染特点，拟对 所选定的四种典型天然雌激素体外生物实验剂量效应关系及其复合毒理学效应 进行研究，评价c a 、ia 模型预测效果。 表1 41 78 雌二醇，乙炔雌二醇，雌三醇、雌酮结构功能简表 名称 分子式 化学结构式医学应用 为经皮肤吸收的雌激 1 71 3 雌二醇 舻q l t 素治疗剂。补充女性卵巢分 泌的1 7 - 1 3 雌二醇的不足， 同时又可避免因口服引起 ( e 2 ) c 1 8 h 2 4 0 2 的副作用。 雌激素能促使细胞合 成d n a 、r n a 和相应组织内 各种不同的蛋白质。 用于月经紊乱、功能 性子宫出血、绝经期综合 乙炔雌二醇 征、子宫发育不全、前列 ( e e 2 ) c 1 8 h 2 3 0 2腺癌等。与孕激素配伍， 对抑制排卵有协同作用， 增强避孕效果，用作口服 避孕药。 雌三醇 一蝴 作为缓和的性激素试 剂，经口服可治疗更年期障 ( e 3 ) c l s h 2 4 0 a 碍等。 主要用于治疗子宫发 雌酮 h 。o 育不全、月经失调、更年 期障碍等，因来源困难， ( e 1 ) c 1 8 h 2 2 0 2 已少用。由于有止血作用， 所以通常用雌酮硫酸酯作 为止血剂。 第二章重组酵母实验检测典型天然雌激素复合效应 第二章重组酵母实验检测典型天然雌激素复合效应 第一节概述 2 1 1 环境内分泌干扰物的作用机制 大多数内分泌干扰物通过与激素受体的直接作用产生干扰效应，这类干扰 物作为配体与激素受体结合，从而导致受体蛋白构型的改变、二聚化、与热休 克蛋白等分子伴侣解离以及进一步的磷酸化等一系列变化，这种“活化”后的 受体暴露其结构中的d n a 结合区，并进而与靶基因启动子区域中作为顺势调控 元件的激素反