（材料学专业论文）抗菌肽接枝丝素蛋白膜的制备表征及细胞毒性测试.pdf

浙江理t 大学硕七学位论文 摘要 桑蚕丝素蛋白由于其优越的力学性能、良好的生物相容性和生物可降解性，被人们视 为生物材料的理想材料。基于丝素蛋白为基质的材料在生物或医学领域的应用研究纷纷涌 现，比如丝素蛋白纳米纤维、丝素膜、丝素三维支架在细胞培养和生长因子传输等方面的 应用。更为重要的是，很多研究者致力于研究如何改进基于丝素蛋白的生物材料，通过提 高其某一方面的性能以用于特殊的用途。然而，在生物医用材料的临床应用中，由生物材 料引发的感染( b i o m a t e r i a lc e n t e r e di n f e c t i o n ，b c i ) 是其发展的一大障碍。为了避免植入材料 引起的感染，人们在生物材料表面处理方面做了很多研究。抗菌肽是由生物细胞特定基因 编码的一类小分子多肽，是宿主防御病源微生物入侵的重要分子屏障，其生成和释放是机 体炎症反应的组成部分。c e c r o p i nb 是一类存在于昆虫血淋巴的抗菌短肽，它们表现出强 烈的阳性特性，且为两亲性分子，结构呈现o 【螺旋状。c e c r o p i nb 抗菌肽不仅具有抗革兰 氏阳性细菌的作用，并且有抗革兰氏阴性细菌的作用。 本研究通过碳二亚胺法将序列为( n h 2 ) n g i v k a g p a i a v l g e a a l - c o n h 2 的c e c r o p i n b 抗菌肽共价接枝到桑蚕丝素膜表面，以制备一种具有抗菌性能的丝素膜。为了避免薄膜 在接枝过程中溶解，我们用不同浓度的乙醇溶液处理丝素膜，以使丝素的结构由不稳定的 丝素结构i 转变为丝素结构i i 。我们对制备工艺进行了优化探讨，发现抗菌丝素膜在抗菌 肽浓度为0 1 m g m l ，接枝时间为2h ，且接枝p h 为6 5 或8 时，有良好的抗菌性能；并且我们 利用红外光谱、扫描电镜、x 一射线能谱、原子力显微镜、接触角测试、x 射线光电子能谱 和抗菌测试等手段对制得的丝素膜结构、表面特性及其抗菌性能进行了测试分析。红外光 谱结果表明抗菌丝素膜二级结构是不溶性的b 片层结构；原子力显微镜结果表明抗菌丝素 膜表面粗糙度随着抗菌肽c e c r o p i nb 的接枝而不断增加；接触角测试表明抗菌丝素膜在抗 菌肽c e c r o p i nb 接枝后表现出较好的亲水性，而良好的亲水性是细胞黏附和增殖所必须的； 元素成分分析和抗菌持久性测试表明抗菌肽c e c r o p i nb 牢固地接枝到了不溶性丝素膜的表 面，且具有良好的、持久的抗菌性能。我们进一步对制得的抗菌丝素膜进行了体外细胞毒 性测试。测试结果表明，细胞可以很好地在抗菌丝素膜上黏附生长，与再生丝素膜相比没 有表现出显著的细胞毒性。这为植入材料表面改性以避免生物材料引发的感染提供了一种 新的思路。 关键词：桑蚕丝丝素蛋白膜表面改性抗菌肽c e c r o p i nb 抗菌性能 浙江理t 大学硕士学位论文 a b s t r a c t b o m b y xm o r i 僻m o r i ) s i l kf i b r o i np r o v i d e s a n i m p o r t a n t s e to fm a t e r i a lo p t i o n sf o r b i o m a t e r i a l sb e c a u s eo f i t s i m p r e s s i v e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s ，b i o c o m p a t i b i l i t y a n d b i o d e g r a d a b i l i t y l o t so fs t u d i e so ni t sa p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a la n db i o m e d i c a lf i e l d sh a v e e m e r g e ds u c ha sn a n o f i b e r , f i l ma n d3 dm a t r i xf o rc e l lc u l t u r ea n dd e l i v e r yo fg r o w t hf a c t o r s m o r e o v e r , s o m er e s e a r c h e sf o c u s e do nt h ep r e p a r a t i o no fm o d i f i e ds i l k - b a s e db i o m a t e r i a l si n o r d e rt oi m p r o v eac e r t a i na s p e c tp e r f o r m a n c ef o rt h es p e c i a la p p l i c a t i o n h o w e v e r , f o rt h e i m p l a n t e dm a t e r i a l s ，t h ei n f e c t i o nb yt h eb a c t e r i af r e q u e n t l yr e s u l t sa n di s o n eo ft h em a j o r c l i n i c a lc o m p l i c a t i o n s i no r d e rt or e d u c et h ei n c i d e n c eo fi m p l a n t - a s s o c i a t e di n f e c t i o n s ，s e v e r a l b i o m a t e r i a ls u r f a c et r e a t m e n t sh a v e b e e np r o p o s e d a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e si sa k i n do fs m a l ls i z e m o l e c u l a rp e p t i d e st h a ta r ee n c o d e db yas p e c i a lg e n e ，s t i l li si m p o r t a n tm o l e c u l a rp r o t e c t i v e s c r e e no ft h a tt h eh o s td e f e n dp a t h o g e n i cb a c t e r i au b v a d e r s c e c r o p i nbi sag r o u po fs m a l l a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sp r e s e n ti nt h ei n s e c th e m o l y m p h ，w h i c ha r es t r o n g l yc a t i o n i c ，a m p h i p a t h i c ， a - h e l i c a lp e p t i d e sa n da r en o t a b l ya c t i v en o to n l ya g a i n s tc e r t a i ng r a m 。p o s i t i v eb a c t e r i ab u ta l s o a g a i n s tg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a i nt h i sw o r k 丑m o r is i l kf i b r o i nf i l m s ( s f f s ) w e r em o d i f i e db yt h ec e c r o p i nba n t i m i c r o b i a l p e p t i d e ，( n h 2 ) 一n g i v k a g p a i a v l g e a a l - c o n h 2 ，u s i n g t h ec a r b o d i i m i d ec h e m i s t r ym e t h o d i no r d e rt oa v o i dt h ed i s s o l u t i o no ff i l m sd u r i n gt h em o d i f i c a t i o np r o c e d u r e ，t h es f f sw e r e f i r s t l yt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o la q u e o u ss o l u t i o n ，r e s u l t i n gas t r u c t u r a l t r a n s i t i o nf r o mu n s t a b l es i l kit os i l ki i t h ei n v e s t i g a t i o no fm o d i f i c a t i o nc o n d i t i o n ss h o w e dt h a t t h es u r f a c em o d i f i e ds f f sh a dt h es a t i s f i e da n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya n dd u r a b i l i t yw h e nt h e yw e r e a c t i v a t e dw i t ha n t i b a c t e r i a lp e p t i d es o l u t i o n ( 0 1m g m l ) b ye d c h c l n h ss o l u t i o nf o l l o w e d b ya t r e a t m e n ti nc bp e p t i d e p b sb u f f e r ( p n6 5o r8 ) s o l u t i o na ta m b i e n tt e m p e r a t u r ef o r2h t h es e c o n d a r ys t r u c t u r e ，t h ef i l ms u r f a c ep r o p e r t i e sa n dt h eb a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t yo ft h eo b t a i n e d s i l kf i b r o i nf i l mw e r ea n a l y z e dw i t h ，s e m ，e d s ，a f m ，c o n t a c ta n g l et e s t s ，x p sa n dt h e a n t i b a c t e r i a lt e s t s t h ef t - i rr e s u l ts h o w e dt h a tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h em o d i f i e ds f f si s a6 s h e e tc o n f o r m a t i o n t h ea f mr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es u r f a c er o u g h n e s so fs f f sw a s c o n s i d e r a b l yi n c r e a s e da f t e rt h em o d i f i c a t i o nb yt h ep e p t i d e s t h ec o n t a c ta n g l et e s t sr e s u l t s s h o w e dt h a tt h es u r f a c em o d i f i e ds f f ss h o w e dt h es m a l l e rc o n t a c ta n g l ed u et ot h eh y d r o p h i l i c a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc o u p l e do nt h ef i l ms u r f a c e ，w h i c hi se s s e n t i a lf o rt h ec e l la d h e s i o na n d p r o l i f e r a t i o n t h ee l e m e n t a lc o m p o s i t i o na n a l y s i sa n dt h em o d i f i e d s f f sa n t i b a c t e r i a lp r o p e r t y t e s t sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ep e p t i d e sw e r et i g h t l yc o u p l e dt ot h es u r f a c eo fs f f s a n dt h ei n i i 浙江理工大学硕士学位论文 v i t r of i b r o b l a s tc e l lc u l t i v a t i o nw a sa s l op e r f o r m e d ，w h i c hs h o w e dt h a tt h ea n t i b a c t e r i a lp e p t i d e m o d i f i e ds f m sh a dt h es a t i s f i e dc e l la d h e s i o na n dc e l lp r o l i f e r a t i o np r o p e r t i e s ，a n dn oo b v i o u s c y t o t o x i c i t y w a sd e t e c t e d t h i sa p p r o a c hm a yp r o v i d ean e wo p t i o nt o e n g i n e e r t h e s u r f a c e - m o d i f i e di m p l a n t e dm a t e r i a l sp r e v e n t i n gt h eb i o m a t e r i a lc e n t e r e di n f e c t i o n ( b c i ) k e y w o r d s ：b o m b y xm o r is i l k ；s i l kf i b r o i nf i l m ；s u r f a c em o d i f i c a t i o n ；a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e c e c r o p i nb ；a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ； 1 1 1 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 栅1 珈 同期：7 , , i r t 年，月以f t 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保密、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密d 。 学位论文作者签名：乃砰1 三b 日期：阿年，月西r 指导老师签名：舍谚毛鼽 日期：彬月册 浙江理工大学硕+ 学位论文 第一章绪论 桑蚕丝素蛋白是一类综合性能优良的结构性高分子材料，除了被用于传统的纺织原料 外，丝素蛋白凭借其良好生物相容性，独特的力学性能以及多样的侧链化学修饰位点，在 化妆品、食品、制药、新材料等领域正被不断地得到开发和利用【m 】。近年来，许多研究者 在以丝素蛋白为基材的组织工程开发方面做了许多有益的探索。另一方面，研究者以丝素 蛋白为基材，对其进行生物和化学的改性后，使其在某些方面的性能得到了大幅度提高。 然而，在医用材料的实际应用中，由生物材料引发的感染( b i o m a t e r i a lc e n t e r e di n f e c t i o n ， b c i ) 是其发展的一大障碍。这些感染给患者在身体上和经济上都造成很大的负担，并限制 了生物植入材料更广泛的应用。因此，生物材料表面抗菌性能的研究已经成为当前研究的 热点。本研究利用化学接枝法将一种抗菌性能较好，对细菌无抗药性，对哺乳动物细胞无 害的抗菌肽接枝到丝素蛋白膜表面，从而制得一种具有抗菌性能的丝素膜。 以下概述了桑蚕丝素蛋白的结构与性能及其在生物医学上的研究与应用；抗菌肽的结 构及其性能；生物材料表面改性及生物材料引发的感染和本研究的立题依据和研究目的。 1 1 丝素蛋白及其研究概况 1 1 1 丝素蛋白的结构与性能 天然桑蚕丝中占总量7 0 8 0 是丝素蛋白，它是一种含1 8 种氨基酸的天然高分子纤维 蛋白，而其中8 0 以上的是带有d , 倾j j 基的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，这些氨基 酸残基构成了丝素蛋白的结晶区，约占结晶区总组成的8 5 1 4 , 5 1 ；而带有较大侧基的苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非结晶区。结晶区与非结晶区交替分布，其中的肽链沿 着纤维外形的延伸方向排列。其具体氨基酸的含量如表1 1 所示。 t a b l e1 1a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f b m o r is i l kf i b r o i n 浙江理r 丁大学硕+ 学位论文 丝素蛋白的主要构成是三个亚单位【6 ，7 j ：h 链( 约5 1 1 2 个氨基酸残基，分子量3 5 0k d a ) ， l 链( 约2 4 4 个氨基酸残基，分子量2 5 8k d a ) ，糖蛋i 刍p 2 5 ( 2 0 3 个氨基酸残基，分子量2 3 5 5 k d a ，附加3 个寡糖链1 ，分子比h ：l ：p 2 5 为6 ：6 ：1 。结晶区与非结晶区交互排列构成h 链， 它与l 链由各自c 末端的二硫键相互连接，形成复合体h l ，p 2 5 糖蛋白以非共价键参与h l 复合体，这样就形成了丝素的基本单位，其分子量大约2 2 8 6k d a 。 丝素蛋白通常可以形成三种构刻8 ，9 】，即a 螺旋，b 折叠和无规线团。在这三种构象中， b 折叠片层的形成相对较容易，形成之后又很稳定，这是丝素蛋白纤维高强度和高弹性模 量的主要原因。在一定的化学条件下，丝素分子会发生上述构象之间的相互转变。 1 1 2 丝素蛋白在生物医学上的研究和应用 丝素的主要构成是甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，极易形成反平行的b 折叠片层结构，使 得丝素蛋白纤维具有良好的热稳定性和机械性能。丝线最早的生物医学应用是作为手术缝 合线，这体现了其良好的力学性能和生物相容性。丝素蛋白应用于生物医学领域的优点在 2 浙江理工大学硕士学位论文 于【1 0 1 3 】： ( 1 ) 在外科领域有着悠久的应用历史，对生物体无危险性，在体内外可缓慢降解； ( 2 ) 相比其它天然纤维和许多高性能的合成纤维，有着独特的力学性能； ( 3 ) 可以通过某些氨基酸的氨基和侧链等的化学修饰改变其表面性能； ( 4 ) 可以通过不同的处理方法获得膜和其它的形状。 1 1 2 1 手术缝合线 丝纤维是由丝素蛋白组成，这类纤维具有很强的抗拉强度，手术缝合线是蚕丝纤维最 早、也是最为成熟的医学应用。其优点在于：丝纤维缝合线细度小，拉伸强度大，易打结 且结头不易散开，同时具有良好的生物相容性。把它编结成细小的丝线并且消毒以后，就 可用作心血管、眼科、神经学以及显微外科和整形外科上的手术缝合线【1 4 】。t a z z e o 等【1 5 】研 究了在生理缓冲液中，丝缝合线的力学性能，他们发现，丝线暴露在一定的溶剂中会发生 相应的收缩，为丝素在临床上的选用提供了实验依据。 1 1 - 2 2 人工皮肤 由于丝素蛋白良好的生物相容性和力学性能，而且对皮肤刺激小，可防止感染，在体 内降解无毒，经过一系列处理后完全可以达到理想创面敷料的要求【1 6 】，丝素蛋白对成纤维 细胞，皮肤表皮细胞的粘附性优良，同时能避免体液流失。目前已经开发了丝素多孔创面 的保护膜，加入抗菌药物可以清除细菌，控制感染【1 7 】。 1 1 2 3 软骨修复材料 对于由外伤或者老化衰退造成的软骨损伤，成人的自我修复能力很弱。而以细胞培养 为基础的三维多孔支架材料的开发，为软骨组织的修复提供了光明的应用前景【1 8 。2 0 】，它不 仅提供了临床移植所需的安全而充足的组织替代资源，同时为研究细胞和病理提供了可控 的系统。 由于众多老年人极易发生骨组织老化衰退，软骨和骨修复组织工程的研究和开发显得 非常必要，具有广阔的市场前景【2 1 2 2 1 。而为骨髓基质细胞选择合适的培养支架，对促进细 胞的粘附、迁移、分化和物质传递，以及组织的力学完好性就显得至关重要。间叶干细胞 ( m s c s ) 和软骨细胞是软骨组织的两大主要细胞来源，天然丝素蛋白由于其可降解，生物相 容性良好，力学性能独特，同时加工性能良好，理所当然成为了制备骨组织工程修复支架 3 浙江理上人学硕士学位论文 材料的理想原料之一【2 3 。2 5 】。w a n g 等1 2 6 】将软骨细胞( h c h s ) 与水相多孔丝素支架相结合，进行 体外软骨组织的构建，其结果与用间叶干细胞( m s c s ) 进行软骨组织重生的结果进行对比后 发现，利用不同细胞源与丝素支架构建的软骨组织都具有令人满意的结果，显示了丝素支 架用于骨修复的巨大潜力。最近，该研究组还发明了一种以全新的水相系统来制备具有多 孔结构，其形态以及力学性能可控的丝素支架，该支架有着类似于海绵结构的可延展性，孔 隙更均匀，表面更粗糙，机械性能更良好，降解过程可控性更强。这种新的多孔支架材料 已经被成功的用来进行体外m s c 细胞的软骨组织重生【2 。7 1 。 1 1 2 4 药物释放载体 丝素蛋白制成的膜或凝胶具有一定的药物透过性，有用作药物缓释体胶囊的潜力。通 过调节丝素膜外部p h 值来调控离子化药物在丝素膜上的透过速度，丝素膜的多孔尺寸也可 以成为调节药物释放速度的参数。 1 1 2 5固定化载体与生物传感器 再生丝素膜是良好的酶固定载体f 矧，因为再生丝素膜属于两亲的弱电解质半透膜，固 定作用强，且不用任何化学试剂处理，热安全性好。该技术已经被应用在研制快速测定体 液中某些特殊成分的生物传感器，包括葡萄糖传感器【2 9 】，神经递质传感器以及生物发光传 感器等【3 0 】。 1 1 2 6 细胞培养基质 丝素蛋白在溶剂中一般会发生不同程度的水解，主要是由于蚕丝蛋白的非晶区中的氨 基酸残基含有相当多的o h 、c o o h 、和n i l 2 , 等极性基团，使得再生丝素膜具有较好的亲 水性，且其本身存在着一些特别的氨基酸序列，可参与细胞问的相互作用，因此，丝素蛋 白材料对体外培养的动物细胞有良好的吸附作用，包括表皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞 和角质细胞等，具有非常良好的细胞附着率和增殖率，能维持良好的细胞正常形态和功能 【3 1 1 。m i n o u r a ：等【3 2 】观察了小鼠成纤维细胞l - 9 2 9 在桑蚕丝素膜和野蓟n t h e r a e ap e r n 丝素膜 上的粘附、扩散和分化，并对比了该细胞在胶原蛋白膜上的情况后发现，丝素蛋白膜具有 和胶原蛋白膜相类似的效果。这主要是因为丝素蛋白中包含有利于细胞粘附的带正电荷的 氨基酸残基，比如c 端的精氨酸；同时也发现，f l ；t a f e r n y i 野蚕得到的丝素膜比桑蚕丝素膜 更具有良好的细胞粘附性，因为野蚕丝蛋白中存在细胞粘附识别的一个特定位点，即 4 浙江理工大学硕十学位论文 a r g - g l y - a s p ( r g d ) 序列，而桑蚕丝蛋白中并不存在该序列。 1 2 抗菌肽的研究进展 目前在临床上使用的抗菌素药物是已经使用了好多年抗生素药物的衍生物。由于微生 物具有较强的进化和适应能力，目前还没有发现一种不产生抗药性的抗生素，绝大部分只 要一应用于临床，就立即产生抗药性，因而耐药性成了现在抗生素使用过程中最大的问题。 抗菌肽是一类抗菌能力强、抗菌谱广、不易产生耐药性的功能多肽，是一类理想的抗生素 替代物。 1 2 1 抗菌肽的发现 抗菌肽是由瑞典科学家b o m a nh g 在1 9 7 2 年首先发现的1 3 引。以惜古比天蚕( h y a l o p h o r a c e c r o p i a ) 蛹作材料，注射蜡状芽抱杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 诱导而产生的一种碱性多肽物质， 并定名为c e c r o p i n s 3 4 j 。此后人们便相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动 物乃至整个人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽 对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而也命名为“a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ”，简称“a b p ”1 3 5 】。 大量的研究资料表明，昆虫在外界因素的作用下，可产生防御性的抗菌肽物质，在这些抗 菌物质中，最引人注目的是具有广谱抗菌活性的抗菌肽。现在已从昆虫分离得到抗菌肽有 1 5 0 多种。国内外的研究证吲3 6 1 ，抗菌肽不仅存在于昆虫体内，从细菌到哺乳动物均存在 这一类防御性多肽。所以抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽，其生成 和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。 1 2 2 抗菌肽的分类及理化性质 抗菌肽具有高度的水溶性，在水中形成易弯曲的自由螺旋。分子量大约4 0 0 0 道尔顿 左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在1 0 0 下加热1 0 1 5m i n 仍能保持其活性，郭玉梅 等【3 7 】用大肠杆菌ec o l i 诱导的家蚕血淋巴中提取的抗菌肽经高温、高压处理3 0m i n 后仍 保持原有活性。多数抗菌肽的等电点大于7 ，表现出较强的阳离子特征。同时抗菌肽对较 大的离子强度或较低的p h 值均具有较强的抗性。 抗菌肽的结构与功能密切相关，来自不同物种的抗菌肽分子结构有一定的差别，因此 生物学功能及活性也有一定的差异。其分子构型不论是a 螺旋或是b 折叠，都有一个共同 的特性就是都具有两亲性。按分子结构及功能特征可将其分为4 类。 5 浙江理丁大学硕十学位论文 ( 1 ) a 螺旋结构类此类抗菌肽分子量约4k d ，不含半胱氨酸，不形成分子内二硫键， n 木端区域富含亲水性碱性氨基酸残基，如赖氨酸和精氨酸，所带f 电荷有利于与细菌膜 上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附到细菌膜上；c 末端含较多的疏水性氨基酸残基，疏水 性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。分子的两端各形成一个两亲性a 螺旋， 两个a 螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，这种a 螺旋是破坏、裂解细菌的主要结 构，当抗菌肽结合到细菌细胞膜上时，a 螺旋相互聚集使细胞膜形成孔洞，细胞质外溢而 致细菌死亡。 ( 2 ) 伸展性螺旋结构类该类抗菌肽不含半胱氨酸，但富含脯氨酸和精氨酸和色氨酸 等，由1 5 3 4 个氨基酸残基组成，在两性分子内部形成分子内的a 螺旋。 ( 3 ) 环链结构类 该类抗菌肽在c 末端有一个分子内二硫键，在c 末端形成一个环链 结构( 1 0 0 ps t r u c t u r e ) ，而n 未端为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的b r e v i n i n s 和b a c t e n e c i n 属于此类。这一类抗菌肽有较强的抗菌活性。 ( 4 ) b 折叠型该类抗菌肽是在分子内有2 6 个二硫键的抗菌肽类，分子量约为4 6 k d 。有代表性的是动物防御素( a n i m a ld e g e n s i n ) ，可分为a 型和b 型两种。 1 2 3 抗菌肽的作用机制 抗菌肽分子通过其两亲性a 螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的 静电吸引而结合在质膜上。紧接着抗菌肽分子的疏水段借助分子中的连接结构的柔性，随 即插入到质膜中，之后抗菌肽分子两亲a 螺旋也插入到质膜中。这样在膜内分子间形成离 子通道，使细菌细胞膜的内容物特别是k + 的泄漏，不能保持正常的渗透压而死亡【3 8 】。但有 人曾对上述通道机制提出了不同的看法。g a z i te 等【3 9 】依据其通过衰减全反射傅立叶变换红 外光谱和分子动态模拟等手段得出的实验结果表明，抗菌肽只是结合到了单位膜的表面 上，并未见到抗菌肽插入膜中，更未形成通道。所有观点的共同点都是抗菌肽首先作用于 细菌细胞质膜，最终导致膜的通透性增大。这是抗菌肽杀菌性能最独特的一面。对于肿瘤 细胞及其它病原菌，抗菌肽首先作用于靶病原物的外膜，破坏内膜系统以及细胞器，破坏 核膜，使病原物的d n a 断裂、破碎。关于抗菌肽抗菌机制的研究，学者们做了许多实验 工作。s t e i n e r 等【4 0 】用脂质体作模型，结果发现若脂质体所带净电荷为负值，抗菌肽就容易 结合到细胞上，膜被破坏。这说明了抗菌肽分子带一定的正电荷。若减少抗菌肽n 端的a 螺旋，则降低其破坏膜的能力。 从目前的研究结果来看，一般认为抗菌肽的杀菌机理主要作用于细菌的细胞膜，破坏 6 浙江理上人学硕士学位论文 其完整性并产生穿孔现象，造成内容物溢出而导致细胞死亡。又有学者认为抗菌肽作用于 膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致细菌细胞死亡；亦有学者提 出抗菌肽是否存在特异性的膜受体及有无其它离子的协同作用等问题。不同类别的抗菌肽 的作用机理可能不一样。 抗菌肽杀死细菌的方式还没有完整的理论和研究给予概括总结。己知至少有5 种方法 来研究抗菌的作用机制1 4 1 】：( 1 ) 用已知功能的抗菌肽与膜作用，使膜的通透性发生变化， 或使d n a 和蛋白质的生物合成发生变化。( 2 ) 通过改变细菌的氨基酸缺失突变以改变抗菌 肽作用的靶位。( 3 ) 改变其结构，合成新的抗菌肽类似物，如用d 型氨基酸取代l 厂氨基酸 合成抗菌肽。( 4 ) 利用生物物理手段( 如用人- r $ u 备的膜) 来证明离子通道的形成及膜电位的 消失。( 5 ) 用脂质体或线粒体作活细胞的模型系统，从而研究抗菌肽的作用机理。用上述 一种或几种方法结合起来进行研究。不同类型的抗菌肽作用机理可能不一样。w a d e 等【4 2 】 用d 型氨基酸合成4 种具有a 螺旋结构的c e c r o p i n 类似物，与天然抗菌肽( l - 型氨基酸组 成的肽1 进行活力比较，发现具有相同的抑菌活性。c d 谱显示，d 型对映体形成左手螺旋 而天然抗菌肽形成右手螺旋，两种对应体与膜相互作用无立体专一性，进而推论膜上无抗 菌肽的受体。然而新近c a s t e e l s 等【4 3 】用d 型氨基酸合成的a p i d a e c i n 对所测的细菌无作用， 由此推论这类富含p r o 的抗菌肽有膜受体。抗菌肽对活细胞如何作用，有无其它因子协同， 迄今还很不明晰。m e r r i f i e l d 纠4 4 l 提出，当抗菌肽与细胞膜疏水区接触时，整个分子( 从n 端到c 端) 诱导出两亲螺旋( 图1 1 ) 。杀菌过程可能首先是抗菌肽端的带电氨基酸与细胞膜 的极性基团静电吸引，并形成螺旋沿着螺旋轴旋转，嵌入细胞膜，破坏膜的有序结构，这 个模型要求不仅n 端而且整个肽链形成两亲螺旋与细胞膜作用。此假说的主要根据是用圆 二色谱观察到抗菌肽在水溶液中呈无规则卷曲，在疏水环境中呈a 一螺旋。 卜a m p l l i p a t l f i c ( 1h e l i x 一 h y d r o p h o b i cp e p t i d es m s a c e a q u e o u sp h a s e m e m b r a n e f i g u r e1 1s p e c u l a t i v em o d e lf o rt h ei n t e r a c t i o no fab a c t e r i a lm e m b r a n ew i t hac e c r o p i na n a l o g c o n t a i n i n ga na m p h i p a t h i ch e l i xf o ri t se n t i r el e n g t h f i n k 等【4 5 1 根据理论计算与实验结果预测，则认为抗菌肽端( 1 1 1 ) 形成两亲螺旋，中间 部分( 1 2 2 4 ) 形成弹性转角，c 端易形成疏水螺旋( 图1 2 ) 当抗菌肽作用于细胞膜时，c 端疏 7 水螺旋插入脱中n 端两亲螺旋结合在膜表面，中间有一个弹| 生转角相连 d r 一p h g i c 、刊e n r e f l e x i b l eb e n d 。1 吼1 il 、r n 、d l o i o l 叽l e t 】i 、 f i g u r e1 2s p e c u l a t i v em o d e lf o rt h ei n t e r i a lm e m b r a n ew i t hac e c r o p l n m o l e c u l ec o n t a i n i n gac e n t r a l h i n g e ”g i o n c h r i s t e n s e n 等等川脂积垲更加1 1 f 圳的描述r 抗茼脑作用于膜的过群。斤先址抗蔺肽 通过静电作州被吸引剑膜的表而，然后疏水性尾巴插 细胞膜中的疏水区域，皿过改，叟膜 f 构象，多个抗菌肚聚合体存膜r 形成离r 通道，见h13 。 f i g u r e l 3 t e n t a g v e m o d e l f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t ha l i p i d b i l a y e r m e m b r a n ea g g r e g a t e sa d s o r h t i d c b i l a y e rw a t e ri n t e r f a c eb ye l e c t r o s t a t i cf o r c e 】- o n l yad i m m e r i ss k e t c h e d f o r i h cs a k eo fs i m p l i c g yb u t l a r g e ra g g r e g a t e sa r o l i k e l y t oo c c u r t h en c x is t e p ； 1 1w o u l db ei n t e r a c t i o no f 【h ch y g r n p h o b i cs e g m e n tm l nt h em e m b r a n ec e ) mu p o na p p g c a t i o no fv o l t a g e ( p o s i t i v eo o t h es i d eo f p e p t i d ea d d i t i o n ) ，a ”o rc o n f o 丌n a t l o n a lr e a r r a n g e m e n t t a k ep l a c e ； i l l - w h i c hr e s u l t si nc h a n n e lf o r m a t i o nt h i sr e a r r a n g e m e n lc o u l db ci n s e n l o no ft h ep t ，s g i v e l vc h a r g e d a m p h l p a t h i ch e l i x i n t o t h e m e m b r a n eo ro p e n i n g o f p e r f o r m e d ，c l o s e dc h a n n e l c l a g u c 等4 7 幌出抗苗肽的另一个作用模型，认为抗菌肽作用r 膜的蛋白质，引起蛋白 凝聚、失活，并形成离了通道，造成渗透压丧失，见图1 4 。 辫 聱 ? h ，、：| h ，c ，一、。鬻! 珏i 一 。l ，。：j fv j ! ?寸一。o j 遍：， _ ：；i 下 f i g u r e l 4s c h e m a t i cr c p r e s e n t a t i a no f p o s s i b l e m e , i n so f i n t e g r a lp r o t e i na g g r e g a t i o nb y m c l i t t l n l h eh e l i c a l s e c t i o no f m e l i t t l nd r a w np e r p e n d i c u l a r i o t h e m e m h r a n eo n l y t oe m p h a s i z e i t sa n c h o r i n gr o l e 2 4 抗卣呔的药理作用段应用前景 ( 1 ) 广谱抗卣话性：抗茼肽的抗蔺l 普较传统抗牛素宽，传统抗生素通常只对细菌有效， 向埘真菌、病毒等病臆体无效。来自昆虫、猜、蛙、人等的抗菌胍既有抗革。氏阴降菌和 革兰氏阳性菌作用，义有抗真菌、抗病a i - 作用【”i 。抗曲肽小仪自身具有良好的抗菌活性， 小川抗菌肽或与传统抗牛索联用，还可提尚抗茼肽和传统抗， 素的药物疗效，甚平拓宽传 统抗生豢的抗荫谱。 ( 2 ) 抗病毒活性：研究发现煳芽瘦蛾幼虫的t f j l 淋巴对多种d n a 、r n a 病毒有明显的抑 制作用，使病毒的感染力降低；lr t t 性粒细胞防御嚣h n p ix , j 疙疹痫毒有抑制作h j ，亚恤 得注意的是，w a c i n g e r m 等的研究结果表明，蜂毒袭和天蚕奈叫以存弧毒性浓度f 抑制 爱滋病毒h i v l 的基因表达，减少h i v l 的增贿。 ( 3 ) 抗肿瘤活肚：刖】| 留细胞的细胞骨架系统不发达，抗苗肽易插入细胞脂膜形离子通 道，破坏肿瘤细胞。夫责索、爪蛙素、鼠抗菌肽n p i 和n p 2 及人抗菌肽h n p i 均表现出对 肿痈细胞如纤维瘤绌胞、宫颅癌细胞、肺癌细胞等的杀伤活【生。， ( 4 ) 促进伤i 】愈合：抗苗肽能刺激纤维毋细胞、淋巴细1 胞和血管内皮细胞的增殖，促 进创面内芽组织的增生，加快刨而的愈合。分别川抗苗肽c y t o p o r i n 和磺胺嘧啶钺制成的软 膏治疗小鼠烧伤，c y t o p o r i n 组愈合快，疤痕小，磺胺嘧啶银虽然创面感染得到了控制，但 创而愈含较慢，疤痕也大。 山丁天然抗菌肽具有抗细苗、真菌、病毒和肿蝻细胞而不破坏人体r 常细胞的特殊功 效，如能 h 好地开发利用有望给医学、药学、食品加f 等领域带来广阔的开发利用前景。 不同种类抗菌肽其抗菌衍性和抗菌谱既有相似之处，也存在很大的差异，因此寻找高效广 谱的牛物抗菌肽，一直是广大临床医生和科研工作者努力的方向。 1 , 2 5 c e c r o p i n 类抗博肚 陛k 域，c 端仃较长的晓水匣、j _ 嘴抗曲。刚内外学肯从戈囤火盈( 1 1 y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 、 中硼柞蚕( a n t h e r a e ap e r n y i ) 、家蚕 5 2 1 ( o m b y xm o r i ) 、h 本家歪 5 3 1 ( l c t i d o p t e r a n ) 、果蝇 削( d ， 删。山) 以及猪小肠例l 卜1 分离纯化j 多利一c e c r o p i n 雀抗茼h 上川洲定r 缎结构。s i l k 吊的抗衙 赢坫吲结构如灭蚕壮口= 】组l 卜】有3 个c c c r o p i n 壮冈，果l 避有4 个c e c r o p i n 皋月。 苗队原( p r e p r o p r o t c l n ) 禽铂6 2 6 4 个氨旌酸残堆m 4 “，其柏 个保守的信号肽和个前序列。 拳r 鼍吣。，氏五 ：祷 k t 盏一 汐。 1 3 生物医用材料表面改性 1 3 1 表面化学接枝 生物医用材料作为植入材料，使用时主要考虑其生物相容性，即材料表面与宿主之间 界面上的相互作用。因此对植入材料的改性主要是对其表面的改性。仪限于材料表面发生 浙江理工人学硕士学位论文 的非均相反应。接枝单体可以时气相或液相，其中液相单体对高分子材料不能由太好的溶 解性。为达到只在表层进行选择性接枝，必须控制自由基的数量或浓度，或者控制好单体 的扩散与渗透仅限于表面层发生。区别于传统的聚合物接枝，表面接枝产物因其表面和本 体结构不同，只是一种表面改性的复合材料。 1 3 2 偶合接枝 通过偶合接枝，将现成的高分子接枝到材料表面上。要求医用材料表面及要偶合接枝