（环境科学专业论文）多氯联苯的酶联免疫吸附分析.pdf

山东师范大学硕士学位论文 以建立的e l i s a 检测方法对添加在土壤和水样中的样品进行回收，测定p c b 7 7 在土 壤中的添加回收率为1 0 9 1 4 6 ，三个平行的变异系数在5 o o 1 1 7 7 之间，在水样中的添 加回收率为8 4 一9 8 ，三个平行样的变异系数在2 8 4 7 7 5 之间。 综合分析，本研究成功制备了p c b 7 7 的人工抗原，经动物免疫获得了高效价的抗血清， 可用于建立p c b 7 7 的间接e l i s a 方法。经优化，建立了p c b 7 7 的标准曲线，与结构类似 物的交叉反应不明显，可以用于含有p c b 7 7 的环境样品的初筛选，为研究和开发p c b 7 7 的e l i s a 试剂盒奠定了基础。 关键词：半抗原；免疫原；多克隆抗体；抗体纯化；酶联免疫吸附分析 中图分类号：x 8 3 5 i l 山东师范大学硕士学位论文 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yf o rp o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s a b s t r a c t p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) a r eo n eo ft h ep e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t sw h i c ht h e u n i t e dn a t i o n se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o nd e p a r t m e n ti sc o m m i t t e dt oe l i m i n a t e a c c o r d i n gt o w h os t a t i s t i c s ，t h e r ea r e2 x10 7 tp c b sf r o mi n d u s t r ya r o u n dt h ew o r l d ，o fw h i c ha b o u t3 0 w e r er e l e a s e di n t ot h ee n v i r o n m e n t p c b sh a v e w i d e l yd i s t r i b u t e da r o u n dt h ew o r l da s e n v i r o n m e n tp o l l u t a n t s ，w h i c hc o n t e n ti sf r o mp p tt op p m s of a r , t h em o s tc o m m o n l yu s e d m e t h o dt o a n a l y z ep c b si s h p l c t h i sm e t h o dr e q u i r e sc o m p l e xs a m p l ep r e t r e a t m e n t p r o c e s s e s ，s o p h i s t i c a t e dd e t e c t i o ne q u i p m e n t s ，g o o de x p e r i m e n t a le n v i r o n m e n ta n dw e l l t r a i n e d o p e r a t o r s ，w h i c hl i m i ti t sa p p l i c a t i o n c o m p a r ew i t hh p l c ，e l i s ah a st h ea d v a n t a g e st h a t s a m p l ep r e p a r a t i o ni ss i m p l e ，s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t ya r eh i g h ，c o s ti sl o wa n dc o u l db eu s e dt o d e t e c tt h ep c b si nt h es c e n e t h e r e f o r e ，c a r r y i n go u tt h ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) s t u d yo fp c b sh a si m p o r t a n tp r a c t i c a lv a l u e p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l sa r eg e n e r a la r t i f i c i a lo r g a n i cc o m p o u n d sa n dt h e i rh y d r o g e n so n b i p h e n y l sa r er e p l a c e db yc h l o r i n ea t o m sa td i f f e r e n ed e g r e e s ，w h i c hh a v e2 0 9k i n d so f h o m o l o g u e t h i sr e s e a r c hs e l e c e dr e p r e s e n t a t i v ec o p l a n a rp c b 7 7t os t u d yi t se l i s am e t h o d ， c h o s e3 , 4 一d i c h l o r o p h e n y la c e t i ca c i dw h i c hh a da c t i v eg r o u pa n ds p e c i f i cs t r u c t u r eo fp c b 7 7a s t h eh a p t e n 3 ，4 - d i c h l o r o p h e n y la c e t i ca c i dw a sc o u p l e dw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) b y n - h y d r o x y s u c c i n i m i d ea c t i v ee s t e rm e t h o dt op r e p a r et h ei m m u n ea n t i g e nd c p b s aa n dt h e c o u p l i n gr a t ew a s2 3 ：1 a na n t i 一3 , 3 。，4 ，4 - t e t r a c h l o r o b i p h e n y l ( p c b 7 7 ) p o l y c l o n a la n t i b o d yw a s s u c c e s s f u l l yo b t a i n e db yi m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t hd c p - bs a 3 , 4 - d i c h l o r o p h e n y la c e t i c a c i dc o n j u g a t e dw i t ho v a l b u m i n ( o v a ) t of o r mc o a t i n ga n t i g e n sb ym i x e d a n h y d r i d em e t h o d a n dt h er e s u l tw a s8 ：1 t h er e s u l to fb o u b l ei m m u n o d i f f u s i o ne x c e e d e d1 ：16a n di n d i r e c te l l s a d e t e c t i o n ss h o w e dt h ea n t i s e r u mt i t e rr e a c h e do v e r1 ：2 0 0 0 0 ，w h a ts a t i s f i e dt h er e q u e s to fe l i s a a n a l y s i st e c h n i q u e t h e nt h ea n t i s e r u mp u r i f i e db yc a p r y l i ca c i d a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n m e t h o d w o r k i n gp a r a m e t e r so fi n d i r e c te l i s at e c h n i q u ef o rd e t e c t i o no fp c b 7 7w e r eo p t i m i z e d ， i n c l u d i n gs e l e c t i o no fc o a t i n gm e t h o d ，o p t i m u md i l u t i o nr a t i oo fa n t i s e r u ma n dm e d i u m 1 1 1 山东师范大学硕士学位论文 m e d i a t i o n a ni n d i r e c te l i s ad e t e c t i o nm e t h o df o rp c b 7 7w a sd e v e l o p e d ，i nw h i c hi n h i b i t i o n r a t i o nc l o s e l yr e l a t e st ol nv a l u eo fp c b 7 7c o n c e n t r a t i o na n df i t t e di n t ot h ee q u a t i o n ，y = - 0 13 7 0 l n ( x ) + 1 0 4 3 ，w h e r eyw a si n h i b i t i o nr a t i oa n dxr e p r e s e n t st h ec o n c e n t r a t i o no fp c b 7 7 ， c o e f f i c i e n to fd e t e r m i n a t i o nr 2 - - 0 9 9 3 0 d e t e c tc o n c e n t r a t i o n sr a n g e df r o m0 7 5 n g lt o3 0 0 n g l t h ec r o s s r e a c t i o no fa n t i d c p b s at ot h e i rc o r r e s p o n d i n ga n a l o g sw a st e s t e d t h e c o n c e n t r a t i o no fp c b 7 7w a s8 2 2 6 n g m lw h e nt h ea n t i b o d y a n t i g e nr e a c t i o nw a sh a l fi n h i b i t i o n t h es a m e e q u i p m e n t s w e r em a d e ，h a dt h er e s u l t st h a tc o n c e n t r a t i o no fp c b12 6w a s 2 7 0 4 3 n g m l ，t h ec r o s sr e a c t i v i t yw a s3 0 4 ，t h ec o n c e n t r a t i o no f3 , 4 一d i c h l o r o p h e n y la c e t i c a c i d8 9 7 8 4n g m l ，t h ec r o s sr e a c t i v i t yw a s9 1 ，t h ec o n c e n t r a t i o no f2 ，4 一dw a s2 2 2 2 1 n g m l ，t h ec r o s sr e a c t i v i t yw a s3 7 ，t h e c o n c e n t r a t i o no ft r i c h l o r o a c e t i ca c i da b o v e 8 0 0 0 n g m l t h ec r o s sr e a c t i v i t yw a sb e l o w0 1 r e c o v e r i e so fp c b 7 7i n s o i ls a m p l e sr a n g e df r o m1 0 9 - 1 4 6 w i t hc 。矿形o f5 0 0 - 11 7 7 r e c o v e r i e so fp c b 7 7i nt a pw a t e rr a n g e df r o m8 4 - 9 8 w i t hc v o f2 8 4 - 7 7 5 t h er e s u l t sa b o v es h o w e dt h a tt h es u c c e s so ft h i ss t u d yl i e di nt h es u c c e s s f u l l yp r e p a r e d a r t i f i c i a la n t i g e no fp c b 7 7 a n da f t e ra n i m a li m m u n e t h eh i g ht i t e rs e r u mw a so b t a i n e dt o e s t a b l i s hi n d i r e c te l i s a a f t e ro p t i m i z a t i o n ，s t a n d a r dc u r v eo fp c b 7 7w a sm a d ea n dt h ec r o s s r e a c t i o nw a sn o to b v i o u s t h i si n d i r e c te l i s ad e t e c t i o nm e t h o do fp c b 7 7r e s i d u ec o u l ds a t i s f y t h ep r i m a r ya n a l y s i s ，a n dp r o v i d et e c h n i c a lb a s i sf o r t h ee s t a b l i s h m e n to fe l i s ak i t k e y w o r d s ：h a p t e n ；i m m u n ea n t i g e n ：p l o y c l o n a l ；a n t i b o d yp u r i f i c a t i o n ；e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y c a t e g o r yn u m b e r ：x 8 3 5 i v 山东师范大学硕士学位论文 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：绰 导师签字：亳乒兰j 鱼寸 签字日期：2 。9 年月乡日 签字日期：2 。9 年月多日 山东师范大学硕士学位论文 第一章引言 1 1 多氯联苯免疫检测的研究意义 1 1 1 多氯联苯的危害 多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 作为工业化学品被生产，属卤 代芳烃，是苯环上的碳原子连接的氢原子在不同程度上被氯原子取代的一类联苯 化合物。多氯联苯在1 8 8 1 年由s c h m i d t 和s c h u l t s 首次成功合成，迄今为止，已 能人工合成的这类化合物达2 0 9 种【l 】。由于具有良好的化学惰性和热稳定性， p c b s 曾被广泛用于生产阻燃剂、密封液体、油漆添加剂、浸没油、导热流体、 有机稀释剂、润滑油墨、增塑剂、胶粘剂、除尘剂、蜡制品，还用作电容器和变 压器的介电流体1 2 。 多氯联苯属于内分泌干扰物类环境激素物质，对动物和人类的生殖系统、神 经系统和免疫系统具有危害作用，易溶于生物体的脂肪组织中，还可以通过食物 链浓缩富集。2 0 0 1 年5 月，p c b s 被列为关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩 公约中十二种特别有害的持久性有机污染物( p o p s ) 之一，是目前已检测到 的环境污染物当中最具致癌性的物质之一【3 】。研究证明多氯联苯存在于环境中， 污染环境、威胁人类健康，世界上绝大多数国家已停止多氯联苯的生产和使用。 我国也十分重视多氯联苯，对其生产、储存、运输、使用和废物处理制定了相应 的国家标准，国家经贸委1 9 9 9 年发文勒令2 0 0 0 年内停止生产含有p c b s 的农药 闱。虽然如今不再生产商业用多氯联苯，但在世界上许多地方的电力系统和生态 系统中仍然有多氯联苯的存在，且多氯联苯相当稳定、不易降解，在未来的一段 时间内，多氯联苯会长期存在于环境中。 从我国多氯联苯的存在情况来看，2 0 世纪9 0 年代初我国河流沉积物中p c b s 的含量远高于西藏地区土壤中p c b s 的含量( o 6 2 5 3 5 0 1 n g g ) 【5 】，而低于某些 典型污染源附近土壤和沉积物中p c b s 的含量【6 】。在与国外资料的比较来看，我 国主要河流大城市区段沉积物中p c b s 的含量接近于2 0 世纪7 0 年代初瑞典天然 土壤中p c b s 的含量( 1 5 n g g ) 【_ 7 1 。岳舜琳对自来水厂的水质进行分析发现p c b s 山东师范大学硕士学位论文 含量超出健康评价标准( o 0 0 0 7 2 u g l ) 1 8 3 8 倒8 1 。这些事实都表明我国已存在 的p c b s 污染，对生态环境、动物和人类健康构成了潜在的威胁。 多氯联苯在消费过程中由于渗漏及废物排放等原因造成大范围的污染，据统 计全球的p c b s 积累量约为3 0 万吨【9 】。在我国p c b s 的生产总量也达万余吨，其 在环境中的污染分布状况为：东部沿海地区及东北重工业区占p c b s 总量的 4 5 2 ，中部地区占3 5 7 ，西部地区占1 9 1 。p c b s 自身的特性使之能远程迁 移，从北极的海豹到南极的海鸟蛋，以及在美国、日本和瑞典等国的人乳中均有 检出p c b s 的报告，甚至在海拔几千米的西藏南迦巴儿峰上也检测出了p c b s ( p p t 级) 1 1 0 。 p c b s 可通过食物链富集，且难于生物降解，其污染问题引起了全球的广泛 关注，各国学者纷纷开展p c b s 的相关研究。 1 1 2 多氯联苯检测技术的发展 近年来，加速溶剂萃取( a s e ) 、超声波萃取( s e ) 、微波顶空固相微萃取 ( m a h s s p m e ) 、顶空固相微萃取( h s s p m e ) 、气相色谱( g c ) 、凝胶渗透 色谱( g p c ) 、高分辨质谱( h r m s ) 、高分辨率气相色谱高分辨双聚磁式质谱 联用( h r g c h r m s ) 、气相色谱质谱联用( g c m s m s ) 、重组有绿色荧光蛋 白和荧光素酶( l u c ) 报告基因法、电化学法、分子活化分析、海洋海绵皂等传 统技术和新仪器、新方法在p c b s 的检测中得到应用【1 1 1 。 含多氯联苯的样品前处理主要是索氏提取、溶剂萃取、柱色谱分离净化、固 相萃取、顶空固相微萃取等传统方法，超声提取、自动纯化系统、衍生化处理、 重组基因等方法也逐渐得到应用m 】。这些新仪器和前处理方法，为痕量和超痕 量p c b s 的分析提供了有力的技术支持，并为保护环境和保障人体健康做出了重 要贡献。 1 2 多氯联苯免疫检测技术的基本原理 1 2 1 多克隆抗体和单克隆抗体 2 多克隆抗体( p o l y c l o n a la n t i b o d y ，p a b ) 通过动物免疫制备血清的方法获得， 山东师范大学硕士学位论文 p a b 中含有大量的抗体，称为免疫血清( 抗血清) 。因为在天然抗原中常含有多 种不同的抗原表位，可刺激体内多个b 细胞增殖，产生不同抗原表位的抗体并 释放到血清中，而抗血清又未经免疫纯化，其为多种抗体的混合物，所以被称为 多克隆抗体，多克隆抗体制备实验所用的动物多为鼠、羊、兔、马等。 1 9 7 5 年，k 6 h l e r 和m i l s t e i n 利用细胞杂交技术制备出免疫小鼠脾细胞与恶性 浆细胞瘤细胞融合的杂交瘤细胞，该细胞可经过人工培养而无需增殖，又可针对 某一抗原决定簇，由一个b 细胞分化增殖的子代细胞集团，即由单一纯系细胞 合成的抗体，称为单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y , m a b ) 【l3 1 。 从被免疫的动物血清中获得的多克隆抗体在免疫分析中提高了特异性，其缺 点是抗体不均一、来源间接、存在较大的批间差异。单克隆抗体的出现克服了多 克隆抗体的这些缺点，具有高度特异性、均一性、产量高、可连续大量生产的优 点，但是单克隆抗体的制备需要昂贵的仪器设备，操作技术也比较复杂，生产成 本高。现将单克隆抗体和多克隆抗体的比较结果【1 4 】列于下表。 表1 - 1单克隆抗体和多克隆抗体的比较 t a b l e1 1c o m p a r i s o no fp o l y c l o n a la n t i b o d ya n dm o n o c l o n a la n t i b o d y 3 山东师范大学硕士学位论文 1 2 2 抗原一抗体结合反应 脊椎动物具有免疫系统，当异源性大分子进入体内时，能刺激机体发生保护 性应答反应( 免疫反应) ，产生特异性的保护物质( 抗体) 来识别侵入机体的异 源物质( 抗原) 并与之结合，从而“钝化 入侵物质以排除其干扰。抗原与抗体 的结合反应具有高度特异性，依靠抗原与抗体间结合位点相关空间结构的精密 “锲合 和范德华力等的维系 1 5 - 1 7 】。 抗原抗体作用是免疫化学技术的基础，它们之间的反应是指抗原与相应抗体 之间发生的特异性结合反应，这种反应可以在体内发生，也可以发生于体外。 抗原抗体分子之间存在结构互补性和亲和性，其结合反应具有专一性与可逆 性。抗原与抗体的反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合 的阶段，该阶段反应特点为时间短，仅需几秒钟；第二阶段为可见反应阶段，抗 原抗体复合物在环境因素的影响下，进一步交联和聚集，其实验表现为出现凝 集、沉淀、溶解等肉眼可见的现象。该阶段的反应速度慢，需要数分钟甚至数小 时。这两个阶段的反应所需要时间受多种因素和反应条件的影响，包括自身的性 质和外界实验条件。 1 2 3 抗原与小分子免疫 抗原( a n t i g e n ，a g ) 根据免疫原性和反应性可分为完全抗原与半抗原( 不 完全抗原) 。具有免疫原性和免疫反应性的物质称为完全抗原，只有免疫反应性 而无免疫原性的物质称为半抗原。 抗原的免疫原性与抗原分子的大小有密切关系。通常分子量大于1 0 0 0 0 的物 质才具有免疫原性，分子量小于5 0 0 0 的一般免疫原性很弱，特别是分子量在1 0 0 0 以下的小分子几乎没有免疫原性。 抗原物质既要求有一定的分子量，还要有一定的分子结构和空间构象。分子 结构和空间结构复杂的物质抗原性强，比如含有芳香族氨基酸和碱性氨基酸的蛋 白质比含其他氨基酸者抗原性强。抗原分子的空间构象，也就是基团之间的相互 立体关系，是决定抗原好坏的重要因素，但是空间构象是最容易受到破坏的 1 8 - 1 9 】。 一种抗原物质刺激机体产生相应的抗体，这种抗原只能与相应的抗体相结合 4 山东师范大学硕士学位论文 发生反应，即抗原的特异性( s p e c i f i c i t y ) ，也就是说抗原所引起的免疫应答具有 极强的针对性。抗原的分子量、结构复杂性和特异性并不是决定于整个抗原分子， 而决定于抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团，这些基团容易 被机体的免疫应答所识别，也是与抗体相结合的部位，这个区域( 或基团) 称为 抗原决定簇( a n t i g e n i cd e t e r m i n a t e ) ，又称抗原的表位( e p i t o p e s ) 。 实验证明，利用某些具有活性的化学基团，如n h 2 ，一c o o h ，一o h ，一s h 等， 根据具体情况选用适当的双功能交联试剂与交联方法使半抗原与蛋白质载体偶 联，制备成人工免疫抗原。这些合成的抗原特异性决定于新结合上去的暴露于表 面的简单化学基团，而不是蛋白质本身，这就是半抗原的免疫原理。 1 2 4 免疫检测原理 多氯联苯的分子量小于1 0 0 0 ，属于小分子物质，具有反应原性，能与特异 性抗体结合形成半抗原一抗体复合物，但是本身通常没有免疫原性，不能直接刺 激动物机体产生特异性抗体，只有当它们与蛋白质载体结合后方可获得免疫原性 冽。另外，小分子物质本身也不能被固相载体所吸附，必须与载体蛋白偶联后， 才能通过载体蛋白的作用将半抗原包被在固相载体上，包被在固相载体上的半抗 原( 定量) 和待测液中的半抗原( 待测物质) 竞争地与限量抗体结合，通过测定 半抗原抗体复合物的量计算待测物的含量。 。 1 3 多氯联苯检测技术研究的方法 1 3 1 半抗原分子的选择 多氯联苯相对分子质量小，不具备刺激机体产生针对多氯联苯半抗原的决定 簇，必须与大分子物质结合才能刺激机体产生抗体，属半抗原物质。半抗原的结 构对方法的检出限和选择性至关重要，因此，应选择可直接与载体( 一般为蛋白 质) 偶联，并能在最大程度上模拟待测分子结构的半抗原。理想的半抗原，一方 面应具备待测物的结构特征，特别是立体结构；另一方面与载体连接后应保证该 结构最大程度的与免疫活性细胞识别，并与之结合，以制备出具有预期选择性和 亲合性的抗体。典型的半抗原结构应具备适当的末端活性基团，如c o o h ，o h ， 5 山东师范大学硕士学位论文 s h 等，活性基团与载体之间应具备一定长度的间接臂，一般为非极性，而且除 了供偶联的活性基团外，不应有其它高免疫活性的结构，如苯环、杂环等，以降 低抗体对间接臂的识别和间接臂对待测物结构特征的影响。此外，间接臂还应远 离待测物的特征部分和官能团，有利于高选择性和高亲合抗体的产生。 研究证明，半抗原的选择应该遵循以下基本原则： ( 1 ) 间接臂的连接应尽量避免在目标分子的官能团处或靠近官能团处，最 好位于重要的特征性官能团的远端，避免减少抗体与目标分子的识别和结合位点 2j - 2 2 o ( 2 ) 结构类似的一类化合物，间接臂应当在它们具有相同结构( 或类似结 构) 的位置连接，以最大限度的使分子的独特部位暴露。间接臂长度一般以 0 5 0 8 n m 为宜2 3 1 。 ( 3 ) 避免间接臂中含较强的决定簇( 如芳环、共轭双键或杂环等) ，通常以 含末端活性基团的链环烃为宜，以减少所产生的抗体对间接臂的过度识别而降低 对目标分子的识别能力2 4 1 。 1 3 2 半抗原与载体蛋白的偶联 半抗原通常由待测物的衍生物制备，在其结构的末端需要有直接与载体蛋白 质偶联的活性基团，常用的活性基团有一n h ，一c o o h ，一o h ，s h 等。半抗原与 载体蛋白的偶联即人工抗原的合成，常用的载体蛋白有：牛血清白蛋白( b s a ) 、 卵清蛋白( 0 v a ) 、兔血清白蛋白( r s a ) 、钼孔血蓝蛋白( k l h ) 、猪血清白蛋 白( p s a ) 和人血清白蛋白( h a s ) 。对于同一种目标化合物，包被原和免疫原 通常不用同一种蛋白偶联，目的是减少抗体对包被原的非特异性结合，提高分析 的特异性和灵敏度【2 5 1 。 根据半抗原的结构特征，常用的连接方法主要包括：对于具有羧基的半抗原 2 6 - 2 9 ，可采用羧基通过混合酸酐法、活性酯法、碳二亚胺法等方法；对于具有氨 基的半抗原【3 0 1 ，则多采用重氮化法或戊二醛法；对于具有羟基的半抗原则可直 接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联；对于巯基半抗原则可通过同源或异源的双 功能试剂交联；而有酮基的半抗原则常用氨基氧乙酸化【3 。 6 山东师范大学硕士学位论文 1 3 3 人工抗原偶联比率的测定 鉴定人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图 谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则证明人工抗原合成成功。利用 半抗原、b s a 和偶联物的紫外扫描图，根据半抗原偶联物在紫外区域的吸收约 等于游离蛋白和半抗原吸光值的简单加和的特点，可通过三者在特征吸收波长处 的吸光值推算其可能的结合t l - 3 2 】，计算方法如下： c aa c a m k b b m a c b m 胎a m c ba c b m k a a m a c a m k a a m k a a m ：a a a m ，k b b m - - a b = b m ，k a b m = a a b m ，k b a m ：a b a m c ac bc ac b 式中= l , a 是偶联物中a 、b 两种物质的摩尔分子比。 k m a m 和k b b m 分别表示a 、b 两种物质在其最大吸收波长下的摩尔分子消 光系数。 a m a i n 表示a 物质在其最大吸收波长下的吸光值。 a b b m 表示b 物质在其最大吸收波长下的吸光值。 a a b m 表示a 物质在b 物质最大波长下的吸光值。 a b a m 表示b 物质在a 物质最大波长下的吸光值。 a c a m 表示偶联物在a 物质最大吸收波长下的吸光值。 a c b m 表示偶联物在b 物质最大吸收波长下的吸光值。一 1 3 4 抗体的纯化 免疫血清除含有特异性抗体外，还存在其他的血液成分或非特异性抗体。这 些成分必然对实验结果产生影响。因此，抗血清在使用前要进行纯化，并且对免 疫血清的纯度、特异性、工作浓度和亲和力等多项指标进行测定。此外，抗体越 纯，在固相载体上包被的量越多，测定的灵敏度相对较高。i g g 分离、纯化的方 法主要有： ( 1 ) 盐析法3 3 1 ( s a l tf r a c t i o n a t i o n ) 其原理主要为：盐离子的水合作用需要 大量的溶剂，降低了蛋白质的溶剂化作用，从而使蛋白质之间相互作用，产生沉 淀。沉淀是盐浓度对某种蛋白质是特异的，不同的盐浓度可沉淀不同的蛋白。p h 7 山东师范大学硕士学位论文 值、温度和蛋白质的浓度等也对盐析的效果有一定的影响。盐析法是纯化蛋白质 最经典的方法之一，在实验室中仍得到广泛应用。 ( 2 ) 离子交换层析蚓( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ) 其主要原理为：蛋 白质是两性分子，在水溶液中能解离成为离子。各种蛋白质解离后所带的电荷并 不相同，由此可分为酸性、碱性和中性蛋白质。由于等电点的差异，在一定p h 值的溶液中的解离程度也不同。采用离子交换层析柱纯化蛋白质，即利用这些差 异性把它们吸附到层析柱上，用不同离子强度的缓冲液把蛋白质解析下来，按各 种蛋白质吸附能力的强弱展现出不同移动速度的色层带，分部收集洗脱液，可得 到较为纯净的蛋白质。 ( 3 ) 亲和层析3 5 1 ( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) 其主要原理为：根据抗原和抗 体之间可发生特异性、可逆性结合反应的生物学活性，先将抗原、抗体或其它生 物高分子物质偶联到某种固相载体上，装柱，加入分离样品进行层析。当样品在 柱内向下移动时，结合在固相载体上的抗原或抗体能特异! 胜吸附样品中的抗体或 抗原，而样品中的其它成分均从层析柱下端流出，再用洗脱液将吸附在柱上的抗 体或抗原解离洗脱下来，可得到免疫纯的抗体或抗原。 ( 4 ) 辛酸一硫酸铵盐析法3 蜘( c a p r y l i ca c i d a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ) 常用于动物血清和单克隆抗体的大规模纯化，其主要原理为：辛酸在偏酸性的条 件下能将血清中除i g g 以外的蛋白质亚类都沉淀下来。辛酸加入量因抗体来源不 同而有所差异，人血清为7 0 i t l m l ，兔血清为7 5 p l m l ，小鼠血清为4 0 u m l ， 小鼠腹水为3 3 t i m l 。硫酸铵是分离i g g 最常用的盐，不同的硫酸铵饱和度可 沉淀不同类型的蛋白质。这种方法纯化后i g g 的回收率可达9 0 以上。 纯化后抗体可采用s d s p a g e 电泳的方法鉴定纯化的纯度，采用e l i s a 方 法进行质量鉴定。 1 4 免疫分析技术的发展 2 0 世纪9 0 年代以来，新方法和新手段的出现，有力的推进了免疫分析技术 的快速发展。如分析小分子的结构，深入探讨其抗原决定簇的位置，通过化学方 法封闭或突出某些特定的抗原决定簇，就可制备该决定簇的特异性抗体，以增加 检测的特异性，避免交叉反应；也有人提出可以考虑能用产生部分交叉反应的结 构类似物，制成合适的免疫原，对动物进行选择性免疫抑制，然后用相应的抗原 山东师范大学硕士学位论文 进行免疫，可提高抗原对该物质识别的特异性；把免疫分析与其它技术联用，如 免疫分析与流动注射免疫技术，免疫技术与传感器结合形成免疫传感技术，免疫 分析与气相、液相色谱联用等，都充分利用了两种技术的优势，既可增加检测的 灵敏度又可降低交叉反应；多组分免疫分析的应用，对多种有毒有害物质暴露检 测分子创造了条件；利用分子生物学技术进行d n a 序列重组，制备具有抗原完 整功能的抗体片段，并在生产繁殖迅速的生物体如大肠杆菌上进行足够量表达， 就可大大缩短特异性抗体制备的时间等。 随着免疫学的发展，免疫分析已经成为一个多学科交叉的新型分析技术，与 其他的分析方法相结合，形成许多新的分析方法。 1 4 1 胶体金标记免疫分析 2 0 世纪7 0 年代由f a u l k 等发明了以胶体金为标记物应用于免疫分析的技术， 最早用于免疫电镜技术，将胶体金与膜载体相配合，形成特定的测定模式，是目 前应用较为广泛的一种方法。胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬 液，也叫金溶液。胶体金可以和蛋白质等大分子物质结合，这种复合物称为金探 针，用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质结合，这类胶体金结合物简称免疫 金。胶体金免疫分析应用领域很广，目前在临床中，它还是定性分析，主要用于 检测正常体液中不存在的生物活性物质( 如传染病的抗原) ，以及正常情况下液 体中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。随着技术的进展，对某些可 确定诊断的、有正常上限制的生物活性物质也可以检测，例如传染病、激素、心 血管病、肿瘤及毒品的检测，还可用于食品检测、环境污染、生物沾染、生物制 剂的快速检测，兽医学及法医学等方面的检测【3 ”。 1 4 2 流动注射免疫分析 1 9 8 0 年，l i m 等将速度快、自动化程度高、重现性好的流动注射分析与特 异性强、灵敏度高的免疫分析集为一体，创立了流动注射免疫分析法【3 踟( f i a ) 。 它是将抗体固定在适当载体膜上制备均匀一致的抗体膜带，将膜带的一部分安装 于密封但有样品进出口的微型槽内，从出口处注入待测样品和酶标样品的混合 液，竞争性结合反应在微型槽内进行，反应所引起的特定物理或化学参数的变化 9 山东师范大学硕士学位论文 由配套的检测系统检测出来。f i a 综合了两者的特点且可以计算机控制缓冲液的 流速、自动进样、检测器的检测及数据处理，具有一些突出的优点。近年来，随 着免疫柱制备技术的改进、抗原、抗体标记技术的发展以及计算机技术的引入， 在临床生物样品的检测、低分子药物浓度的临床检测及环境污染物如农药及其代 谢物的含量测定等发面具有较为广阔的应用前景。 1 4 3 免疫一p c r 技术 p c r 是一种在体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技术，即无细胞分子 克隆技术。s a n o 等于1 9 9 1 年首次将p c r 技术引入免疫反应，将抗原一抗体反应 的高度特异性与p c r 技术的高灵敏度、高自动化、操作简便等特点结合起来， 形成了免疫一p c r 技术【3 9 1 ( i m m u n o p c r ) ，开创了免疫检测技术的新时代。免疫 p c r 是目前为止最为敏感的方法之一，理论上可以检测到一个抗原分子的存在。 免疫p c r 是将抗原一抗体反应与p c r 强大的扩增能力结合在一起形成的一种新 技术。免疫p c r 技术因在p c r 中引入了免疫反应，使免疫分析的灵敏度进一步 提高，已达到1 0 x 1 0 乏1 m o l 。这种新技术特异性强、灵敏度高、操作简单，具有 广泛的应用前景。由于免疫一p c r 具有敏感度可控性及操作简单的特性，因此有 望成为一种全自动化高敏度的实验方法。 1 4 4 毛细管电泳免疫分析 毛细管电泳技术的发展及其在免疫分析上的逐步应用，使其发展成一种新型 免疫分析技术一毛细管电泳免疫分析( c e i a ) 。早在1 9 8 6 年，h u r r e l l 等就利用 毛细管电泳对抗原、抗体和半抗原进行分离。由于毛细血管分析进样少，分离时 间短，受外界干扰小而检测限可低于1 0 0 2 m o l 等优点。近十年来，c e i a 技术随 着仪器的进一步自动化而迅速发展起来。具不完全统计，1 9 9 4 年，以前发表在 c a 上的有关毛细管电泳免疫分析的文章只有十四五篇，但从1 9 9 5 1 9 9 8 年底， 发表在3 0 0 0 多种核心刊物上的文章已达一百五十多篇。特别是激光诱导荧光检 测技术应用于毛细管电泳检测后，检测限可低至1 0 之1 m o l 。最近，毛细管电泳检 测酶及酶标分析物等新技术的发展，使c e i a 发展趋势令人注目。 1 0 山东师范大学硕士学位论文 1 4 5 多组分免疫分析 多组分免疫分析技术4 1 1 ( m i a ) 是一种用同一份样品同时测定两种或两种以 上物质的免疫分析方法，它是最近发展起来的并且引起人们兴趣和关注的分析新 技术。由于抗体的特异性，一种抗体一般只能检测一种抗原，在进行多组分分析 时，就得同时使用多种抗体，在同一份样品中，同时测定两种或两种以上的相关 分析物的免疫分析技术。这种技术的应用对需要检测多种物质的综合测定提供了 重要信息，有利于环境、食物中多种有毒有害物质残留和职业中多种农药接触检 测，特别是对混配农药接触分析以及对其联合作用及体内代谢动力学的探讨和研 究具有重要意义。 1 5 本研究的立题依据及意义 作为关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约中首先规定将被逐步消减、 控制和淘汰的1 2 种对人体健康和自然环境最具危害的持久性有机物之一，多氯 联苯( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 的化学性质极为稳定，具有疏水性和亲 脂性，且难被生物降解，因此可广泛存在于环境中，还可产生生物富集和放大， 给生态环境和人类健康带来极大的风险。 随着斯德哥尔摩公约于2 0 0 4 年1 1 月1 1 日在中国正式生效，全面系统 的了解和分析p c b s 在中国水体环境中的存在水平及来源，对于履行中国的承诺， 树立负责任大国的形象至关重要。 据w h o 统计，全世界生产了2 x 1 0 7 吨的工业p c b s ，其中约3 1 排放到环 境中4 2 1 ，p c b s 已成为全世界广泛分布的一种环境污染物，含量从p p t 到几百个 p p m 不等4 3 1 。我国从1 9 6 5 年开始生产p c b s ，主要是三氯联苯和五氯联苯，到 1 9 7 4 年大多数工厂已经停止了p c b s 的生产，8 0 年代初全部停止，在这短短的 十几年问中国生产的p c b s 总量却累计达万吨，其中约9 0 0 0 吨( 三氯联苯) 用 作电力电容器的浸渍剂，约1 0 0 0 吨( 五氯联苯) 用于油漆添加剂。1 9 5 0 1 9 8 3 年间，在未被告知的情况下，我国还先后从比利时、法国、德国、日本等国进口 了大量含有p c b s 的电器设备，估计有4 0 0 0 5 0 0 0 吨的三氯联苯随着电容器设备 进口到我国。由此可见，通过国内生产和国外进口，多氯联苯在中国的总量约有 1 4 0 0 0 。15 0 0 0 吨4 4 1 。