（环境科学专业论文）十溴联苯醚的光降解及细胞毒性分析.pdf

中央民族大学硕士研究生论文 a bs t r a c t b f r ( b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t ) i sa l l a d d i t i v ew i d e l yu s e di n t e x t i l e sa n de l e c t r o n i ci t e m s i n2 010 ，t h et o t a lp r o d u c t i o n o f f l a m e r e t a r d a n t sw i l lr e a c h2 0 x l0 5ti nc h i n a t h eg r e a t e s td e m a n df o r p b d e si nt h em a r k e ti sb d e 2 0 9 ( d e b d e ) a f t e rd u m p e di n t oe n v i r o n m e n t , b d e 2 0 9 p r o d u c e sl o w b r o m i n a t e db i p h e n y le t h e r sa n di st r a n s f o r m e di n t o p b d da n dp b d fa f t e rp h o t o l y s i s ，p y r o l y s i s ，b i o l o g i c a la n dm i c r o b i o l o g i c a l d e g r a d a t i o n t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t sw i l lg e te a s i e ra c c e s se n t e r i n gi n t o o r g a n i s m sa n dm a y c a u s eh e a v i e rt o x i c i t y t h er e s e a r c hc o n s i s t so ft w op a r t s ： p a r t1 ：t h ea n a l y s i so fp h o t o c h e m i c a lr e a c t i o no fb d e 2 0 9 o nt h e b a s i so fa s s e r t i o no ft h eb d e 2 0 9a n di t sm a i np h o t o c h e m i c a lp r i m a r y p r o d u c t su n d e rt h et e s t i n gc o n d i t i o no ft h ep u r em e t h a n o la st h em o b i l e p h a s ea n dt h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t ho f2 5 4 n m ，h p l cm e t h o dt ot e s tt h e b d e 2 0 9a n dt h et h r e ep r i m a r yp r o d u c t si se s t a b l i s h e d t h r o u g ht h e p h o t o c h e m i c a ld e g r a d a t i o ns t u d i e so fb d e 2 0 9i n f o u rd i f f e r e n ts o l v e n t s ( d e g r a d a t i o nr a t e ：c h l o r o f o r m d m s o n o r m a lh e x a n e a c e t o n e ) ，a l lt h ef o u r d e g r a d a t i o np r o c e s s e sf o l l o wt h ef i r s t o r d e rk i n e t i c s ；a f t e ro b s e r v a t i o no f b d e 2 0 9a d d e dn o r m a lr e a g e n t ，n e ws y n t h e t i cn a n o m a t e r i a lc o p p e ro x i d e ， n e ws y n t h e t i cn a n o m a t e r i a lc u p r o u so x i d ea n dn a n o m a t e r i a lc o p p e ro x i d e a n dn a n o m a t e r i a lc u p r o u so x i d ea f t e rat i m eo fd e p o s i t ，t h er e s u l t ss h o w t h a tc o p p e ro x i d ea n dc u p r o u so x i d ec o u l da c c e l e r a t eb d e 2 0 9d e g r a d a t i o n i i i 嗍23咖0 川i2洲8iiiiiy 中央民族大学硕士研究牛论文 r a t e ，a n da l ld e g r a d a t i o n p r o c e s s e s f o l l o wf i r s t o r d e rk i n e t i c s t h e a c c e l e r a t i o ne f f e c t so fn a n o m a t e r i a l so nb d e 2 0 9a r eo b v i o u s l yb e t t e rt h a n t h e o r d i n a r yc o p p e r o x i d e t h ea c c e l e r a t i o nr a t e so fd i f f e r e n t p h o t o s e n s i t i z e r si nt h es a m ec o n c e n t r a t i o na r e ：d o u b l el a y e rn a n o c u p r o u s o x i d e s i n g l el a y e rn a n o c u p r o u so x i d e c o p p e ro x i d e c u p r o u so x i d e w i t h t i m ei n c r e a s i n go fn a n o m a t e r i a l s s e t t l e m e n t ，t h e i rd e g r a d a t i o ne f f e c to n b d e 2 0 9w i l lw e a k e n g r a d u a l l y p a r t2 ：b d e 2 0 9c y t o t o x i c i t yr e s e a r c h f i r s tt h es t u d ys e t sap r o p e r s c g e c o n d i t i o n ，c h o o s i n g o l i v e t a i l m o m e n ta s p r i m a r y e v a l u a t i o n i n d i c a t o ra n do t h e ri n d i c a t o r sa s s u b s i d i a r yi n d i c a t o r s t h e nt h es t u d y e x p l o r e sc y t o t o x i c i t yo fb d e 2 0 9a n di t sp h o t o d e g r a d a t i o np r o d u c tt h r o u g h s c g em e t h o d t h er e s u l t ss h o wt h a tt o x i c i t ya n dc o n c e n t r a t i o no fb d e 2 0 9 e x i s tc e r t a i nd o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p ：t h el o n g e rp h o t o d i s s o c i a t i o nt i m ei s ， t h e a p p a r e n t l yg r e a t e rg e n e t i ct o x i c i t yi s t h e r e f o r et h es t u d yc a l l p r e l i m i n a r i l yi n f e rt h a tb d e 2 0 9p h o t o d i s s o c i a t i o np r o d u c e si n t e r m e d i a t e p r o d u c t sw i t hg r e a t e rg e n e t i ct o x i c i t y t oe n s u r et h et o x i c i t yo fb d e 2 0 9 ，t h e s t u d yc o n t r a s t i n gt h er e s u l t so fb d e 2 0 9a n da n t h r a c e n es c g eo u t c o m e s h o w st h e yb o t hh a v eg e n e t i ct o x i c i t ya n dd o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i p ，b u t t h e c y t o t o x i c i t yo fb d e 2 0 9i s f a rl o w e rt h a na n t h r a c e n ei nt h es a m e c o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：b d e 2 0 9 ，n a n o - c u p r o u so x i d e ，p h o t o d i s s o c i a t i o n ，s c g e ， i v 中央民族大学硕士研究生论文 目录 第一章绪论l 第一节十溴联苯醚光化学降解及毒性综述一l 第二节过去建立的毒性评价体系：8 一、单细胞凝胶电泳作用原理一l0 二、单细胞凝胶电泳实验流程。l l 三、单细胞凝胶电泳技术的应用o 1 3 第二章十溴联苯醚的光化学降解1 6 第一节b d e 2 0 9 检测方法的建立1 6 一、实验材料与方法1 6 二、实验结果与分析1 7 第二节b d e 2 0 9 光化学降解部分2 0 一、实验部分：2 0 二、b d e 2 0 9 光降解反应动力学2 3 第三节不同溶剂条件下的光降解速度和动力学差异比较2 4 、光化学反应实验方法2 5 二、光化学反应动力学研究。2 5 三、实验结果及讨论2 5 第三章新型纳米材料对十溴联苯醚的光降解影响研究2 8 第一节纳米氧化亚铜的合成2 8 第二节光化学实验部分3l 一、实验材料3l 二、实验方法。31 第四章用单细胞凝胶电泳分析b d e 2 0 9 及光降解产物的毒性二4 0 第一节小鼠淋巴细胞彗星分析检测体系的建立4 0 一、实验材料4 0 二、实验方法4 2 第二节结果分析与讨论4 6 一、实验结果分析评价指标的选择4 6 二、实验条件的确定4 7 三、四种评价指标的适用范围4 8 第三节单细胞凝胶电泳检测b d e 2 0 9 及其光降解产物的细胞毒性4 9 一、溶剂的选择4 9 二、染毒时间条件的确定4 9 三、实验结果及分析5 0 四、结果与讨论5 5 第五章结论与展望。5 6 第一节结论。5 6 第二节展望5 7 参考文献5 8 v r f l 央民族大学硕士研究生论文 致谢：二= 丽 攻读学位期间发表的学术论文目6 7 中央民族大学研究生学位论文作者声明6 8 叶l 央民族大学硕士研究! l j 论文 第一章绪论 第一节十溴联苯醚光化学降解及毒性综述 一、概述 十溴联苯醚( b d e 2 0 9 或d e b d e ) 是市场上需求量最大的一类多溴联苯醚，作 为一种溴系阻燃剂( b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t s ，b f r s ) ，广泛用作耐冲击性聚苯乙烯、 聚酯、聚酰胺、纺织品和电子产品的添加剂i 】。近年来，十溴联苯醚的需求量不 断增加。据统计，1 9 9 9 年全世界对b d e 2 0 9 的需求量占对多溴联苯醚总需求量的 8 1 ，2 0 0 1 年为8 3 。预计到2 0 1 0 年，我国阻燃剂总产量约为2 0 x 1 0 5t ，而 b d e 2 0 9 的销售量已达1 3 5x 1 0 5t 1 2 | 。十溴联苯醚排放到环境中后，经光解、高温 分解、生物及微生物降解等过程，会转化为多溴二苯并二垩英、多溴二苯并呋喃以 及低溴代的联苯醚，更容易进入生物体，也引起更强的毒性作用们。 囹 圈 l 物t p 锾婉l 甲守匝 塞冒量 占诬 豳1 - 1 p b d e s 的环境行为 1 - 1e n v i r o n m e n t a l b 妇v j o r so fp o l t b r o m i n a l e dd i p l 蛐姐e m 唧 光降解是有机污染物在环境中的重要归趋之一，环境中普遍存在着化学污染物 吸收阳光而产生的直接光解作用以及光敏化剂存在下的间接光解作用。p b d e s 具有 平面环状的分子结构，能够吸收紫外光或从激发态分子接受能量而使分子处于激发 态，从而引起光解反应。 从风险评价的角度而言，弄清p b d e s 在环境中的降解行为十分重要。通常认 为p b d e s 的生物降解作用并不明显，光化学降解被认为是p b d e s 在环境中的主要 降解途径，但这方面的研究起步较晚。近年来国内外学者在p b d e s 的光化学降解 方面开展了一些研究，主要是在实验室内利用简单体系进行光解模拟。 1 f i 央民族大学硕士研究牛论文 在2 0 9 种p b d e s 同类物中，对十溴联苯醚( b d e 2 0 9 ) 的光解研究成果较多， 在太阳光和紫外光照下均能发生降解。w a t a n a b e 等1 2 1 1 采用正己烷、苯和丙酮为 8 ：l ：l ( 体积比) 的混合溶剂体系，研究了汞灯( 2 5 4 n m ) 和太阳光下十溴联苯醚工 业品的光解，发现两种光源下光解产物主要都是低溴代p b d e s ，此外还有少量 p b d f s 生成。 瞬1 - 2b d e - 2 凹蹄够为p b d f 羊眭p b d d 的可能途径 f 地1 - 2p o s 盎l e m e c h a n i s m sf o rt h ef o r m a t j o n o f p b d f a n dp b d df r o m b d e 一2 0 9 使用汞灯时，生成的p b d f s 为至五溴取代物，最大产率约2 0 ：而太阳光实 验中，生成的p b d f s 为一至四溴取代物，最大产率约1 0 。直接太阳光照下，正 己烷中b d e 2 0 9 发生光解反应，遵循。级动力学，还原脱溴生成低溴代的p b d e s ， 共检测出4 3 种三至九溴取代的p b d e s 2 2 1 。甲醇、四氢呋喃和甲苯中b d e 2 0 9 在 紫外光照下的主要光解产物也是低溴代p b d e s 和少量p b d f s 1 9 ，2 0 ，2 3 捌。o l s r n a n 等 2 3 2 4 l 采用生物测试法( d r 2 c a l u x ) 检测了在3 种紫外光照条件v ( 2 5 0 - 4 0 0 n m 、 2 8 0 - 4 0 0 n m 、3 2 0 - 4 0 0 n m ) 十溴联苯醚工业品的甲苯溶液，发现其具有类二恶英活性； 进一步采用高分辨气相色谱高分辨质谱法( h r g c h r m s ) 进行分析，共检出2 7 。 种一至六溴取代的p b d f s ，其产率分别为1 2 、0 3 5 和0 31 。据此认为类二 恶英活性主要是因为光解过程生成p b d f s 所致。 2 | l 央民族大学硕士研究t 论文 表卜1 ：十溴联苯醚的光解报道m q 7 1 t a b l el 1r e p o r t sa b o u tp h o t o d i s s o c i a t i o no fb d e 2 0 9 注：b d e 2 0 9 降解产物主要是低溴代p b d e s 和p b d f s 。包括3 种九溴p b d e s ，7 种八溴p b d e s 、 8 种七溴p b d e s 少量的六溴p b d e s 以及一至五溴p b d f s 目前固相表面p b d e s 的光解研究工作较少，仅有两篇论文报道了固相表面 b d e 2 0 9 的光解研究( 表1 2 ) 。s o d e r s t r o m 等考察了两种光源( 太阳光和紫外光) 和 4 种固体表面( 二氧化硅凝胶、砂、沉积物、土壤) b d e 2 0 9 的光解过程，说明b d e 2 0 9 的光解半衰期与它所吸附的介质相关，自然介质中的半衰期比人工介质中( 二氧化硅 凝胶、) 长，这主要与介质的表面结构和化学性质等相关。然而，不同介质中b d e 2 0 9 的光解结果显示出了相同的脱溴类型。太阳光和紫外光照下，b d e 2 0 9 在6 种不同 的固体表面的光解研究得出了类似的结论，即介质对光解速率有较大影响，而对降 解产物构成影响较小。 3 r f l 央民族大学硕士研究牛论文 表1 - 2 ：固相表面b d e 2 0 9 的光降解口卜聃1 t a b l e1 - 2p h o t o d i s s o c i a t i o no fb d e 2 0 9o ns o l i ds u r f a c e q v 上q 。p 、孤 暑d 珏 髓l 3b d e - 2 0 9 弦商溉卜聪溴机理 f 鼋- 1 3 1 1 嘲砌d 蛔琳妇由旺m 薯k 哐i h o f b d e 口眇i n t h e p r e s m c e o f r - h 4 m “厂 中央民族大学硕士研究生论文 盯p ，q p 十鼢 矗f，童d 蠹1 5鼻一 q 7 叼+ 蝴一g “、 q 9 一愀瑚一一 糊1 - 4 b d e - 2 0 9 豹逢续缔蜒 f t l 4s 取c 觚d 曲m i 面噙幽n p r d 嘲o f b d e - 埘 二、p b d e s 的毒性研究现状 多溴联苯醚的毒性研究结果显示，p b d e s 作用的靶器官主要是脂肪组织、神 经系统、甲状腺和生殖发育系统等。并且由于在食物链中具有生物放大作用，因此 可以使处于高位营养级的生物包括人类收到毒害作用。目前，p b d e s 的毒性效应 正受到人 门越来越多的关注。然而，这方面的研究工作却仍处于刚刚起步阶段，有 关资料不多。为了推进我国这方砥的科研工作，尤其为发展极为迅猛的电子工业和 电子产品污染防治提供科学依据。 ( 一)甲状腺的毒性 h a l l g r e n 等【1 3 】管饲法将雌性的大鼠( s p r a g u e d a w l a y ) 和小鼠( c 5 7 b l ) 暴露于 几种p b d e s 和p c b ( b r o m k a l7 0 5d e ，b d e 4 7 ，a r o c l o r1 2 5 4 ，和c b 1 0 5 ) 的混合 物1 4 天，然后分别对其体内甲状腺激素和维生素a 的含量进行测定，以评价 p b d e s 和p c b 的联合作用对甲状腺素的毒性。结果发现：两种p b d e s 均降低了大 鼠和小鼠体内甲状腺素和维生素a 的含量，但其毒性效应低于p c b s ；通过测定 e i 的d 、m r o d 和p r o d 酶的活性发现，这三种酶的活性均明显增加，但u d p g t 酶的活性增加不明显，这充分说明微粒体酶的活性被诱导。雌性大鼠 ( s p r a g u e d a w l a y ) 和小g ( c 5 7 一b l ) 暴露于p b d e s ( b r o m k a l 7 0 5d e 和b d e 4 7 ) 和 p c b ( a r o c l o r1 2 5 4 和c b 1 0 5 ) 1 4 天后，其血液中总甲状腺素( t t 4 ) 和游离甲状腺 素( f t 4 ) 的浓度变化规律是：随着p b d e s ( b r o m k a l 7 0 5d e ) 含量的增加，总甲状腺 素( t t 4 ) 和游离甲状腺素( f t 4 ) 的含量依次降低，被诱导酶的活性依次增强，但 p b d e s 含量增加与甲状腺素含量下降之间的剂量一效应关系尚未建立，因为该研 究在同一种p b d e s ( b r o m k a l7 0 5d e ) 的不同浓度条件下所获得的数据有限。 b i n l b a l 】m 【“】在研究b d e 7 1 对雄性大鼠的毒性效应时，也发现甲状腺素的含量降低， 5 fo 央民族大学硕士研究牛论文 促甲状腺素的浓度增大：当处理浓度为3 0 和6 0m g g 一时，大鼠体内的e r o d 、 p r o d 和u d p g t 酶的活性均增加。e r i k s s o n 等【1 8 】也曾有过类似的报道。在p b d e s 的同系物中，溴含量低的对大鼠肝脏中酶的诱导作用会更强- 一些【1 5 】，例如五溴二 苯醚 八溴二苯醚 十溴二苯醚【1 6 , 1 7 】。p b d e s 对肝脏和甲状腺素的毒性效应通常 发生在相对低的剂量，非可观察效应剂量( n o e l ) 值为2 - 1 8m g 蚝。d 4 1 。 ( 二)神经系统的毒性 e r i k s s o n t 的研究表明，刚卜n 生1 0d 的小鼠，给予1 0 1 5m g k g 1 的四溴二苯 醚或1 2 1 0m g k g 叫的五溴二苯醚，均会导致小鼠运动行为异常，成年后记忆和“学 习”能力明显下降，并且b d e 9 9 对神经系统的毒性比b d e 4 7 更强。用动物的本能 行为来验证p b d e s 的毒性效应是十分可行的，主要由于本能行为的变化可以表现 m 动物对环境的适应性【2 】。在研究p b d e s 对小鼠神经系统的毒害作用试验中发现， b d e 9 9 对小鼠的神经系统产生毒性的最大可观察负效应剂量( l o a e l ) 值为8 m g k g 一1 4 l 。通过对四溴二苯醚( b d e 4 7 ) 、五溴二苯醚( b d e 9 9 ) 两种在环境中含 量最高的同系物以及t b b p a ( t e t r a b r o m o i s h e n 0 1 ) 对n m r i 雄性小鼠( 1 0d 大小) 本能行为和环境适应能力影响的测定，来判断其对神经系统的毒性效应时发 现：b d e 9 9 和b d e 4 7 对神经系统的毒性作用将随着其年龄的增大变得更加明显， 并且具有显著的剂量效应关系【2 0 , 2 1 。正常浓度的甲状腺素能够促进大腩的正常发 育过程，这种促进作用在刚出生不久的婴儿体内尤为明显【1 5 j 。通过卜面的分析可知， p b d e s 能够降低甲状腺素在血液中的含量，破坏甲状腺素的平衡状态，减少大脑 可以利用的甲状腺素含量，进而导致神经系统发育异常。 ( 三)肝脏毒性 p b d e s 的肝脏毒性表现为肝微粒体酶活性诱导、肝肿大、退行性组织病理学 改变和肝癌。慢性肝性卟啉病是由于肝病引起的卟啉合成与分泌障碍性疾病。加入 1 0g g m l 商业o b d e 的鸡胚肝细胞培养后明显地激活卟啉的合成和分泌。含有商业 p e b d ee 1 0 0m g k g d 的饲料喂养大鼠1 3 周后可导致肝脏和尿中卟啉含量明显升 高。 ( 四)生殖发育的毒性 在研究十溴二苯醚对大鼠( s p r a g u e - d a w l a y ) 生殖系统的影响时，没有发现十溴 二苯醚对大鼠生殖系统产生影响i 2 2 1 。而在研究八溴二苯醚对大鼠的毒性作用试验 中，试验在大鼠怀孕6 - 1 5d 进行，给予的剂量分别为l ，2 5 ，1 0 ，1 5 ，2 5 ，5 0m g k g d 一，结果发现亲代母鼠的体重下降，胆固醇的含量稍微上升。在上述处理的剂量 6 r f i 央民族大字坝士研毵生论文 范围内，没有出现肾脏和肝脏的病变。子代胎儿的受害症状表现为：对p b d e s 的再 吸收能力增强，平均体重下降，出现严重水肿现象，头骨的骨化过程减慢：当处理 浓度为5 0m g k g 一d 1 时，会伴随m 现发育异常现象，如骨骼弯曲【2 4 】。在该实验中， 当处理浓度低于1 5m g k g 一d 。时，子代没有表现m 卜述受害症状，如果浓度增加， 则子代小鼠表现出受害症状。因此可以推测子代的n o e l 值为1 5m g k g d 。i 。美 国国家环保局在1 9 8 7 年对大鼠( s p r a g u e a w l a y ) 的毒性试验中也发现：当处理浓度 为2 5m g k g d 。1 时，出现幼鼠体重下降、骨化过程推迟、畸形等受害症状。目前， 有关p b d e s 毒性效应的研究主要是针对动物进行的。也有一些研究就p b d e s 对人 类毒性效应进行了探索，如有报道指出f 2 孤，食用受p b d e s 污染鱼的母亲怀孕期会 比正常的短些，婴儿出生时体重偏低，并且运动神经系统发育不成熟。可见，p b d e s 在母亲体内的存在，可能不仅会影响到自身身体健康状况，还会影响到胎儿的正常 发育，并且p b d e s 对胎儿的毒性作用比母亲更强些，通常胎儿在较低浓度即可表 现出发育畸形现象。d a r n e r u d 和e r i k s e n 4 1 总结了大量的研究资料，认为p b d e s 对 人体产生毒性效应的l o a e l 值为lm g k g d i 。 ( 五)免疫毒性 f o w l e s 等2 5 1 用b d e 7 1 经口亚慢性染毒 7 2m g ( k g d ) c 5 7 b l 5 6 小鼠 1 4d ，观察到抗绵羊红细胞反应受抑制、胸腺重量下降。d a r n e r u d 嘶1 发现，b d e 4 7 染毒后 1 8m g ( k g d ) 可明显降低c 5 7 b l 小鼠的脾细胞数量。而且，b r o m k a l7 0 ( 商用p e b d e ) 染毒后 3 6m g ( k g d ) 可以导致体外培养的脾细胞i g g 抗体含 量下降。f e r n i e 2 7 3 最近通过美国一种海鸟研究发现，p b d e s 可以加深影响脾和 胸腺的结构，造成免疫抑制。f e r n l o f 啪3 则认为淋巴细胞对p b d e 、p c b 并不敏 感，不会发生明显的免疫毒性。 ( 六)致癌 目前，只有美国n t p 动物实验发现d e b d e 可致癌矧。他们用3 个剂量( 0 、 2 5 、5 0m g k g ) 分别染毒f 3 4 4 n 大鼠和b 6 c 3 f 1 小鼠1 0 3 周。高剂量组肝腺瘤和 胰腺瘤的发生率明显增高，甲状腺滤泡细胞腺瘤和癌发生率轻微升高。但是，d o w 公司的一项研究却认为d e b d e 暴露不会引起肿瘤，i a r c 认为这与该研究中使用 的染毒剂量过低 1 3 o ) ，该实验能够 检测单、双链的断裂和碱性不稳定点( 某些损伤因子能够导致脱嘌呤或者脱嘧啶位点 的产生，形成碱性不稳定点【8 3 1 ，其在强碱条件下能够转换成d n a 链的断裂) ，从而 使检测的灵敏度得到极大改善。大部分具有基因毒性的化学试剂所诱导的d n a 单链 断裂和碱性不稳定点要多于d n a 双链的断裂，如x 射线和h 2 0 2 诱导的d s b s 与s s b s 之比分别是1 ：2 0 和1 ：2 0 0 0 ，因此碱性彗星检测成为十分灵敏的d n a 损伤的检测方法。 1 9 9 0 年，o l i v e 等建立了尾长指标并首次叙述了“尾矩( t a i lm o m e n t ) 的概念【6 2 1 ， 且很快就被广泛接受。为了检测某些特异性的d n a 损伤，有的研究者将损伤因子作 用后的细胞再用特异性修复酶处理，修复酶可将特异性d n a 损伤转换成d n a 链的 9 中央民族大学硕士研究牛论文 断裂，从而提高了彗星实验检测的特异性。如核酸内切酶i i i ( e n d o n u c l e a s e1 1 1 ) 可以 用来检测嘧啶氧化损伤【5 5 】。随后1 9 9 6 年，c o l l i n s 等对该方法进行了进一步改进，并 利用核酸内切酶l i i ( e n d oi i i ) 和甲酰胺嘧啶糖基酶分别检测了氧化嘧啶和8 羟基鸟嘌 呤的损伤。1 9 9 7 年，s a n t o s 5 6 1 等首次将s c g e 技术与d n a 荧光原位杂交技术 ( f l u o r e s c e n c ei n s i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 结合起来，为s c g e 技术的应用开辟了新的 途径。我国朱志良博士率先在国内建立了彗星荧光原位杂交技术体系，并利用该技 术体系发现人9 号染色体是苯代谢产物的靶染色体。2 0 0 1 年，n a d i i l 等建立了s c g e 银染法【5 7 1 ，进一步提高了损伤d n a 分析的灵敏度。此后，彗星分析作为一门发展势 头非常强劲的方法，广泛的应用到各研究领域之中，然而对于该实验的一些具体操作 和评价指标，目前还没有一个统。的标准，ge i s e n b r a n d a 等人于2 0 0 2 年【5 8 】、h a r t m a n n 等人分别于2 0 0 3 5 8 1 及2 0 0 4 6 2 1 年发表了最新的彗星分析操作指南，对于彗星分析标准 的全球统一化起到了指导作用。2 0 0 5 年至今，彗星分析方法更广泛的被应用到生物： 医学、环境等相关领域，全球科研项目硕果累累。 一、单细胞凝胶电泳作用原理 传统的d n a 电泳理论认为，d n a 迁移距离是与其片段大小成比例的，与此相反， s c g e 所形成的“彗星 形态并非由断裂的d n a 小片段迁移而形成。s c g e 有着与 传统的电泳不同的形成机理。 哺乳类动物体内细胞的d n a 分子量很高并具有严密的超螺旋结构。在细胞核中， d n a 双链以组蛋白为核心形成核小体，在核小体中d n a 为负超螺旋结构，细胞d n a 未受损伤时，外加电场不会使d n a 在凝胶中泳动。而当各种外源性和内源性d n a 损伤因子诱发d n a 链断裂时，d n a 的负超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下， 细胞膜、核膜及其它膜结构被破坏，细胞内的各种蛋白质、r n a 及其它成分均扩散 到裂解液中，而核d n a 分子量很高不能进入凝胶，仍然保留在核区。d n a 在碱性环 境中解螺旋，使d n a 断链和碱易变性d n a 片段从严密的超螺旋结构中释放出来， 由于这些d n a 碎片分子量较小且多为单链，电泳时带负电荷的断链就可以离开核区 向电泳槽阳极移动。未被破坏的d n a 在电泳中停留于核中形成较大的荧光亮点，游 离出来的d n a 碎片则形成类似彗星尾部的微小的荧光亮点，从而形成彗星分析实验 中所特有的“彗星”状图像【5 5 1 。d n a 受损伤愈严重，产生的d n a 碎片就越多也越小， 相同电泳条件下迁移的d n a 量就越多，由于凝胶分子筛具有空间阻挡效应，使得越 小的d n a 碎片电泳迁移率越大，迁移的距离也愈长。 1 0 巾央民族大学硕士研究生论文 二、单细胞凝胶电泳实验流程 在o s t l i n g 等【5 6 l 的中性电泳和s i n g h 等【5 7 】的碱性电泳基础一卜，现己发展了多种实 验方法，比较常用的是碱性条件下的电泳，其基本实验路线包括以下步骤： oo_o_ l 材科囊毒培莽i c 冷i 制鲁单m i t t 浮液l c 冷l j 片l c 号l 绸穗褒并i o_-_-_-_-。-_。-_-_一 圈一回一囤匀囤 图1 - 5 单细胞凝胶电泳实验流程 f i g 1 5s i n g l e - c e l l e dg e le l e e t r o p h o r e s i se x p e r i m e n tp r o c e s s ( 一) 准备细胞：采用台盼蓝染色计数，检测细胞活性，存活率需大于9 0 ，然后用 p b s 配制定浓度细胞悬液。 ( 二) 铺胶：近年来虽然制胶等各方面不断改进，由传统的磨砂载玻片上铺3 层凝胶 的“夹心法”改进为两层或单层灌胶，但胶板易损坏和脱胶的问题仍没有得到很好解 决，且操作步骤多、时间长，也使该技术的规范和推广困难重重。目前t r e v i g e n 公司研制的t r e v i g e nc o m e t s l i d et m 载玻片，成功的提高了低熔点琼脂糖和载玻片的 附着力，减少了常规制胶方法中既耗时又不可靠的底胶制备方法，但由于产品价格昂 贵需多次使用，而多次浸染e b 必然造成交叉污染。 ( 三) 裂解：裂解的目的是破膜和去蛋白，从而使断裂的d n a 片段能够在外加电场 作用下从细胞核中迁移出来。目前去除细胞内蛋白质的方法有两种，一是用高盐溶液 进行盐析，二是使用蛋白酶消化的方法，彗星实验通常使用前者。裂解液由高盐与去 垢剂构成，能使蛋白质变性，膜脂被抽提，导致维持膜结构稳定性的作用力丧失，细 胞膜溶解，细胞内的大部分物质随即溶解，扩散至裂解液中，与d n a 相结合的蛋白 质在高盐的作用下也与d n a 分离，扩散到裂解液中。 ( 四) 解旋：解旋的目的是将双链d n a 变成单链并且使r n a 降解。目前彗星实验 常用解旋液( 1 m me d t a + 3 0 0 m mn a o h ) 的p h 值在1 3 以上，细胞d n a 在此环境 下，很快变性解旋，由双链变成单链，同时高碱性环境能使r n a 全部水解。 ( 五) 电泳：凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有分子筛和电泳的双重效果， 简单、快速、灵敏、成本低、分离效率高。s c g e 一般选用低电压( o 5 5 v e m ) 和 短时问( 5 - 3 0 m i n ) 。电压过高、电泳时间过长虽然能提高检测灵敏度，但可能会使 少许正常的细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损 细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果。 ( 六) 中和：中和电泳后载玻片上的高碱性环境，以便下一步的染色。 。 l l t | | 央民族大学硕士研究生论文 ( 七) 染色：中和后进行染色，所用染料有吖啶橙、溴化乙锭、碘化乙锭等多种。目 前大多数实验室采用的是价格低廉，但毒性很大的溴化乙锭。染色时间为2 - 2 0 m i n ， 为防止荧光衰减，应尽快阅片。 ( 八) 细胞观察与图像分析：通过光学采集系统获得图片，透过带有落射荧光的显微 镜，可以清晰看到细胞发出的激发荧光。受到损伤的细胞呈现出彗星形状，细胞损伤 越严重，彗尾就越长。通过c a m p l 2 2 图像处理软件对彗星的各项指标进行分析，最 终对细胞的损伤程度进行评价。 ( 九) 评价指标：目前根据图像评价d n a 损伤程度所使用的指标大致有如下几种： 形状指标、距离指标、强度指标、“矩”类指标。 形状指标：这是一类比较粗略的指标。根据细胞荧光图像是否像彗星。样头尾分 明将其分为彗星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例， 即彗星样细胞发生率，可估计d n a 的损伤程度【5 6 1 。这种指标可通过镜下观察直接得 到，方便实用。 距离指标：直接在显微镜下或在照片一卜测出彗星的一些长度数值，如尾长 0 3 辨l ， 即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心间的距离；总彗星长度f 1 ，即“彗星” 电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等【5 7 1 ，以评价d n a 损伤程度。这些指 标描述电泳中d n a 泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件， 而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系 1 5 3 - 6 0 6 2 。 强度指标：o s t l i n g 等人最初用s c g e 技术检测射线对d n a 损伤时用“彗星 头 部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述d n a 的损伤。 p o l l e r 6 2 1 等人用“彗星 尾部总荧光强度同“彗星”头部总荧光强度的比值来表示d n a 的损伤程度。新近有报道根据“彗星 尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别 计为0 、1 、2 、3 、4 ，将1 0 0 个细胞的分值加在一。起表示d n a 的损伤程度，并证明 该数值与总彗星长度有较好的相关性。这些指标都不同程度的反映了电泳中泳动 d n a 的量。 “矩 类指标：上述距离类指标和强度类指标均不能全面反映d n a 损伤程度， 有实验证明损伤因素作用剂量增大时，d n a 损伤程度明显增加而尾长基本不变。1 9 9 0 年o l i v e 等人首次描述了“尾矩 的概念，定义为尾部d n a 占总d n a 的百分比与头、 尾部中心间距的乘积。实验证实该指标比上述其它指标都优越，且很快就被广泛接受。 乔琰1 6 2 1 等人经过实验比较指出，尾矩指标能够更全面的评价d n a 的损伤程度，而单 1 2 中央民族大学硕士研究生论文 独以尾长或尾部d n a 百分比作为分析指标则往往不能真实反映致损伤剂的剂量效 应关系。这类指标可以通过计算机影像分析系统简便获得。 三、单细胞凝胶电泳技术的应用 s c g e 是。种具有极高实用价值的、应用前景十分广阔的d n a 损伤检测新技术。 它所需样品量少，工作日程短，为现场人员调查和分析研究提供了可能；方法具有高 度灵敏性【5 6 1 ；无需复杂的仪器设备，与图像分析系统联合应用，结果更精确，操作更 方便，且无放射性示踪剂，既降低成本又减少对人体的危害。适用范围广，凡能制成 单细胞悬液的各种真核生物细胞均适用。 因此，碱性s c g e 技术已广泛应用于d n a 放射损伤、d n a 剪切损伤、d n a 交 联的检测和研究，环境诱变剂或诱癌剂引起的d n a 损伤和修复的研究，药物的遗传 毒性评价，细胞凋亡鉴定，作为生物标记进行环境生物监测及人类流行病学研究，衰 老学研究，肿瘤治疗方案、癌症病人放、化疗方案的最佳选择及科学愈后的研究及药 物筛选，真核微生物研究等【5 5 - 5 7 1 。 1 彗星试验简介 彗星试验，全称为单细胞凝胶电泳试验( s i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s a s s a y , s c g e ) ，由于在荧光显微镜下观察，受损d n a 形成的影像象