（环境科学专业论文）土壤样品umu毒性评价研究样品前处理及umu毒性测试.pdf

一 ， 气 摘要 i i i i iiii i i ii l l ll l l liil 17 3 4 5 9 3 u m u 试验，作为一种新兴的遗传毒性评价方法，已广泛应用于环境样品的检测。目 前，国内外学者多将目光集中在水体样品的毒性检测，水样的前处理方法已经成熟，毒 性评价体系完善。与之相对应的是，土壤污染还没有完全引起人们的重视，尚未开发出 针对于土壤样品毒性测试的前处理方法。本文对焦化厂表层土壤进行了提取实验，对污 染土壤酊处理方法进行了优化，并对土壤样品进行u m u 毒性评价。 对土壤样品提取研究方面，采用了索式提取，超声波提取，微波辅助提取，索式 超声波协同提取等多种方法，以1 6 种多环芳烃混标为标准物，用g c m s 检测。研究结果 表明：( 1 ) 提取时间对索式提取效果起决定性作用；( 2 ) 超声提取时问不宜过长，随着超 声时间的延长能量逐渐升高，可能重新破坏平衡或体系能量的升高令有机结构微孔放 大，同时破坏分子问较弱的化学键，使更多的小分子脱离整体结构，但长时间的超声， 有可能导致分子键的断裂；( 3 ) l l 较索式提取和超声提取多环芳烃各组分所占比重可知， 超声提取高交联度p a h s 如屈、苯并【a 】芘、苯并 g ，h ，i 花时，借助超声波产生的巨大能量， 这些物质能够快速的进入提取体系，索氏提取总体效果优于超声提取，特别是对于芴、 菲等小分子p a h s ，索式提取展现了提取全面的优势；( 4 ) 在随后的超声、索式提取协同 试验中，把索式提取时间定为4 h ，超声提取条件为1 5 0 w 功率下超声6 0 m i n ，发现超声后 索提，比索提之后连接超声，提取效率更高。与经典提取方法2 4 h 索式提取相比，这种 改进的索式提取不仅缩短了样品的处理时间，而且提取效率也有提高。根据土壤样品多 环芳烃提取总量进行评价，结果表明该焦化厂的表层土壤p a h s 污染极其严重。 对土壤样品毒性评价方面，将土壤样品浓缩后，经不同梯度稀释，进行u m u 试验检 测毒性，结果表明1 2 个提取样品中，显示阳性有遗传毒性的样品，占总样品数量的7 5 。 根据g c m s 比照分析，引起遗传毒性响应的物质，主要为p a h s ，其中屈、苯并 a 芘、 苯并j 1 e 等贡献最大。各样品t e f 值，土壤投加量计算结果显示，2 4 h 索式提取样品，改 进型索式提取样品遗传毒性最大。 超声辅助索式提取作为土壤样品u m u 试验自仃处理新方法，测试结果能够较为全面的 反映土壤样品的遗传毒性，与传统提取方法比较，该方法能够从土壤中高效快速的提取 出目标物。 关键词：u m u 试验，遗传毒性，土壤污染，多环芳烃，焦化厂 - a b s t r a c t u m ut e s t ，a san e wm e t h o dt oa c c e s sg e n o t o x i c i t y , h a sb e e nw i d e l ya p p l i e di ng e n o t o x i c i t yd e t e c t i n g o fe n v i r o n m e n t a ls a m p l e s a tp r e s e n t ，m a n ys c h o l o r sf o c u si nw a t e rs a m p l e st e s t ，w h i c hp r e t r e a t m e n t m e t h o dh a sb e e nw e l ld e v o l o p e d o nt h eo t h e rs i d e ，s o i lp o l l u t i o nh a sn o ta r o u s e dp e o p l e sa t t e n t i o n ，t h e r e a r en o tp r e t r e a t m e n tm e t h o dm a t c h e df o r t h eg e n o t o x i c i t yd e t e c t i n go fs o i ls a m p l e s i nt h i sp a p e r , c o n t a m i n a t e ds o i lf r o mc o k i n gf a c t o r yw e r eu s e df o rt h es t u d yo fe x t r a c t i o n t h e n ，t h es o i ls a m p l e sw e r e d e t e c t e dw i t hu m ut e s ti no r d e rt ov e r i f i et h em e t h o dv a l i d i t y h lt h es o i ls a m p l ee x t r a c t i o n t h es o i ls a m p l e sw h i c hw e r ee x t r a c t e db ys o x h l e te x t r a c t i o n ，u l t r a s o n i c e x t r a c t i o n ，m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o na n du l t r a s o n i c a s s i s t e ds o x h l e te x t r a c t i o nw i t hd i c h l o r m e t h a n e d a n da c e t o n ew e r ed e t e c t e dw i t hag a sc h r o m a t o g r a p h ye q u i p p e dw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) r e s u l t s s h o w e dt h a t ：1 ) e x t r a c t i o nt i m ep l a yak e yr o l ei nt h es o x h l e te x t r a c t i o n ；2 ) u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt i m e s h o u l d sn o tb el o n g ，t h et e m p e r a t u r er i s i n gw i t hu l t r a s o n i c ，w h i c hm a yd a m a g et h ee n e r g yb a l a n c ea n d d e s t r o ym i c r o p o r o u sm o l e c u l a rb o n db e t w e e nt h ew e a kc h e m i c a lb o n d s ，m o r es m a l lm o l e c u l e sb r e a ka w a y f r o mm a c r o s t r u c t u r e ，b u tt h ee n e r g yw i l la f f e c ta n df r a c t u r em o l e c u l a rs t r u c t u r ew i t hal o n gt i m eu l t r a s o n i c e x t r a c t i o n ；3 ) s o x h l e t se x t r a c t i o ni sa p p r o p r i a t ef o rh i g hm o l e c u l a rw e i g h tp a h s ，o n t h eo t h e rh a n d ， u l t r a s o n i ce x t r a c t i o ni ss u i tf o rl o wm o l e c u l a rw e i g h tp a h sl i k ep h e n a n t h r e n ea n df l u o r a n t h e n e ；4 ) i nt h e u l t r a s o n i c a s s i s t e ds o x h l e te x t r a c t i o n ，t h ei n f l u e n c e so ft e m p e r a t u r e ，e x t r a c t i o nt i m e ，u l t r a s o n i cp o w e ra n d o t h e rp a r a m e t e r so nt h ee f f i c i e n c yo fs u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o nw e r et e s t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o r t h ed i s t i l l a t i o ni su l t r a s o n i c ( 15 0 w , 6 0 m i n ) a s s i s t e ds o x h l e te x t r a c t i o n ( 4 h o u r ) w i t ham i x t u r eo f d i c h l o r o m e t h a n ea n da c e t o n e c a m p a r e dw i t ht h ec l a s s i ce x t r a c t i o nm e t h o d - 2 4 hs o x h l e te x t r a c t i o n ，t h e n e wm e t h o di sn o to n l ys h o r t e nt h ep r o c e s s i n gt i m e ，b u ta l s oi m p r o v ee f f i c i e n c y a c c o r d i n gt ot h et o t a l p a h se x t r a c t e df r o mt h es a m p l e ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es u r f a c es o i lo ft h ef a c t o r ya r es e r i o u s l yp o l l u t e d i i lt h eu m ut e s t 。t h es a m p l e sw e r ec o n c e n t r a t e da n dd i l u t e di n t od i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s t h er e s u l t s h o w e dt h a t8s a m p l e sw e r ed e t e c t e dw i t hg e n o t o x i c i t y t h er e l a t i v eg e n o t o x i c i t yi se v a l u a t e db a s e do nt h e w e i g h to fs o i lu s e df o re x t r a c t i o nt h a tc o u l dr e s u l ti n ap o s i t i v er e a c t i o n ( o rt h ei n d u c t i o nr a t i ore q u a l s 2 ) c a m p a r e dw i t ht h er e s u l to fg c - m s ，w ef o u n dt h a tt h es a m p l e sw i t hg e n o t o x i c i t yc o n t a i n sp a h ss u c h 硝 i l l c h r y s e n e 、b e n z o a p y r e n ea n db e n z o g ，h ，i p e r y l e n e t h es a m p l ew i t h2 4 h s o x h l e t se x t r a c t i o nr e v e a l h e r e d i t a r yt o x i c i t y ( t e f = 1 4 8 ，n = o 5 7u g ) ，f o l l o w e db yi m p r o v e ds o x h l e t se x t r a c t i o n u l t r a s o n i c a s s i s t e d s o x h l e t se x t r a c t i o na san e wm e t h o dw i t hs o i ls a m l e su m ue x p e r i m e n t ，c a nr e f l e c tt h es o i l s a m p l e h e r e d i t a r yt o x i c i t yc o m p r e h e n s i v e l y , c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a le x t r a c t i n gm e t h o d ，t h en e wm e t h o dc a l l e x t r a c te f f i c i e n t l ya n dq u i c k l yf r o mt h et a r g e t s k e yw o r d s ：u m ut e s t ，g e n o t o x i c i t y , s o i lp o l l u t i o n ，p a h s ( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ) ，c o k i n g f a c t o r y - - 目录 摘要i 。d l 】b s t r a c t i l l 目录v 第一章绪论1 1 i 环境污染与“三致”作用一1 1 1 1 癌症发病现状1 1 1 2 化学致癌物质的环境行为2 1 1 3 化学致癌物质的作用机理3 1 1 4 化学“三致”物质的种类3 1 2 多环芳烃类物质简介5 1 2 1 多环芳烃的产生和分布6 i 2 21 6 种优先控制多环芳烃简介7 1 2 3 多坏芳烃在土壤中的环境行为1 0 1 2 4 土壤样品p a h s 提取方法1 1 第二章遗传毒性检测技术及u m u 试验方法1 3 2 1 几种常用的遗传毒性检测技术1 3 2 1 1a m e s 试验( 细菌回复突变试验，b a c t e r i a lr e v e r s e m u t a t i o nt e s t ) 1 3 2 1 2 微核试验( t h em i c r o n u c l e u st e s t ，m n t ) l3 2 1 3 染色体畸变检测法( c h r o m o s o m ea b e r r a t i o nt e s t ) 1 4 2 1 4 哺乳类细胞突变检测法( m a m m a l i a nc e l lg e n em u t a t i o na s s a y ) 1 4 2 1 5 程序外d n a 合成检测法( u n s c h e d u l e dd n as y n t h e s i st e s t ，u d s ) 。1 4 2 1 6s o s 显色试验( s o sc h r o m o t e s t ) 15 2 2u m u 试验及原理1 7 2 2 1u m u 概：含17 2 2 2s o s u m u 试验原理1 7 2 3u m u 试验方法l8 v 2 3 1u m u 试验菌株18 2 3 2 实验试剂l8 2 3 3 实验仪器和材料1 9 2 3 4 培养基和溶液19 2 3 5u m u 试验步骤2 0 2 3 6 活性计算与评价方法2 0 2 3 7 阳性对照物4 - n q o 致癌机理2 2 第三章土壤样品p a h s 超声提取研究2 5 3 1 实验部分2 5 3 1 1 样品采集2 5 3 1 2 试剂及仪器2 5 3 1 3 实验方法。2 6 3 2 结果与讨论2 7 3 2 1 限定功率下超声时间对提取效率的影响2 7 3 2 1 超声功率对提取效率的影响3 1 3 3 小结3 3 第四章土壤样品p a h s 复合提取方法研究3 5 4 1 实验部分3 5 4 1 1 样品采集3 5 4 1 2 试剂及仪器3 5 4 1 3 实验方法3 6 4 2 结果与讨论3 7 4 2 1 索氏提取效率分析3 7 5 2 焦化厂土样u m u 活性效应4 5 5 2 1 试验方法4 5 5 2 2 数据计算方法4 6 5 3 结果与讨论4 7 5 3 1t e f 十算4 7 5 3 2 土壤投加量计算5 2 5 3 3 土壤样品g c m s 分析一5 3 5 4 ，j 、结5 4 第六章结论5 5 参考文献5 7 附图6 5 致谢7 3 攻读硕士学位期间发表的论文7 5 独创性声明7 7 关于论文使用授权的说明7 7 v l i 第一章绪论 第一章绪论 环境毒理学是研究环境污染物对生物体的毒性和作用机制的一门学科。研究内容 涉及环境污染物及其在环境中的降解和转化产物在动植物体内的吸收、分布、排 泄等生物转运过程，代谢转化等生物转化过程，阐明环境污染物对人体毒作用的 发生、发展和消除的各种条件和机理；研究环境污染物及其在环境中的降解和转 化产物，对机体造成的损害和作用机理；探索环境污染物对人体健康损害的早期 观察指标，即用最灵敏的探测手段，找出环境污染物作用于机体后最初出现的生 物学变化；定量评定有毒环境污染物对机体的影响，确定其剂量一效应或( 反应) 关系，为制定环境卫生标准提供依据【l 】。 1 1 环境污染与“三致”作用 环境污染往往具有使人或哺乳动物致癌、致突变和致畸的作用，统称“三致 作用”。“三致作用”的危害，一般需要经过比较长的时间彳。显露出来，有些危害 甚至影响到后代。世界卫生组织国际癌症研究中心特别工作组发表了关于人类化 学致癌物质的研究报告，己确定9 0 的人类癌症可归因于环境因素，其中主要是 一些环境化学物质，另外还有病毒( 如某些致癌病毒) 和物理因素( 如x 射线、 放射性核素氡) 【2 1 。据估计，约有总数3 4 的人类癌症是由于环境化学物质所引 起的【”。 1 1 1 癌症发病现状 据世界卫生组织1 9 9 5 年度报道，1 9 9 3 年全世界死于癌症的人数约6 0 0 力， 占全球死亡人数的1 2 【4 1 ，发展中国家占大多数，约为5 8 。从19 9 6 年以来全球 每年新确诊的肿瘤患者均在l0 3 0 万以上，到19 9 9 年底全球肿瘤患者总数已逾4 0 0 0 万人【5 1 。另据世界卫生组织专家预测，目前全世界每年有1 0 0 0 万新增癌症病例， 到2 0 2 0 年全球总人1 ：3 将达到8 0 亿，全世界肿瘤发病率将是现在的2 倍，癌症将 成为新世纪人类的第一杀手。 在中国，各城市的癌症发病率都呈明显上升趋势，恶性肿瘤在1 9 9 7 1 9 9 9 三年中已 土壤样品u m u 毒性评价研究样品前处理及u n u 毒性测试 上升至全国大城市居民死因顺位的第1 位，占死亡总人数的2 1 5 8 【6 】。近几年，中 国每年新增肿瘤病人2 0 0 万人，约1 3 0 多万人死于癌症，目前全国肿瘤患者总数 约为4 5 0 万人左右【7 ，8 1 。据统计，1 9 9 1 年2 0 0 0 年我国城市居民中癌症死亡率上升 了18 1 ，农村居民中癌症死亡率上升了l1 0 3 ，平均每死亡五人就有一人死于 癌症。 1 1 2 化学致癌物质的环境行为 两百多年前有入以临床观察和流行病学调查为依据发现烟筒清理工人多发 阴囊癌【9 1 ，证实了环境化学因素可以引起癌症。之后，又有人发现苯胺染料生产 工人易得膀胱癌。1 9 2 5 年，有人用乙醚提取烟煤中的物质，将它涂抹在小鼠皮肤 上，结果诱发了皮肤癌进一步证实了烟煤中存在着致癌性化学物质。之后又陆续 发现吸烟与肺癌【10 1 ，对二氨基苯及芳香胺类与膀胱癌】，石棉与间皮组织恶性肿 瘤【12 1 ，苯与白血病【1 3 , 1 4 1 以及黄曲霉素与肝癌【1 5 , 1 6 】之间都存在着因果关系。 在过去的两个多世纪里，尽管人类对化学物质与癌症的认识有了很多进展， 但近年来，在全球范围内区域性污染导致的癌症发病率上升( 如美国马萨诸塞州 的儿童白血病等) 现象仍然十分普遍。究其原因是由于近几十年来，随着科学技 术的进步和工业时代的到来，在生产环境中发现的致癌性化学物质越来越多；而 在生活环境中，人们通过饮用被污染的水，吸入被污染的空气，食入含有残留农 药的农副产品等，比以前更有机会接触到更多的化学致癌物。 作为全球性的公众健康问题，如何对癌症进行有效的预防和控制已经成为全 人类共同关注的重要课题。尽量避免与致癌物的接触，是人类目前防癌斗争最有 效的方法。世界卫生组织( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ，w h o ) 在2 0 0 4 年的第五 十八届世界卫生大会上通过了预防和控制癌症的决议，该决议指出有1 3 的 癌症可以通过戒烟、合理饮食和避免致癌物暴露来避免的【1 7 】。 就化学物质致癌而言，大部分的化学物质暴露致癌都是长期的低剂量暴露造 成的，因而许多化学物质导致的癌症病例和死亡都是可以预防的。而对环境中化 学致癌物质的检测及其致癌风险评价是避免与其接触的前提条件，是癌症预防和 控制的基础。 2 第一章绪论 1 1 3 化学致癌物质的作用机理 从机体暴露于化学致癌物质至机体出现致癌作用的过程可分为启动阶段、促癌阶 段和进展阶段【1 8 。2 1 1 。 ( 1 ) 启动阶段：致癌物直接作用于d n a ，引起基因突变，使多个或少量细胞发生 永久性的、不可逆的遗传性改变。 ( 2 ) 促癌阶段：细胞在致癌作用的第一阶段变成启动细胞后，在某些因素的促进 下克隆扩增，形成细胞群，即良性肿瘤，这是致癌作用的第二阶段。 ( 3 ) 进展阶段：启动和促癌两个阶段所引起的良性损伤并不是致死性的。良性肿 瘤需要经过进展阶段才能转变为恶性肿瘤。 三个阶段中，启动和进展都涉及突变。细胞突变学说( s o m a t i cm u t a t i o nt h e o r y ) 指 出致癌因素包括化学因素、物理因素、生物因素，这些因素使机体细胞的遗传物质d n a 发生突变，结果使细胞的功能发生异常改变而致癌，即癌变形成的基础是机体细胞发生 突变【2 2 1 。 研究证明，不论是用动物、植物还是微生物作为检测材料，“三致”效应( 致癌、 致畸、致突变) 之问具有很高的相关性。至少有9 0 一9 5 的致癌物质也是致突变物质【2 3 。2 5 1 。 但由于致癌和致畸试验需要较长的时间才能得出结果( 一般动物致癌试验需要三年的时 间，而且花费较大) ，而测定致突变效应可以短时间内得到结果，因此，依据化学物质 ； 的致突变性可以预测其是否具有潜在的致癌或致畸危险。 1 1 4 化学“三致 物质的种类 目前世界上已经合成的或已鉴定的化学物质有13 0 0 多力种，常见的或在使 用中的有8 万种之多，化合物、混合物和消费产品的数量达数百万种。现在已知 诱发癌症的化学物质已有一千多种。包括天然的和人工合成的，世界公认的三大 强烈致癌物质为多坏芳烃类，亚硝胺类及曲霉毒素类。 ( 1 ) 多环芳烃如煤焦油、沥青、粗石蜡、杂酚油、葸油等，这些物质中含 有3 ，4 苯并芘，是一种重要的致癌物质，烟草中的含量也不少。 ( 2 ) 亚硝胺有自然界存在的数量较少，但通过细菌的作用，在人体内可 以合成大量的亚硝胺，是消化系统癌症的重要致癌物质。 ( 3 ) 霉菌毒素是某些霉菌的代谢产物，可以致癌，如黄曲霉毒素等。 土壤样品u m u 毒性评价研究样品前处理及1 1 1 1 1 1 毒性测试 常见的“三致 化学物质主要涉及表1 1 中的1 1 类物质【2 6 】。 表1 1 “三致”化学物质的分类 类别典型化学物质 典型物化学结构式 直接烷化剂 芥子气、氯甲甲醚、环氧乙烷、硫酸二 c h ，c lo _ c h l c l 乙酯 。 一 间接烷化剂氯乙烯、苯、丁二烯抗癌烷化药物 。苯并芘、二甲基苯葸、二苯蒽、三甲基胆 多环芳烃 蒽、煤焦油、沥青 0 酥一c 删 类群腻臻腻善鞣拳4 巧雌联氆 2 ) ，样品的致突 变性为阳性。 ( 3 ) 诱导率( i n d u c t i o nr a t e ，i r ) 诱导比率( r ) 判断标准忽略了不同实验样品暴露量的不同，这将导致阳性判断结 果的不同。各实验室对样品的浓缩倍率不同，同样的样品，由于浓缩倍率的不同，所得 实验结论可能会完全相反。 对不同样品浓度，通过u m u 试验计算各浓度的b 半乳糖苷酶诱导活性值( u n i t s ) 得到如图2 3 所示样品的u m u 响应曲线，对曲线的指数段( 响应曲线为对数横坐标) 进行线性拟合( 如图2 4 ) ，b 半乳糖苷酶诱导活性值与样品之间存在着非常好的直线关 系，该直线回归方程的斜率表示了单位样品量所产生的u m u 效应强度，采用样品u m u 响应曲线的斜率( i r ，u n i t s l - 1 ) 作为u m u 试验检测环境样品遗传毒性的试验结果，将 能克服诱导比率( r ) 的不足，此斜率即为诱导率( i n d u c t i o nr a t e ，i r ) 。 五 ( 4 ) 4 - n q o 等当量毒性( t e f ) 阳性对照物4 - n q o 对s a l m o n e l 肠t y p h i m u r i u mt a l 5 3 5 p s k l 0 0 2 菌株的b - 半乳糖苷 酶诱导活性值( u n i t s ) 对应的曲线是u m u 标准曲线( 如图2 3 ) ，标准曲线指数段的线 性拟合( i 凡，u n i t s g g 1 ) 如图2 - 4 所示。 诱导率( i r ) 避免了样品不同稀释倍率的影响，但同批次实验菌种，不同时间测得 的阳性对照物4 - n q o 的u m u 标准曲线不尽相同，每次测得的阳性对照物的诱导率( 1 1 ， u n i t s p g j ) 也不同，若样品的诱导率以阳性对照物的诱导率为参照，则不同时间的实验 结果更有可比性，因此，定义了4 - n q o 等当量毒性的概念： 4 - n q o 等当量毒性( t e f ，g g l j ) = 样品诱导率( i r ) 阳性对照物诱导率( i 凡) 即单位样品等当量于阳性对照物4 - n q o 的质量( p g ) ，t e f 值更形象地反应了实际 样品的遗传毒性大小。 2 l 土壤样品u m u 毒性评价研究样品前处理及u n u 毒性测试 4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 喜2 5 0 0 j ；2 0 0 0 善1 5 0 0 呈1 0 0 0 c d 釜5 0 0 o 0 o o lo 0 10 11 4 - n q oc o n c e n t r a t i o n l a g m l - 1 1 2 0 0 9 0 0 6 0 0 3 0 0 o 图2 - 3 阳性对照物4 - n q o 的u m u 标准曲线 1 0 o o 0 50 10 1 5 4 - n q oc o n c e n t r a t i o n l a g 图2 - 44 - n q o 标准曲线指数段的i r 值拟合 2 3 7 阳性对照物4 - n q o 致癌机理 4 - n q o 属于芳香胺杂环化合物，是一种很强的水溶性致癌物前体( p r o c a r c i n o g e n ) ， 可使鼠伤寒沙门氏菌变异。通常在体内代谢成最终致癌物的形式并与d n a 上的亲核部 位发生不可逆反应，从而改变基因表达。 在还原酶，主要是d t - 黄递酶的作用下，4 - n q o 结构上的硝基还原成n 一羟基衍生 物一- 羟氨基喹啉一l - 氧化物( 4 一h y d r o x y a m i n o q u i n o l i n e 1 o x i d e ，4 - h a q o ) ，它是一种近 致癌物( p r o x i m a t ec a r c i n o g e n ) ，可使鼠伤寒沙门氏菌及噬菌体变异，然后进一步通过脯 兽一ii；五一11n爵ibm 第二章遗传毒性检测技术及u m u 试验方法 氨酰基化作用代谢为最终致癌物( u l t i m a t ec a r c i n o g e n ) 4 乙酰氨基喹啉 ( 4 a c e t o x y a m i n o q u i n o l i n e 1 o x i d e ，4 - a a q o ) ，最后与靶器官细胞d n a 亲核结构结合， 形成d n a 加合物，损伤染色体8 3 1 。4 - n q o 的主要解毒通路是在谷胱甘肽s 转移酶 ( g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e s ，g s t s ) 的作用下，形成谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 轭合 物( c o n j u g a t e ) 。该代谢过程与致癌代谢途径问如果失去平衡，最后导致4 - n q o 诱发肿 瘤的发生【8 4 】。 第三章十壤样品p a h s 超声提取研究 第三章土壤样品p a h s 超声提取研究 自从1 9 世纪8 0 年代，压电现象和超声哨子的相继发现，开辟了超声波领域的研究。 随着科学技术的不断发展，超声技术已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、国防等领 域。由于超声波具有特殊的强纵向振动，高速冲击破碎和空化效应，超声提取技术在中 草药成分提取，环境样品的提取分析方面得到了广泛的应用和发展。 焦化厂污染是环境中p a h s 的重要来源之一，它以煤为主要原料，其各个生产车间 内化石燃料的不完全燃烧及焦油、煤气等化工产品的加工过程都可能导致p a h s 类物质 的排放【8 5 】。2 0 世纪9 0 年代以来，中国焦化行业得到了飞速发展，截至2 0 0 3 年，中国 焦炭产量约占世界焦炭总产量的4 6 ，出口焦炭约占世界焦炭贸易总量的5 6 【8 6 1 。中 国己成为世界焦炭生产、消费及贸易的第一大副8 7 1 ，中国的焦化企业己成为p a h s 污染 的主要关注点8 6 1 。 本实验以焦化厂土壤样品中多环芳烃为目标物，选择超声提取方法，利用气相一质 谱联用技术进行分离检测，试图揭示提取过程中，各多环芳烃组分的变化规律，同时为 建立简便、实用的土壤样品p a h s 提取技术做了初步探索。 3 1 实验部分 3 1 1 样品采集 样品采自平顶山焦化厂厂区表层土( 0 3 0 c m ) ，呈黑褐色，无明显异味，置于聚乙 烯土样袋中携带。运回实验室后，将其在阴凉处风干。去除石块，植物枝叶等非土壤成 分，用研钵研磨后过1 0 0 目筛，放置于4 c 冰箱中保存。 3 1 2 试剂及仪器 1 6 种多环芳烃混合标准溶液( a c c u s t a n d a r di n c ，u s a ，j 下己烷为溶剂配成l o o m g l 标准储备液选用) ，甲醇( m e t h a n o l ，c h 4 0 ，h p l cg r a d e ，j & kc h e m i c a ll t d ) ，正已 烷( h e x a n e ，c 6 h 1 4 ，h p l cg r a d e ，j & kc h e m i c a ll t d ) ，二氯甲烷( d i c h l o r o m e t h a n e ， c h 2 c 1 2 ，h p l cg r a d e ，a c r o so r g a n i c s ，u k ) ，甲醇( m e t h a n o l ，c h 4 0 ，a r ，北京化工 厂) ，二氯甲烷( d i c h l o r o m e t h a n e ，c h 2 c 1 2 ，a r ，天津市化学试剂三厂) ，丙酮( a c e t o n e ， 十壤样品u m l l 毒性评价研究样品前处理及u n u 毒性测试 c h 3 c o c h 3 ，a r ，洛阳吴华化学试剂公司) ，正己烷( h e x a n e ，c 6 h 1 4 ，a r ，天津市化 学试剂三厂) ，无水m g e s 0 4 ( a r ，无锡市民丰试剂厂) ，柱层层析硅胶( 粒度2 0 0 3 0 0 目，青岛海洋化工厂) ； g c m s 气质联用仪( 6 8 9 0 5 9 7 3 n ，a g i l e n t ) ，超声波发生器( k q 3 2 0 0 d v ，昆山市 超声仪器有限公司) ，旋转蒸发仪( r e 5 2 ，上海亚荣生化仪器厂) ，层析柱，烘箱， 离心机，普氮。 3 1 3 实验方法 ( 1 ) 预处理 取定量土壤样品，置于烘箱中烘干，测其含水率：用电子天平精确秤取1 0 9 样品， 加入过量的无水硫酸镁使之固化，经瓷研钵研磨后，过筛并完全转移，待进一步处理。 ( 2 ) 样品提取 将预处理过i 拘1 0 9 样品装入圆底烧瓶中，选择圆底烧瓶可有效避免实验过程中产生 的超声盲团8 8 1 ，加入2 0 m l 混合萃取液( v ：氯甲烷v l j j 酮= 1 ) ，分别做不同功率( 5 0 w 、l o o w 、 1 5 0 w ) ，不同提取时间( 3 0 m i n 、6 0 m i n 、9 0 m i n ) 超声提取，在提取过程中，不断加入 冰块，保持水温4 0 。c 左右，优化提耿条件。超声完毕后，将泥浆转入离心机，以4 0 0 0 r m i n 离一t 1 , 1 5 m i n ，取上清液，经旋转蒸发至近干，加入l m l 正己烷，转移保存。 ( 3 ) 硅胶柱层析 对土壤样品进行分级净化参照了邵到8 9 】的分析方法，并根据实际情况加以改进。采 用自制层析柱( 1 8 0 x 1 0 一m i ni d ) ，下端用玻璃棉铺实，玻璃棉预先经甲醇、正己烷、 二氯甲烷( 色谱纯) 淋洗，之后用干装法装入3 克活化硅胶并轻轻敲实，在硅胶上面放 置约0 5 c m 厚的无水m 9 2 s 0 4 。用1 0 m lj 下己烷( 色谱级) 淋洗色谱柱并将流出液弃掉， 确保不让无水m 9 2 s o t 暴露于空气中。用胶头滴管将提取的样品加入层析柱，并用l m l 正己烷( 色谱级) 将样品转移完全。分别用l o m l j 下己烷、2 0 m ll ：1 的正己烷- 氯甲烷的 混合溶液、l o m ll ：2 的正己烷二氯甲烷的混合溶液淋洗，淋洗速率为0 5 m l m i n 。将淋 洗液分别旋转蒸发并用柔和氮气吹干后用正己烷定容至1 0 m l 。检测结果显示，淋洗液第 一组分主要成分为脂肪烃，第二组分成分为芳香烃，第三组分为脂、酮其他物质。硅胶 实验需先行活化，活化方法为：取1 0 0 9 胶放入烧杯中，依次加入8 0 m l 的丙酮、正己烷 和二氯甲烷，然后放在通风橱中过夜风干，将干燥的硅胶放入表面皿中，并用锡箔纸松 散地盖在表面皿上与13 0 。c 下活化16 h t 吲。 2 6 第三章十壤样品p a h s 超卢提取研究 ( 4 ) g c m s 检测 g c m s 条件参考文献【9 1 1 ，经试验优化，对p a h s 组分分析条件如下：进样口和检测 器温度分别为3 0 0 。c 和3 1 0 。c ；采取l u l 不分流进样；载气流速为1 m l m i m 升温程序：在 初始温度5 0 时，保持l m i n ，以1 5 。c m i n 升至1 7 0 ，保持2 m i n ，然后以8 。c m i n 升至2 2 0 ， 以3 r a i n 升至3 0 0 并保持9 m i n 。 将p a h s 混标稀释成lm g l ，5m g l ，1 0m g l ，2 0m g l 不等浓度，依次进行g c m s 检测。以峰面积定量计算，从而得到p a h s 各物质线性回归方程，相关系数在0 9 7 9 9 0 9 9 9 8 之间，内插法求得实际样品各提取各物质含量，图3 1 为1 0 p p m p a h s 混标的g c m s 图谱。 a h t m d a n e a 46 5 0 、。0 i 。! ! l 且、，。，。，l 型0 i b 一。 。l 。且、。，。，之! 10 0 015 0 02 0 0 02 5 o o3 0 0 0 1 6 1 4 1 5 6 8 ll! j i 川f i l 一j 、 jl 图3 110 p p m p a h s 混标g c m s 图谱 ( 1 萘，2 苊烯，3 苊，4 芴，5 菲，6 蒽，7 荧蒽，8 芘，9 苯并 a 】蒽，1 0 屈，1 1 苯并 b 】荧蒽，1 2 苯 并【k 荧蒽，1 3 苯并【a 】芘，1 4 茚并 1 ，2 ，3 一c d 芘，1 5 二苯并 a ，h 葸，1 6 苯并 g ，h ，i 】菲) 3 2 结果与讨论 3 2 1 限定功率下超声时间对提取效率的影响 将超声仪器功率设置为5 0 w ，分别对样品进行3 0 m i n 、6 0