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硝酸纤维素膜使用方法及作用 硝酸纤维素膜又称为 NC 膜，在胶体金试纸中用做 C/T 线的承载体，同时也 是免疫反应的发生处。 硝酸纤维素膜的原理： 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质， 对蛋白有很强的结合能力， 而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol 类）、常规显色、 染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC 膜的使用也很简便，比如不需要甲醛 预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就 可以了；比如 NC 膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到 NC 膜上 的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， 不过要注意的是纯的硝纤膜在比 较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途-因为经不 起多次“折磨”。 选择硝酸纤维素膜的的注意事项： 1选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常 20KD 以上的大分子蛋白用 0.45um 孔径的膜，小于 20KD 的话建议选择 0.2um 的，如果小于 7KD 的话最好选 择 0.1um 的膜。 2 还要注意选择纯的 NC 膜-混有含醋酸纤维 （CM） 的 NC 膜结合力会有所降低。 选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常 20KD 以上的大分子蛋白用 0.45um 孔径的膜，小于 20KD 的话建议选择 0.2um 的，如果小于 7KD 的话最好选 择 0.1um 的膜。 硝酸纤维素膜的应用技巧： 1蛋白与膜的结合原理蛋白与膜的结合原理，已知的结合力包括疏水作用力、H 键、静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。 主要有两种假说： 1).首先两者靠静电作阻力结合， 然后靠 H 键和疏水作用来维持长时间结合。 2).首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。两条假说， 都表明其结合过程分为两步， 首先结合和后面长时间结合。 由于结合原理的不明 确性， 导致在这方面的工作非常依赖实践经验。 2.生物原料，缓冲溶液的试剂和配方 1).生物原料； 作为 C/T 线的生物原料使用情况各异， 所以这里只做略述。 首先， 单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体， 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表 面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化 难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。 2).缓冲液； 大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方， 包括缓冲液， 封闭液等等处理溶液配方。不同的反应体系需要不同的配方来支持，而不同机构 的反应体系又有差异。 缓冲液的构成一般是： PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针 对某一特定问题)+pH 调整。我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原 则为宜简不宜繁， 根据自己的需要添加作用物质， 原来的很多需要添加的作用物 质， 由于膜制造技术的改进已经不再需要。 推荐的缓冲体系为 0.01M PBS pH7-7.2 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。作用物质的情况大致罗列如下： 少量 NaCl，减少信号强度，消假阳。有机醇(甲醇，异丙醇等)，润湿膜，减少 膜带有的静电， 利于结合包被。 个人不推荐， 因制膜工艺改进。 表面活动剂(TW20， TX100)，增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。糖，保护剂，减缓老化 速度，也可以增加亲水力同上。调 pH 到某个位置，可以消假阳。 3.点样环境环境湿度对点膜过程非常重要。 最佳湿度一般在 45-65%。 湿度过低， 膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高， 膜上毛细作用加强，点膜容易引起 CT 线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度 的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。 4.点样仪器与膜面情况的关系目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式。 非 接触点膜式优于划膜式， 进口划膜式优于国产划膜式。 因划膜式为软管将抗体划 到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕。进口的划膜 机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留 下的划痕也就比较严重。划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在 T 线位置出现若有若无一条细线(鬼线)， 而跑板结束后鬼 线消失的奇怪现象。 5.膜的宽度与点样位置膜的宽度一般有 18mm(or20mm)和 25mm 两种，分别使用在 做测试条和做测试板上。然而，不同的 T 线点样位置将带来不同的灵敏度。点样 位置上移，金标复合物通过 T 线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。 反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。 6.溶液在膜上的扩散溶液在膜上的点样量一般情况下为 1l/cm。溶液在膜上的 扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液， 但当干燥时线条边缘的干燥 速度高于中间， 中间的抗体会不断向两边扩散， 所以干燥后抗体是向线条的两端 聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现 象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。 7.点膜前后的封闭作用从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的， 直 接点膜就可使用。 然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。 其实封闭不象大家 认为的那样，一封闭什么问题都解决了。 老问题走了新问题又来了，而且更麻 烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜 时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必 然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有 厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决， 封闭必 然是下测。我经常使用的封闭手法有两种。流动封闭，将作用物质处理在样品垫 上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使 用 BIODOT 的 AIRJET 喷头。 可以将不合格的半成品大板重新复活。 只要是将封闭 做在了膜上， 就必然会对产品的稳定性造成影响。 具体的影响程度要通过稳定性 测试来评判 8.膜的储存刚生产出的膜一般含有 5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论 支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得 疏水，带电荷并变脆。