（环境科学专业论文）壳寡糖及壳寡糖铁配合物的生物活性研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e sa r eak i n do fa l k a l ip o l y s a c c h a r i d e s p r e p a r e df r o mt h e d e g r a d eo f c h i t i na n dc h i t o s a n ，w h i c hc o n s i s to fan u m b e ro fm o n o s a c c h a r i d e sj o i n e d b yg l y c o s i d i cb o n d s c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e sa r en o to n l yw a t e r - s o l u b l e ，b u ta l s o p o s s e s ss p e c i a lf u c t i o n a lp r o p e r t i e ss u c ha sa n t i t u m o ra c t i v i t y , i m m u n o s t i m u l a t i n g e f f e c t s ，a n da n t i m i c r o b i a la c t i v i t y i no r d e rt oi m p r o v et h eb i o m e d i c i n ea p p l i c a t i o no f c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e se s p e c i a l l yi nt h ef i e l do fa n t i - t u r n o u t , i tw a ss t u d i e dt h a tt h e b i o a c t i v i t i e so fc h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d ea n dc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e x i t w a sf o c u s e do nt h ef o l l o w i n gt w op a r t si n c l u d i n gc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d eu s e da s g e n e d e l i v e r y , t h es y n t h e s i sa n dt h eb i o a c t i v i t yo fc h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e f e c o m p l e xi nt h i sp a p e r t h ec h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fw h i c hw a sa b o u t5 0 0 0 ， w a su s e da sr e s e a r c hm o d e l b y c h a r a c t e r i z a t i o n ，s t a b i l i t ya n dc y t o t o x i c i t ye x p e r i m e n t ， c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d ew a sp r o v e dt o b eab i o c o m p a t i b l e ，b i o d e g r a d a b l ea n d n o n - t o x i cg e n ed e l i v e r y c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e d n ac o m p l e xw a sp r e p a r e db y c o m p l e xc o a c e r v a t i o nu s i n gp e g f p c - 1 a c c o r d i n gt ot h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s a n du vs p e c t r o p h o t o m e t e ri tw a sp r o v e dt h a te l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nw a sp l a y i n ga v e r yi m p o r t a n tr o l e i nt h ef o r m a t i o np r o c e s so fc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e d n a c o m p l e x t h ep o t e n t i a lo fa d s o r b i n gd n a o nc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d ew a sa n a l y z e d b yg e le l e c t r o p h o r e s i sa n du vs p e c t r o p h o t o m e t e r , a n di t w a si n d i c a t e dt h a t c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d ec a ni m p r o v et h es t o r a g ea n ds t r u c t u r es t a b i l i t yo fd n a t o c h e c ki t sp r o t e c t i o na b i l i t yt od n a b yd n a s eid i g e s t i v ee x p e r i m e n t , t h er e s u l t s h o w e dt h a tc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d ec o u l dl o a d 、析t hp l a s m i de f f e c t i v e l ya n d p r o t e c t d n af r o mb e e nd i g e s t e db yd n a s ei i tw a sp r o v e dt h a tc h i t o s a n o l i g o s a c c h i d ew a s s a f e t ya n de f f e c t i v ef o rg e n ed e l i v e r ya n dw i l lh a v eav e r yg o o df u t u r ei nt h ef i e l do f g e n et h e r a p y t h ec h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e xw a sp r e p a r e db ya d d i n gf e c l 3t o c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d es o l u t i o n t h ec o m p l e xw a sc h a r a c t e r i z e db yf t i r 、u v 、 d t a 、x r d 、t e m 、p c se t c i tw a sc o n c l u d e dt h a tt h ef e ( i i i ) w a sc o o r d i n a t e dw i t ht h e n h 2a n do ho fc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e a n dt h eu l t r a v i o l e ts p e c t r o s c o p ya n a l y s i s a n dg e le l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i sw e r eu s e dt or e s e a r c ht h eb i o l o g i c a l a c t i v i t yo f c h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e xv i ap l a s m i dd n a t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e xh a das t r o n gb i n d i n ga f f i n i t yw i t hd n aa n dt h e v c o m p l e xc o u l dd a m a g ea n dd e g r a d et h es t r u c t u r eo fd n a a l s ot h ea n t i t u m o r a c t i v i t y o fc h i t o s a n 。o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e xw a sa l s os t u d i e db y m t t b yt h ed i 蜀f e r e n t v o l u m ea n dc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n - o l i g o s a c c h a r i d e f e c o m p l e xe x p e r i r n e n t , t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e xc a l ls t r o n g l yi n h i b i tt 1 1 e g r o 、讹o f2 9 3 t t h u st h ec o m p l e xw a sp r o s p e c t i v et ob ean e w a n t i c a n c e rd r u ga r e r t h ef u r t h e rr e s e a r c h k e yw b r d s ：c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e 、p e g f p c 1 p l a s m i dd n a 、b i o a c t i v i t y 、 c h i t o s a n 。o l i g o s a c c h a r i d e f ec o m p l e x 、g e le l e c t r o p h o r e s i s 、 u v s p e c t r o p h o t o m e t e r 、 c y t o t o x i c i t y 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版， 并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本 学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文 的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容 用于学术活动。 学位论文作者垂耄舡学位论文作者签名：、吵、 7 以年月易日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在d 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名l 劬 学位论文作者签名十童迎 f 占年，月，乎日 驿、月、日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名： 嫔 童址 1 月、，e t 第一章绪论 第一章绪论 自2 0 世纪9 0 年代初期首例基因治疗临床试验获得成功后，人们对基因治疗 的临床疗效充满信心。然而1 9 9 9 年美国宾夕法尼亚大学却发生了因应用重组腺 病毒载体不当引发机体致命免疫反应而死亡的“杰辛格事件”【l ，2 】；2 0 0 0 年法国 也发生了用逆转录病毒载体基因治疗重症联合免疫缺陷病而诱发白血病的恶性 事件，使得基因治疗的载体问题引起关注。 目前，基因治疗常用的载体系统主要包括两大类：病毒载体系统和非病毒载 体系统。病毒载体系统有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。尽 管病毒载体系统基因传递效率高达9 0 以上，但仍存在许多难以克服的局限性 【3 j ，如逆转录病毒不能感染非分裂细胞；腺病毒不能稳定整合于宿主细胞基因组 内，故难以长期稳定表达，甚至可能引起机体强烈的免疫反应；腺相关病毒载体 容量小，难以为大片段基因所利用，且制备困难。于是研究者把目光转移到安全 无毒而且无免疫原性的非病毒载体。传统的非病毒载体，如裸d n a 、脂质体、 阳离子多聚物等，虽然安全但基因传递效率极低难以获得有意义的基因表达【4 】。 因此，发展基因治疗的关键在于开发安全、有效并具有优良特性的非病毒基因转 运载体系统，近年来发展起来的一种新型非病毒基因转运载体壳聚糖，除了 具有可生物降解性和低细胞毒性等优越性之外，还具有独特的跨细胞膜能力而倍 受关注【5 】。本文就近年来壳聚糖及其衍生物在基因治疗中的应用进展作一简要综 述。 1 1 壳聚糖性质 1 8 1 1 年，法国人h b r a c o r m o t 用温热的稀碱溶液反复处理蘑菇提取到甲壳素。 至今，人们对甲壳类物质的研究己经1 0 0 多年了，现在全世界每年由生物合成的 甲壳素约为1 0 0 亿吨，可提取壳聚糖已达2 0 亿吨以上1 6 】，壳聚糖成为自然界中 仅次于纤维素的取之不尽、用之不竭的第二大天然生物有机资源。壳聚糖 ( c h i t o s a n ) 也称为几丁聚糖，是甲壳质( c h i t i n ) 部分脱乙酰后的产物，脱乙酰 度和分子量是其两大理化指标。甲壳质广泛存在于蟹、虾、金龟子等甲壳类动物 外壳和香菇等真菌类以及细菌类细胞膜中。它是由2 氨基2 脱氧葡萄糖单体通 过p ( 1 ，4 ) 糖苷键连接起来的直链多糖，学名为( 1 ，4 ) 2 一氨基2 脱氧b d 葡萄糖1 7 j ，具有无毒安全，生物相容性好等优点。壳聚糖在发酵、造纸、烟草、 纺织、医疗、农业、环保、同化等领域均都有较深入的应用。 1 第一章绪论 1 2 壳聚糖基因载体 1 9 9 5 年，m u m p e r 等1 8 】首次报道壳聚糖溶液与d n a 以自聚集的方式沉淀能 得到一种粒径大小为1 5 0 5 0 0 n m 的复合物，壳聚糖d n a 复合物的平均粒径与所 用壳聚糖分子量有关( 1 0 8 5 4 0 k d a ) ，而与缓冲液组成无关，于是初步认为壳聚 糖有用于基因治疗载体的潜质。实验证明，该复合物转染效率仍低于阳离子脂质 体和病毒载体，但壳聚糖作为天然高分子所具有的生物可降解性、良好的生物相 容性、无毒安全等特性却引起研究者的兴趣。随后m a o 等【9 j 在制备壳聚糖d n a 复合物之前用醋酸对壳聚糖进行预处理，用n a o h 调节其p h 至5 5 5 7 左右， 并在壳聚糖与d n a 形成复合物的反应中加入n a 2 s 0 4 。结果得到大小在 2 0 0 5 0 0 n m 结构紧凑的壳聚糖d n a 复合物微球，该报道首次得到壳聚糖促进转 染的正向数据。 1 2 1 壳聚糖粒径 基因转染是一种检验基因载体递送性能最有说服力的手段。无论是评价所设 计载体的性能，还是应用载体进行基因治疗，都要用基因转染来作为评价方法。 从载体递送基因的释放角度看【l ，壳聚糖d n a 复合物的粒径大小尤为重要，尺 寸的变化将严重影响复合物在体内的循环时间、靶向细胞的进入以及在体内的效 用。虽然有许多有关壳聚糖转染的相关报道，但是关于壳聚糖d n a 复合物的大 小与转染率的关系，不同研究者所得的结论似乎是矛盾的。一般情况下，纳米粒 子粒径在1 0 0 n m 以下能够很好的保证细胞对粒子的内利l l 】。i l i u m 等【l2 】合成出粒 径为2 0 5 0 0 n m 壳聚糖d n a 复合物，实验表明粒径越小的复合物越容易被细胞 内吞或者胞饮，因而转染效率就越高。e r b a c h e r 等i l3 j 发现壳聚糖d n a 复合物的 粒径为5 0 1 0 0 n m 时，进行体外实验的转染率甚至比p e i 的还高。但是n a k a n i s h i 等4 j 的研究表明中等粒径大小为0 4 9 m 1 4 9 m 的壳聚糖d n a 颗粒具有最高的转 染率，而小于4 0 0 u r n 的复合物的转染率反而降低。 对于壳聚糖d n a 复合物粒径大小的影响因素也有报道，包括有壳聚糖的分 子量、d n a 浓度、盐浓度、p h 值、电荷比率和温度等，m a o 等i l 引总结研究了影 响壳聚糖d n a 复合物粒径尺寸的因素，发现复合物的粒径尺寸主要由n p 比决 定，而n a 2 s 0 4 的浓度为2 5 2 5 m m o l l 时对复合物的粒径无明显影响，而且d n a 的大小为5 1 1 1 9 k b 时对复合物的尺寸也无影响。 1 2 2 壳聚糖分子量 关于壳聚糖纳米粒的分子量对转染效率的影响以及如何选择合适的分子量 2 第一章绪论 也是壳聚糖作为基因载体研究中的重点。i s h i i 等【1 6 , 1 7 】研究壳聚糖分子量、体系 p h 值、血清浓度等对不同细胞的转染效率影响，结果显示壳聚糖的最佳分子量 取决于细胞系，1 0 - 5 0 k d a 的壳聚糖是最好的基因载体，而分子量的大小可能影 响到壳聚糖d n a 复合物的稳定性、细胞转运的效率以及细胞内吞后d n a 从复 合物上酶解等。 r i c h a r d s o n 等i l 列采用三组分子量分别为小于5 0 0 0 d a ，5 0 0 0 1 0 0 0 0 d a ，大于 1 0 0 0 0 d a 的高纯度壳聚糖片断用碘标记后包裹d n a 对雄鼠进行体内实验，结果 表明这些低分子量的壳聚糖既无溶血性又无生物毒性，而且能够与d n a 形成复 合物保护其不被酶解，同时他们还发现分子量越低的壳聚糖在肝中的累积量越 低，因此推测分子量更低的壳聚糖也可能作为基因载体。l e e 等【1 9 】采用分子量为 2 2 k d a 的低分子量的壳聚糖进行基因转染实验，发现与高分子量的壳聚糖不同的 是，低分子量的壳聚糖在水中极易溶解，且在生理缓冲液中便可以与d n a 形成 复合物，结果表明低分子量的壳聚糖的转染率比裸d n a 和p l l 都高，用m t t 法证明其的生物毒性比p l l 还低。m a o 等【2 0 】在研究高聚壳聚糖解聚也提出正是 由于低分子量壳聚糖的可溶性因而其对基因载体递送系统的设计更有价值。 1 2 3 壳聚糖脱乙酰度 对壳聚糖除了研究其分子量对转染率的影响外似乎很少有人把目光放在壳 聚糖其他性质上，而k i a n g 等l z l j 便把壳聚糖的脱乙酰度与基因的转染率关联起 来，研究结果表明随着脱乙酰度的降低，d n a 的包封率和复合物的电荷比率也 随着增加，使得壳聚糖d n a 复合物在血清浓度中不稳定，因此转染效率也随之 降低。在建构合适的壳聚糖d n a 复合物时，壳聚糖的脱乙酰度也是一个需要考 查的重要因素。 1 3 壳聚糖d n a 复合物的形成机制 d n a 究竟是以何种形式或作用与壳聚糖形成纳米粒复合物，有报道【2 2 】采用 络合、吸附、包裹、嵌入等，目前普遍接受的壳聚糖与d n a 以静电络合的方式 形成复合物的。因为壳聚糖上的游离氨基质子化使得壳聚糖分子带正电荷，可以 与带负电荷的d n a 以静电作用结合在一起而形成壳聚糖d n a 复合物。用溴化 乙锭( e t b r ) 进行荧光扫描再进行凝胶电泳可以证明复合物之间以静电作用结合。 l e o n g 等1 2 3 1 把壳聚糖加入经溴化乙锭( e t b r ) 染色的d n a 溶液中，随着阳离子 壳聚糖竞争键的作用，用荧光光度计检测发现荧光强度明显减小，利用激光粒度 仪检测出复合表面电势的变化也证明壳聚糖与d n a 之间静电作用的存在。 3 第一章绪论 1 4 壳聚糖d n a 复合物的稳定性 壳聚糖d n a 复合物的稳定性决定了转染效率。研究发现【2 4 】冻干的壳聚糖 d n a 复合物在4 周后仍保持着转染细胞的能力。 由于非病毒载体运载d n a 极易受d n a s e 酶降解，壳聚糖d n a 复合物的防 止d n a s e 酶降解是考查其复合物稳定性的重要参数。r i c h a r d s o n 等【1 8 】以d n a s e i i 作为标准酶，在不同酶浓度下通过凝胶电泳来检验载体的保护能力，发现由不同 分子量且经高度纯化的壳聚糖与d n a 组成的络合物以电荷比为l 1 时几乎可 以完全抑制d n a s ei i 对质粒d n a 的降解。壳聚糖之所以能有效地抑制d n a s e 降解，估计是因为壳聚糖与d n a 结合而成的络合物形成的三维空间结构所产生 的位阻效应。 m a o 掣1 5 j 也研究了壳聚糖d n a 复合物在盐溶液和血清中稳定性，发现当复 合物暴露在血清或高离子强度的盐溶液时，可能由于对蛋白质的吸收或相互之间 发生凝聚作用导致复合物的尺寸变大。m a c l a n g h i n 等f 2 5 】更系统地研究了不同分 子量，不同电荷比的壳聚糖d n a 复合物在1 0 血清浓度中的稳定性。研究发现 随着分子量的增大，壳聚糖与d n a 之间的相互作用更趋于稳定。 1 5 壳聚糖衍生物基因载体 在前期壳聚糖作为基因载体的论证成功后，目前许多研究者都把研究的重点 放在壳聚糖的改性和修饰上，期望能提高壳聚糖的递送性能，研究重点是对其进 行改性，然后考查其转染效率，主要是提高壳聚糖基因递送系统的细胞靶向性， 从而提高转染效率。 1 5 1 脱氧胆酸化壳聚糖载体 l e e 等【2 8 】对壳聚糖分子进行疏水性修饰，以碳酰亚胺作为交联剂，在高分 子链上用化学方法连接脱氧胆酸，使得壳聚糖成两亲性分子，而这种两亲性的壳 聚糖在水性介质中能够自组装成疏水基向罩亲水基向外的平均粒径为1 6 2 n m 左 右的纳米粒。自组装形成的纳米粒具有一定的空间结构，在纳米粒的外表面富有 大量亲水性的氨基可以质子化而使纳米粒的表面带有大量的正电荷，d n a 可以 通过静电作用加载在表面，或者插到纳米粒空穴中。而且采用自组装的方法制得 纳米粒是这个研究小组对壳聚糖改性的一大特色，之后这个研究小组的p a r k l 2 9 l 和k w o n l 3 0 1 还在壳聚糖上接上乙- 2 醇后，用胆 烷酸对其改性制成纳米粒，通过 细胞粘附力和细胞迁移等实验证明其具有良好的生物活性和转染效率。 4 第一章绪论 1 5 2 半乳糖化壳聚糖载体 壳聚糖d n a 复合物纳米粒在没有任何配体受体作用下可被细胞摄入，若要 进入特定的靶向细胞，需用不同的生物特异配体修饰壳聚糖，p a r k 等【3 1 】制各出 半乳糖化的壳聚糖d n a 复合物，研究发现这种经过半乳糖化的复合物能高速地 转染肝细胞系。随后k i m 等 3 2 1 用乳糖酸的半乳糖基修饰在水中有较强的稳定性 也无生物毒性的水溶性的壳聚糖后进行体外实验，载体能够有效地防止d n a s ei 的酶解，对肝细胞具有靶向性，并且对h e p g 2 细胞具有高转染率。而g a o 等【3 3 】 经过细胞毒性试验和基因转染试验也证明分子量为2 1 k d a 左右的低分子量壳聚 糖经半乳糖化能够有效的作为基因载体，并且还发现半乳糖苷化度和n p 比是影 响其转染率的主要因素。 1 5 3 季铵盐化的壳聚糖载体 为了提高载体的转染效率，m u r a t a 等 3 4 , 3 5 】在1 9 9 5 年就提出将壳聚糖季铵盐 化后用于基因载体实验，他们先用三甲基铵盐来修饰壳聚糖，再用半乳糖残基来 连接壳聚糖，这种复合物能够有效的转染h e p g 2 细胞，证明了其作为基因载体 的可能性。而t h a n o u 掣刈用季铵化度4 0 、5 0 的三甲基低聚壳聚糖作为载体， 研究其对c o s 1 和c a c o l 的转染效果，发现其转染c o s 1 的能力比低聚壳聚糖 好得多，而且无细胞毒性，但是却不能提高c a c o l 的转染率。 1 5 4 其它壳聚糖衍生物载体 k i m 等【37 】用带咪唑环的尿刊酸来修饰壳聚糖，在生理条件下复合物的粒径 为1 0 9 3 4 2 n m ，用尿刊酸来修饰的壳聚糖在转染2 9 3 t 细胞时，显示出良好的载 d n a 的能力，可以防止d n a 被核酸酶酶解，且细胞毒性低。国内研究壳聚糖基 因载体比较领先的姚康德等 3 8 , 3 9 j 将壳聚糖十二烷基化，通过对比不同温度下的 d n a 和壳聚糖d n a 复合物中d n a 的紫外吸收发现，由于十二烷基化壳聚糖的 保护作用，d n a 分子热稳定性提高，d n a 酶解实验表明，原始d n a 已被酶解 成碎片，而被十二烷基化壳聚糖保护的d n a 未受影响。周旭等1 4 0 j 在纳米粒表面 连接p e g 对纳米粒进行修饰，壳聚糖纳米粒能将报告基因递送到细胞内而且能 在细胞内表达。 1 6 展望 j 下是由于壳聚糖的安全性、良好的生物相容性以及易于生产存储，使得研究 5 第一章绪论 者对壳聚糖的研究不断的深入。但是目前对壳聚糖基因载体的转染机制仍然不能 完全阐明，i s h i i 等i l6 j 认为转染机制可以大体分成细胞摄取、逃逸内吞小体和向 核转运三个阶段。并且现在虽然有很多体外实验的报道，而有关体内实验的报道 却鲜少【4 1 1 。总而言之，壳聚糖及其衍生物是一种具有良好应用价值和广阔应用 前景的基因载体，随着对其研究的深入，人们一定能够将壳聚糖及其衍生物推向 临床应用。 1 7 本论文选题意义及研究内容 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是一类甲壳素脱乙酰基产物，学名为( 1 ，4 ) 一2 氨基2 脱氧b d 葡萄糖，由于资源丰富，结构独特，因此具有很多的潜在应用价值。 壳聚糖可以通过各种化学修饰，即酰化、醚化、烷化、螯合、水解、氧化、卤化、 接枝与交联等反应形成不同的衍生物。随着对壳聚糖分子的改造及对其作用研究 的不断深入，发现壳聚糖通过化学法、酶法等解聚而成低分子壳聚糖即壳寡糖 ( c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e ) ，壳寡糖一般由2 5 0 个糖单元通过糖苷键连接而成， 不仅水溶性大，而且具有多种生物学功能，包括抗肿瘤性、抗菌性、抗氧化性以 及降血脂性等，尤其是壳寡糖抗肿瘤的研究更为关注。我们将这类具有较低分子 量的壳聚糖称为纳米壳聚糖，期望通过对壳寡糖及其衍生物的生物活性的研究， 以提高壳寡糖在生命医学领域的价值。 本论文研究的主要内容如下： 1 以分子量为5 0 0 0 左右的壳寡糖作为载体探讨壳寡糖纳米载体应用于基因 治疗的可行性与安全性，通过紫外光谱分析和凝胶电泳分析壳寡糖纳米粒对 d n a 的结合和保护能力，并且提出壳寡糖与d n a 复合物形成的机理，进行初步 的细胞转染实验。 2 用分子量为5 0 0 0 的壳寡糖与f e c l 3 反应制得纳米壳寡糖一铁配合物，并通 过f t i r 、u v 、d t a 、d s c 、t e m 、p c s 等手段对壳寡糖铁配合物进行结构和 形态表征。同时采用紫外光谱法、凝胶电泳法以及体外细胞法相结合对纳米壳寡 糖铁配合物的生物活性进行全面而综合的研究与评价。 6 第二章质粒构建与细胞培养 2 1 引言 第二章质粒构建与细胞培养 用于基因载体系统研究的基因主要分为两类，一类为无治疗意义的报告基 因，另一类为有临床应用价值的治疗基因。因为报告基因的表达产物的检测手段 简单易行，在目前研究中，多使用报告基因，通过在应用中检测到报告基因的表 达产物来证明载体的技术可行性。报告基因法已经成为评价基因载体的常规方 法，以绿色荧光蛋白基因( p e g f p ) 的使用最为广泛，p e g f p 的表达产物检测 方便，可直接用倒置荧光显微镜进行观察。 而本论文所有细胞实验均采用2 9 3 t 。2 9 3 细胞是转染腺病毒e 1 a 基因的人 肾上皮细胞系，2 9 3 t 细胞由2 9 3 细胞派生，同时表达s v 4 0 大t 抗原，含有s v 4 0 复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用c a a ( p 0 4 ) 2 转染效率可高达5 0 。蛋 白表达水平高，转染2 3 d 后用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。 2 2 实验部分 2 2 1 主要仪器与试剂 高速离心机( h i m a cc r2 2 g ，h i t a c h i ) 微型离心机( e p p e n d o r f ) 微型紫外分光光度计( e p p e n d o r f ) 台式恒温振荡器( 江苏太仓仪器设备厂) 隔水式c 0 2 恒温培养箱( 上海精宏实验设备有限公司) 涡旋振荡器( q t - 1 ，上海琪特分析仪器有限公司) 组织培养板( 6 孔、2 4 孔、9 6 孔) ( f a l c o n ) 1 5 m l 、5 0 m l 无菌圆锥底离心试管、冷冻管( f a l c o n ) 超净工作台( 苏净公司) 光学显微镜( n i k o n ，t s l 0 0 ) c 0 2 培养箱( t h e r m of o r m a31 10 ，t h e r m oe l e c t r o n ) 3 7 恒温水浴箱( d k $ 2 8 型，上海精宏实验设备有限公司) 8 0 冰箱( f o r m a 8 6 cu l t ，t h e r m oe l e c t r o n ) 7 第二章质粒构建与细胞培养 液氮和液氮容器 电子天平( a l 2 0 4 ，m e t t l e rt o l e d o ) p h 计( d e l t a 3 2 0 ，m e t t l e rt o l e d o ) 胰蛋白胨( o x o i d ) 酵母提取物( o x o i d ) 二甲亚砜( 上海国药，a r ) 醋酸钾( 上海国药，a r ) 冰醋酸( 上海国药，a r ) i r i s 碱( 上海赛百盛基因技术公司) e d t a ( 上海国药，a r ) 溶菌酶( s i g m a ) 异丙醇( 上海国药，a r ) 无水乙醇( 上海国药，a r ) 细菌与质粒：大肠杆菌( e c o l i ) d h 5 a 、绿色荧光蛋白表达载体p e g f p c 1 由同济蛋白质研究所提供 2 9 3 t 细胞：由同济大学医学院陈小平教授提供 培养液d m e m ( g i b c o ) 台盼兰溶液( 0 4 溶解于p b s ，s i g m a ) 冷冻液：9 0 灭活胎牛血清+ 1 0 d m s o ，用0 2 2 9 m 微孔滤膜过滤除菌，4 。c 保存 2 2 2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化【4 2 】 2 2 2 1 制备超级感受态细胞 准备i n o u e 转化缓冲液( 用前冰上预冷) ：0 5 m o u l 的p i p e s 哌嗪n ，n 双 ( 2 乙磺酸) ，p h 6 7 】溶液的配制：将1 5 1 9p i p e s 溶于8 0 m l 水中，用5 m o l lk o h 调p h 值至6 7 ，最后加纯水，定容至1 0 0 m l ；用预先处理的n a l g e n e 滤膜( o 4 5 9 m 孔径) 过滤除菌，分成小份子2 0 。c 保存；按一定比例将m n c l 2 - 4 h 2 0 、c a c l 2 - 2 h 2 0 、 k c l 、p i p e s 、h 2 0 溶于水中，用预先处理的n a l g e n e 滤膜( o 4 5 p m 孔径) 过滤 除菌，分成小份于2 0 保存。 挑取一个经3 7 培养1 6 - 2 0 h 平皿上的单菌落( 2 - 3 m m 直径) ，接种至2 5 0 m l 锥形瓶中的2 5 m l l b 培养液中，3 7 摇床( 2 5 0 3 0 0 r m i n ) 培养6 8 h ；将上述初 始培养物接种于三个盛有2 5 0 m i l b 培养液的l l 锥形瓶中，第一个加1 0 m l ，第 二个加4 m l ，第三个加2 m l ，于1 8 。c 中速摇床过夜；测量三瓶培养物的o d 6 0 0 约 为0 5 左右时，将培养瓶置于冰上1 0 m i n ，弃去另两瓶培养物；于4 以2 5 0 0 r p m r 第二章质粒构建与细胞培养 慢速离心1 0 m i n 收集菌体；倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2 m i n 以吸干 剩余液体，用一个真空吸引器将贴附在管壁上的培养剂吸干；加8 0 m l 预冷的 i n o u e 转化缓冲液重悬菌体；于4 。c2 5 0 0 r p m 慢速离心1 0 m i n 收集菌体；倒去上 层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2 m i n 以吸干剩余液体，用一个真空吸引器 将附在管壁上的培养基吸干。 2 2 2 2 冻存感受态细胞 用2 0 m l 预冷的i n o u e 转化缓冲液轻轻重悬沉淀；加1 5 m ld m s o ，轻轻混匀 细菌悬液，放置冰上10 m i n ；迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧 管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。储存于7 0 。c 备用。 2 2 2 3 转化 将要转化的d n a 片段加入到装有感受态细胞的管中( 5 0 9 l 感受态细胞需 2 5 n g d n a ) ，体积不应超过感受态细胞的5 ，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴 3 0 m i n ；将管放入4 2 水浴，定时9 0 s 热休克；快速将管转移到冰浴9 0 s ，使细 胞冷却；每管加入8 0 0 9 ll b 培养基，3 7 。c 缓摇4 5 m i n ，使细菌复苏并表达质粒 编码的抗生素抗性标记基因；低速离心2 m i n ，去上清，留约1 0 0 9 l 培养基在微 量离心管内，重悬菌体；用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀；将平板倒置于 3 7 恒温培养箱，1 6 h 后可出现菌落。 2 2 3 质粒d n a 的小量制备 从l b 平板上挑取单菌落，接种于2 m l 含卡那霉素的l b ( 1 t r y p t o n e ， o 5 y e a s te x t r a c t ，i n a c i ) 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜；取1 5 m l 菌液， 1 3 ，4 0 0 r p m 离心2 m i n ，去上清，以1 0 0 9 l 预冷的溶液i ( 5 0 m m o l l 葡萄糖，1 0 m m o l l e d t a ，2 5 m m o l lt r i s h c i ( p h 8 0 ) ，高压灭菌后4 保存) 悬浮菌体；加入2 0 0 9 l 溶液i i ( 0 2 n a o h ，i s d s ) ，颠倒混匀五至六次；加入1 5 0 9 l 预冷的溶液i i i ( 3 m o l l 醋酸钾，5 m o l l 醋酸) ，混匀，冰上放置大于5 m i n ；1 3 ，4 0 0 r p m 离心1 0 m i n ， 取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇溶液( 酚：氯仿：异戊醇= 2 5 ：2 4 ：1 ) 混匀，1 3 ，4 0 0 r p m 离心5 m i n ；取上层水相，用两倍体积无水乙醇沉淀d n a ；沉 淀至于3 7 恒温箱，干燥后溶解于3 0 9 l 含有3 0 “g m lr n a s ea 的t e ( 1 0 m m o l l i r i s h c i ( p h 8 0 ) ，i m m o l le d t a ) 溶液中，2 0 保存。加入酶切缓冲液及相应 的限制性内切酶，3 7 反应1h ，进行0 8 的琼脂糖凝胶电泳，确认阳性克隆。 根据酶切反应的结果，挑选一个阳性克隆进行d n a 测序，通过d n a 测序最终 确定重组质粒，测序结果讵确的克隆大量提取d n a 备用。 9 第二章质粒构建与细胞培养 2 2 4 细胞转染超纯质粒的抽提 从l b 平板上挑取单菌落，接种于1 0 0 m l 含卡那霉素的l b ( 1 t r y p t o n e ， 0 5 y e a s te x t r a c t ，1 n a c l ) 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜；取1 0 0 m l 过夜 菌，8 0 0 0 r p m 离心2 m i n 集菌；用4 m ls o l u t i o ni ( 5 0 m mg l u c o s e ：2 5 m mt r i s h c l ， p h 8 o ；1 0 m me d t a ，p h 8 0 ) 重悬菌体；加入2 5 0 9 l 新配制的溶菌酶( 1 0 m g m 1 ) ； 5 m ls o l u t i o ni i ( i s d s ，0 2 nn a o h ) ，轻轻颠倒数次，彻底混匀；加入3 7 5 m l 冰预冷的s o l u t i o ni i i ( 5 m o l l 乙酸钾，冰乙酸，水) 轻轻混匀，离心管在冰上放 置10 m i r a4 。c 2 0 ，0 0 0 r p m 离心3 0 m i n ， 7 6 5 m l ，涡旋混匀，室温下放置1 0 m i n ： 上清装入新管；加入0 6 倍体积异丙醇 室温下以1 2 ，0 0 0 r p m 离心15 m i n ，回收 核酸沉淀；沉淀用7 0 乙醇洗涤；沉淀用3 m lt e 溶解；在冰浴中冷却至o ， 加入3 m l 冰预冷5 ml i c i ，涡旋混匀，4 离心1 2 ，0 0 0 r p m ，2 0 m i n ；上清移出， 加等体积异丙醇，混匀，室温离心1 2 ，0 0 0 r p m ，1 0 m i n ；7 0 乙醇洗涤；用5 0 0 i _ t l 含r n a s e a ( 1 0 0 0 x ，2 0 3 0 9 1 ) 的t e 溶解，转移到微量离心管，室温放置3 0 m i n ： 将质粒一r n a s e 混合物用5 0 0 9 l 酚：氯仿抽提上清直到无蛋白，重复3 遍；用标准 的乙醇沉淀法回收d n a ( 加入3 mn a a c 5 0 9 l ，使终浓度为0 3 m ，准确加入两倍 体积的冰预冷的乙醇l m l ，涡旋混匀，在冰上放置大于3 0 m i n ，离心回收，7 0 乙醇3 0 0 9 l 洗涤，晾干) ；沉淀用5 0 0 9 l 灭菌水溶解加入5 0 0 9 lp e g 8 0 0 0 ，涡旋混 匀；室温放置超过1 0 m i n ，然后室温最大速度离心2 0 m i n ；沉淀用0 5 m l7 0 乙 醇重悬以除微量p e g ，最大速度离心5 m i n ，去上清后放置1 0 2 0 m i n ，使乙醇挥 发；湿润的质粒沉淀用1 0 0 9 lt e 稀释溶解后测o d 2 砷。 2 2 5 细胞复苏【4 3 1 将保存于4 。c 的培养液和血清，置于3 7 4 2 水浴预温。将冷冻管迅速由 液氮转入到3 7 。c 水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定 时搅拌加速解冻使其在l m i n 内融化。当细胞完全解冻后，用含7 0 乙醇的纱布 擦拭冷冻管消毒。将解冻后的细胞转移到含4 0 c 预平衡培养液的试管中。细胞悬 液在4 。c 下1 0 0 0r p m 离心5 m i n 。弃上清，将细胞重新吹打悬浮在新鲜培养液中。 将细胞转移到细胞培养瓶，3 79 c 、5 c 0 2 恒温培养箱中培养。用倒置显微镜检 查细胞存活率以及细胞密度。待培养2 4 3 6 h 细胞贴壁后，更换新鲜培养液一次。 一般冻存良好的细胞，复苏培养1 0 h 即可贴壁。 2 2 6 细胞计数 用0 2 5 胰蛋白酶( 含0 0 2 e d t a ) 消化液将细胞消化下来，制备单细胞 1 0 第二章质粒构建与细胞培养 悬液。吸取待测细胞悬液1 0 t l 置于e p 管中，加入0 4 台盼兰1 0 t l ，混合后取 1 0 u l 滴入血球计数板内，于低倍镜下计数4 角的4 个大方格的活细胞总数，按下 式计数： 细胞浓度( 细胞数m 1 ) = ( 4 个大方格的活细胞总数4 ) 1