（病理学与病理生理学专业论文）多效蛋白ptn在肺腺癌血清、组织和细胞中的表达及意义.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前言9 刖舌 材料与方法1 0 实验结果1 2 讨论1 6 结论1 8 四、本研究创新性的自我评价1 9 五、参考文献2 0 六、附录 综述2 2 致谢3 0 个人简介3 1 中文论著摘要 多效蛋白p t n 在肺腺癌血清、组织和细胞中的 表达及意义 刖菁 肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在我国居各种恶性肿瘤之首。 肺癌对人类健康的危害日益严重，直接影响人类的身心健康和生活质量，肺癌死 亡率高的主要原因是由于难以早期发现和易于侵袭转移，导致患者手术后五年存 活率降低。近年来，许多学者把研究的焦点聚集在肺癌的早期诊断和e m t ( 上 皮间质转化) 上。 p t n ( p l e i o t r o p h i n ) 最早是在1 9 8 9 年华盛顿大学医学中心纯化的一种生长因 子，当时认为该因子为1 7 k d 的蛋白，与肝素具有高亲和性，并首次被命名为 h b g f - 8 ( h e p a r i nb i n d i n gg r o w t hf a c t o r - 8 ) 。1 9 9 0 年华盛顿大学的医学中心的进一 步研究发现，该因子与当时已知的7 个肝素结合生长因子不存在明显的同源性， 并因该蛋白具有多种生物学活性而改名为p t n ( p l e i o t r o p h i n ) ，意为多效蛋白， 而更能准确地表达该因子的特性。p t n 编码1 6 8 个氨基酸，与m k 存在5 0 的序 列同源性，两者共同组成肝素结合超家族。p t n 在多种肿瘤组织及血清中高表达， 具有促有丝分裂及促进血管新生的特性，影响肿瘤细胞的血供、生长及转移。研 究表明，p t n 蛋白在肺癌组织中含量丰富，早期即可在血浆中出现，并且与肿瘤 的分期相关，2 0 0 2 年j a j e r 等用e l a s a 法检测肺癌患者血清中的p t n 表达水平， 发现p t n 浓度比正常血清中的浓度显著增高，并且与临床病理分期成正相关，与 化疗药物成负相关。 目的 检测肺腺癌患者术前血清标本及相对应的术后切除肺腺癌组织标本，同时检 测肺腺癌患者胸水标本中的p t n 蛋白的表达，探讨p t n 蛋白在肺腺癌患者三种 不同标本中的表达及意义。 材料与方法 一、标本收集 收集2 0 0 8 年2 0 1 0 年之间肺腺癌患者的术前血清5 0 例和相对应的肺腺癌患 者的术后切除组织标本，5 0 例肺腺癌患者所致的恶性胸水。其中有3 例患者既有 术前血清，术后组织标本，又有相对应的胸水标本。另收取2 0 例正常献血者血清、 2 0 例癌旁组织、2 0 例胸水良性增生细胞作为对照。所有标本均取自于中国医科大 学附属第一医院病理科。 二、免疫组织化学染色 鼠抗人p t n ( h 6 ) ( s c 7 4 4 4 3 ) 单克隆抗体购自美国s n a t a 公司，兔抗人t t f l 单克隆抗体、鼠抗人c k l 9 单克隆抗体、鼠抗人e - c a 单克隆抗体、兔抗人v i m e n t i n 单克隆抗体、s p 超敏免疫组化试剂盒和d a b 酶底物显色试剂盒均购自北京中杉生 物技术有限公司。染色方法根据试剂盒说明进行。 三、w e s t e r nb i o t 蛋白印迹 将含8 0pg 总蛋白的血清和胸水细胞裂解产物进行1 0 s d s p a g e 电泳1 5 h 后，转印至p v d f 膜( 5 0 v ，2 h ) ，脱脂奶粉室温封闭2 h ，经t t b s 冲洗3 次，抗p t n 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) 4 孵育过夜后，辣根过氧化物酶标记二抗3 7 孵育2 h ，t t b s 洗三次后e c l 发光。以b - a c t i n 为内对照，比较各条带灰度值。 四、统计分析 应用s p s s l 3 0 统计软件进行数据处理，采用穿检验( 不满条件时用f i s h e r 确切概率法) 分析各组计数资料，p o 0 5 为差异有统计学意义。 勿七电 皇日禾 1 、p t n 在正常献血者血清中未见特异性条带，在肺腺癌患者的血清中可见 有特异性条带，其中期肺腺癌患者的血清p t n 蛋白表达水平明显高于i 期肺腺 癌患者的血清p t n 蛋白表达水平。 2 、p t n 在肺腺癌组织中的阳性率4 0 ( 2 0 5 0 ) 高于癌旁正常组织中的阳性 率0 ( 0 2 0 ) ，其中在肺腺癌组织中p t n 蛋白的表达与年龄、性别、分化程度无 2 关，与临床分期和淋巴结有无转移有关，差异均具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 3 、p t n 蛋白在恶性胸水腺癌细胞中的阳性率6 2 ( 3 1 5 0 ) 高于胸水良性增 生细胞中的阳性率o ( 0 2 0 ) ，差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。 4 、p t n 蛋白在恶性胸水腺癌细胞中可见有特异性条带，在胸水良性增生细 胞中未见特异性条带。 5 、p t n 蛋白在肺腺癌患者胸水细胞中的阳性率6 2 ( 3 1 5 0 ) 高于组织中 的阳性率4 0 ( 2 0 5 0 ) 、组织中的阳性率4 0 ( 2 0 5 0 ) 高于肺腺癌患者血清中的 阳性率1 8 ( 9 5 0 ) ，差异均具有统计学意义( p o 0 5 ) 。并且，在3 例分别来源 于同一例患者的这三种标本中，p t n 和v i m e n t i n 在血清和肺腺癌组织中阴性表达， e c a 阳性表达；但在相对应的恶性胸水腺癌细胞中p t n 和v t m e n t i n 呈阳性表达， e c a 阴性表达。 结论 l 、p t n 在肺腺癌患者的血清中可见有特异性条带，并且期表达水平明显 高于i 期表达水平，提示w e s t e r n b l o t 方法可以检测出p t n 蛋白的表达，并能初 步预测临床分期。 2 、p t n 在肺癌组织中高表达，且其表达与临床分期和淋巴结转移密切相关， 提示其表达在肺癌的侵袭转移过程中起到促进作用。 3 、p t n 在胸水细胞中的阳性率高于组织和血清中的阳性率，并且在来源于 同一例患者的三种标本中，p t n 在血清和组织中阴性表达，在胸水细胞中阳性表 达，进一步提示其表达在肺癌的侵袭转移过程中起到促进作用。 关键词 肺腺癌；p t n ；胸水腺癌细胞；血清；组织；e m t 3 英文论著摘要 t h e ：p r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo fp t n 。bloodee x p r e s s l o na n i nd0 irl 州 s e r u m 、t i s s u ea n dc e l lf r o ml u n ga d e n o c a r c i n o m a p a t i e n t s i n t r o d u c t i o n l u n gc a n c e ri so n eo ft h em o s tf r e q u e n t l yf o u n dm a l i g n a n tt u m o r si no u rc o u n t r y i t sm o r t a l i t yi st h eh i 曲e s ti no u rc o u n t r y 1 u n gc a n c e rw i l l si n c r e a s i n g l ys e r i o u sh a r mt o h u m a nh e a l t h ，w h i c hd i r e c t l yi n f l u e n c e st h ep h y s i c a la n dm e n t a lh e a l t ha n dh u m a nl i f e q u a l i t y , t h em a i nr e a s o nt ol u n gc a n c e rh i g hm o r t a l i t y i st h a td i f f i c u l tt od e t e c t e da n d e a s yt ot r a n s f e r ，r e s u l ti np a t i e n t ss u r v i v a lr a t ea f t e rs u r g e r yf o rr e d u c i n g r e c e n ty e a r s ， b e c a u s eo ft h e s et w or e a s o n s ，m a n ys c h o l a r sf o c u st o e a r l yd i a g n o s i s a n d e m t ( e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ) p t n ( p l e i o t r o p h i n ) w a sf i r s tf o u n db yw a s h i n g t o nu n i v e r s i t ym e d i c a lc e n t e ri n 19 8 9 ，t h e nt h e yt h o u g h tt h i sf a c t o rw a s17 k dp r o t e i na n dh i g ha f f i n i t yw i t h h c p a r i n ，b i n d i n gg r o w t hf a c t o rh e p a r i n m o r e o v e r , i tw a s f i r s tn a m e dh b g f 一8 ( h e p a r i n b i n d i n gg r o w t hf a c t o r - 8 ) i n 19 9 0 ，m e d i c a ld e p a r t m e n to fw a s h i n g t o nu n i v e r s i t y f u r t h e rr e s e a r c h e da n df o u n dt h a tt h i sg r o w t hf a c t o rh a v en o tm a n i f e s ts e q u e n c e h o m o l o g yw i t ho t h e rs e v e nh e p a r i nb i n d i n gg r o w t hf a c t o r s ，a n dd u et oi t sn u m e r o u s b i o l o g i c a la c t i v i t i e s t a k e np l e i o t r o p h i na st h en a m ef o rt h i sg r o w t hf a c t o r p t ne n c o d e 16 8a m i n oa c i d sa n dh a v e5 0 s e q u e n c ei d e n t i t yw i t ht h es t r u c t u r a l l yr e l a t e dm i d k i n e p r o t e i n s ，t h e yb o t hc o m p r i s eh e p a r i nb i n d i n gf a m i l y , p t nc o d i n g16 8a m i n oa c i d s ，a n d t h es e q u e n c eo fe x i s t i n g5 0 m k ，h o m o l o g yc o m p o s e dh e p a r i nc o m b i n i n gb o t hs u p e r f a m i l y p t nw a sh i g he x p r e s s i o ni ns e v e r a ld i f f e r e n tt y p et u m o rt i s s u ea n ds e r u m i t h a v ep r o m o t em i t o s i sa n dp r o m o t ea n g i o g e n e s i sc h a r a c t e r i s t i c sa n dp l a ys i g n i f i c a n t r o l e si nt u m o rp r o g r e s s i o n ，a n g i o g e n e s i sa n dm e t a s t a s i s r e s e a r c hs h o w st h a tp t n 4 p r o t o nw a sr i c hc o n t e n ti nl u n gc a n c e a r l yc a nb ed e t e c t e di nt h ep l a s m aa n dr e l a t e d t ot u m o rs t a g e ，i n2 0 0 2 ，j a i e rs t u d i e da n df o u n dt h a ts e r u ml e v e l so fp l e i o t r o p h i no f l u n gc a n c e ra b o v et h o s eo fc o n t r o ls u b j e c t sb yu s i n gas p e c i f i ce l i s a t e s t ， f u r t h e r m o r e ，p l e i o t r o p h i ns e r u ml e v e l sc o r r e l a t e dp o s i t i v e l yw i t ht h es t a g eo fd i s e a s e a n di n v e r s e l yw i mt h er e s p o n s et ot h e r a p y o b j e c t i v e t od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f p t n p r o t e i ni ns e r u mo f l u n ga d e n o c a r c i n o m ap a t i e n t s b e f o r es u r g e r y ，t h e i rc o r r e s p o n d i n gl u n ga d e n o c a r c i n o m at i s s u ea f t e rs u r g e r y ，a n dl u n g a d e n o c a r c i n o m ac e l l sf r o m p l e u r a l f l u i da n dt od i s c u s st h er e l a t i o n s h i pa n d s i g n i f i c a n c e m e t h o d s 1 p a t i e n t sa n ds p e c i m e n s at o t a lo f5 0s e r u mo fl u n ga d e n o c a r c i n o m ap a t i e n t sb e f o r es u r g e r y ，t h e i r c o r r e s p o n d i n gl u n ga d e n o c a r c i n o m at i s s u ea f t e rs u r g e r y ， a n dm a l i g n a n tp l e u r a lf l u i d a n dr e l e v a n tc l i n i c a ld a t aw e r eo b t a i n e df r o mt h ed e p a r t m e n to fp a t h o l o g y , t h ef i r s t a f f i l i a t e dh o s p i t a lo fc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t yd u r i n gt h ep e r i o db e t w e e ns e p t e m b e r 2 0 0 8a n df e b r u a r y2 010 i na d d i t i o n ，2 0e a s e sn o r m a ls e r u m ，2 0c a s e sn o r m a lt i s s u e s a n d2 0c a s e sb e n g i np l e u r a lf l u i df o rt h ec o n t r o lg r o u p ，r e s p e c t i v e l y 2 i m m u n o f l u e n c e m o u s em o n o c l o n ep t n ( h - 6 ) ( s c 一7 4 4 4 3 ) a n t i h u m a na n t i b o d i e sw e r ep u r c h a s e d f r o ms a n t ai n e ，r a b b i tm o n o c l o n ep o l y c l o n a la n t i - h u m a nt r fla n t i b o d y , m o u s e m o n o c l o n ea n t i - h u m a nc k l9a n t i b o d y , m o u s em o n o c l o n ee c aa n t i h u m a na n t i b o d y a n dr a b b i tm o n o c l o n e p o l y c l o n a l a n t i h u m a nv i m e n t i n a n t i b o d y , s p i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yk i t ，d a bc l l | 的m o g e n i ce n z y m es u b s t r a t ek i tw a sp u r c h a s e d f r o mt h eb e i j i n gz h o n g s h a nc o r p o r a t i o n ，s t a i n i n ga c c o r d i n gt ok i ti n s t r u c t i o n s 3 w e s t e r nb l o t t h ec e l la n ds e r u mw i t h8 0 i t gt o t a l p r o t e i nc l e a v a g ep r o d u c t s w e r e10 5 s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i s1 5 h ，t h et r a n s f e rt op v d fm e m b r a n e ( 5 0 v , 2 h ) ，n o n f a td r y l i l i l l ( c l o s e da tr o o mt e m p e r a t u r e2 h ，w a s h e dt h r e et i m e sb yt t b s ，a n t i p t n m o n e c l o n a la n t i b o d y ( 1 ：10 0 ) 4 o v e r n i g h ti n c u b a t i o n , t h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e l a b e l e ds e c o n d a r ya n t i b o d ya t3 7 1 2f o r2 h , t t b sw a s h i n gt h r e et i m e se c l l i g h t t o p a c t i na si n t e r n a lc o n t r o l ，t oi b - a c t i na si n t e r n a lc o n t r o l ，c o m p a r e dw i t l lag r a yv a l u eo f e a c h 4 s t a t i s t i c a la n a l y s i s a l ls t a t i s t i c a lc a l c u l a t i o n sw e r ep e r f o r m e db ys p s sv e r s i o n13 0f o rw i n d o w s s o f t a r e , x 2a n a l y s i sw e r eu s e da si n d i c a t e di nt h et e x t pv a l u e sl e s st h a n0 0 5w e r e c o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t r e s u l t s l 、i nt h es e r u mo fh e a l t h yc o n t r o ls u b j e c t s ，t h e r ew e r en os p e c i f i c i t yb a n d sc o u l d b eo b s e r v e d ，b u tw ec a ns e es p e c i f i cb a n d si nt h es e r u mo fl u n ga d e n o c a r c i n o m a p a t i e n t s o ft h et o t a l ，s t a g ei vs e r u ml e v e l so fp t ne x p r e s s i o nf r o ml u n gc a n c e r p a t i e n t sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ns t a g eis e r u ml e v e l s 2 、t h ep o s i t i v er a t e so fp t n p r o t e i ni nl u n ga d e n o c a r c i n o m at i s s u ea f t e rs u r g e r y 4 0 ( 2 0 5 0 ) w e r eh i g h e rt h a nc o n t r o lo ( 0 2 0 ) t h ee x p r e s s i o no fp t nh a dn o r e l a t i o n s h i p w i t h p a t i e n t sa g e ，g e n d e r , d i f f e r e n t i a t i o nd e g r e e ，b u th a do b v i o u s r e l a t i o n s h i pw i t hc l i n i c a ls t a g ea n dl y m p hn o d em e t a s t a s i s ，t h e ya l l h a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) 3 、t h ep o s i t i v er a t e so fp t n p r o t e i ni nl u n ga d e n o c a r e i n o m ac e l l sf r o mp l e u r a l f l u i d 6 2 ( 31 5 0 ) w e r eh i g h e r t h a nc o n t r o l 0 ( 0 2 0 ) ，i t h a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) 4 、i nt h el u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l l sf r o mp l e u r a lf l u i ds e r u mo fh e a l t h yc o n t r o l s u b j e c t s ，t h e r ew e r er i os p e c i f i c i t yb a n d sc o u l db eo b s e r v e d ，b u tw ec a ns e es p e c i f i c b a n d si nb e n g i np l e u r a lf l u i d 5 、t h ep o s i t i v er a t eo fp t ni np l e u r a lf l u i d6 2 ( 31 5 0 ) w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r 6 t h a nt h a ti nt i s s u e4 0 ( 2 0 5 0 ) ，a n dt h ep o s i t i v er a t eo fp t n p r o t e i ni nt i s s u e4 0 ( 2 0 5 0 ) w a sh i g h e rt h a nt h a ti nb l o o ds e r u m l 8 ( 9 5 0 ) ，t h e ya l lh a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p 2 记为阳性( + ) ， 2 为阴性。p b s 代替一抗做阴性对照，已知阳性切片做 阳性对照； 4 、w e s t e r nb l o t 蛋白印迹 总蛋白从血清和胸水细胞中提取，冰上超生处理，4 静置，孵育5 0 m i n ，4 离心2 0 m i n ( 1 0 0 0 r m i n ) ，提取上清，用b r o d f o r d 法测定蛋白浓度，以每孔8 0 i lg 蛋白加入1 0 s d s p a g e 凝胶电泳后，4 c ，5 0 v 条件下湿电转移仪将蛋白 转入0 2 2l lm p v d f 膜，5 脱脂奶粉封闭液封闭2 h ，在分子量为1 8 2 5 k d 附近剪 开p v d f 膜孵育一抗( p t nl ：1 0 0 稀释) 4 c 过夜，x 底片曝光，显影，定影后拍 照，以1 3 - a c t i n 为内参，用凝胶成像及分析系统( b i o l m a g i n gs y s t e m s ，美国) 分 析蛋白各条带的灰度值，并取其与p a c t i n 的比值为相对表达量分析p t n 的表达 情况，每组结果均为相同条件重复3 次。 5 、统计分析 应用s p s s l 3 0 统计软件进行数据处理，采用穿检验( 不满条件时用f i s h e r 确切概率法) 分析各组计数资料，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 实验结果 一、血清中p t n 蛋白w e s t e r n b l o t 结果显示 如图l 所示，在肺腺癌患者的血清中可见有特异性条带，其中期肺腺癌患者 的血清p t n 蛋白表达水平明显高于i 期肺腺癌患者的血清p t n 蛋白表达水平。 12 3456 p t n l - - 1 8 k d a cti n - - - - 4 2 k d 图1 ，3 、5 条带代表正常献血者血清，1 、4 条带代表i 期肺腺癌患者血清， 2 、6 条带代表期肺腺癌患者血清 二、p t n 蛋白在肺腺癌组织中免疫组化结果显示 p t n 在肺腺癌组织中的阳性率为4 0 o ( 2 0 5 0 ) ，在癌旁正常组织中的阳性 率为o ( o 2 0 ) ，p t n 在肺腺癌组织中的阳性率高于癌旁正常组织( 尺0 0 1 ) ， p t n 阳性染色主要定位于胞膜和胞浆，如图2 所示，其中p t n 蛋白在i i i - i v 期肺 腺癌患者的组织中的阳性率为6 5 o ( 1 3 2 0 ) 、在i i i 期肺腺癌患者的组织中 的阳性率为2 3 3 ( 7 3 0 ) ；p t n 蛋白在有淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性率为 6 6 7 ( 8 1 2 ) 、在无淋巴结转移的肺腺癌组织中的阳性率为3 1 6 ( 1 2 3 8 ) ，差异均 具有统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。可见p t n 蛋白的表达与年龄、性别、分化程度无关， 与临床分期和淋巴结有无转移有关，如表1 所示。 1 2 图2 ，a p t n 在癌旁正常支气管上皮细胞中阴性表达。 在肺腺癌组织中阳性表达。s p 法，x2 0 0 s p 法x 2 0 0 ；b p t n 表1 ，在肺腺癌组织中p t n 蛋白的表达与临床病理学参数的关系 水：k 0 0 5 三、p t n 蛋白在肺腺癌转移胸水细胞中的免疫组化结果显示 在本研究中，首先我们将所收集的标本做了免疫细胞化学c k l 9 和t t f l 染色， 在我们所收集的5 0 例恶性胸水细胞中两者均呈强阳性表达，并结合临床证实我们 所收集的恶性胸水细胞标本均为肺腺癌转移至胸水所致的恶性胸水细胞，p t n 在 细胞膜和细胞桨中着色，呈强阳性表达，p t n 蛋白在恶性胸水腺癌细胞的阳性率为 1 3 一。 ， ，_ 、|；沁7： i l 岣斟。 x 豫飞气苌 k 憩，。菇蔷侈乏冀飞j_虻 6 2 ( 3 1 5 0 ) ，在胸水良性增生细胞中的阳性率为o ( 0 2 0 ) ，p t n 蛋白在恶性胸 水腺癌细胞中的阳性率高于胸水良性增生细胞中的阳性率( 氏o 0 1 ) ，如图3 所 示，其中a 、b 、c 、0 、f 图均来自于同一例患者，e 图为阴性对照。 ：鬻蓥 、：宅i 要：l f 面醋楚“糊 图3 ，a 恶性胸水腺癌细胞的液基细胞薄层涂片( t c t ) x4 0 0 ；b 恶性胸水 腺癌细胞的石蜡包埋细胞切片