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羧甲基壳聚糖合成中 特殊杂质的分析及合成路线优化 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： l l 、帆v 吣 1 帆8 删7 删- 8 2 9 5 粥场乌 初刷名翁 1 以勉 一射。 p 吻 卜? ，、_ j 。 ；一 一f ， 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：土夸哆签字日期：如幻年s 月珞日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社 用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：上夸耄 导师签字： 乙毛、锋 签字日期：弘协年岁月彬日签字日期：压班年j 7 月z i 铂 1 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 摘要 羧甲基化是开发利用壳聚糖对其进行化学修饰的方法之一，其产物羧甲基壳 聚糖无毒，水溶性优，应用前景广阔。羧甲基壳聚糖的合成，一般采用氯乙酸法。 本实验室首次发现，羧甲基壳聚糖中存在一种小分子特殊杂质二甘醇酸 ( d g a ) ，具有一定的细胞毒性，对羧甲基壳聚糖的临床应用造成干扰。 本文以羧甲基壳聚糖中特殊杂质d g a 为研究对象，根据其理化性质建 立了相应的高效液相检测方法，探讨了杂质d g a 的生成原因，并以产物羧甲基 度和杂质d g a 生成量两项为综合指标，优化了羧甲基壳聚糖的工艺合成路线。 本文建立的二甘醇酸检测色谱条件为：色谱柱：a t l a n t i sc 1 8 ( 5 1 1 m ， 1 5 0 m i n x 4 6 m m i d ) 柱；流动相：甲醇1 0 m m o l - l - 1 磷酸二氢钾( p h2 5 0 ) = 3 9 7 ( v ) ；流速：0 6m l 。m a n 1 ；柱温：3 0 ；检测波长：k = 2 0 4l l m ；杂质样品提 取液：甲醇水( 8 2 ) 。 羧甲基壳聚糖的最终优化合成路线为：反应温度5 0 ，反应时间3 h ，壳聚 糖与n a o h 质量比1 ：4 ，n a o h 与氯乙酸质量比1 ：1 ；羧甲基壳聚糖的合成提 纯步骤同步优化。 本文首次发现了羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质d g a ，建立了相应的专属的 h p l c 检测方法，优化了羧甲基壳聚糖的合成工艺，为羧甲基壳聚糖的质量控制 提供了新的指标与方法学依据，从而为羧甲基壳聚糖的进一步生产应用奠定了良 好的基础。 关键词；羧甲基壳聚糖；二甘醇酸；1 p l c ；合成优化 s t u d yo nas p e c i a li m p u r i t yi nc a r b o x y m e t h y l a t e d c h i t o s a na n d s y n t h e s i so p t i m i z a t i o n c a r b o x y m e t h y l a t i o ni so n eo f t h es t r a t e g i e st op e r f o r mt h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o n o fc h i t o s a nf o re x p l o i t a t i o n ，w h o s ep r o d u c ti sn o n t o x i c ，诵也g o o dw a t e rs o l u b i l i t ya n d v i ，i d e p e r s p e c t i v e c h l o r a c e t i c a c i dw a s u s u a n y u s e di n t h e s y n t h e s i s o f c a r b o x y m e t h y l a t e dc h i t o s a n ( c m c ) i tw a st h ef i r s tt i m en l a t0 1 1 1 l a b o r a t o r yf o u n dt h a t ai m p u r i t yn a m e dd i g l y c o l i ca c i d ( d g a ) w a sm i x e dw i t h i nt h ec m c ，w h i c hc a u s e d s l i g h tc e l lt o x i c i t ya n di n t e r f e r e di t sc l i n i c a la p p l i c a t i o n t h i st h e s i sa i m e dt os t u d yt h es p e c i a li m p u r i t y - - d g ai nc m c ah p l cm e t h o d h a sb e e ne s t a b l i s h e dt oa n a l y z ed i g l y c o l i ca c i db a s e do ni t sp h y s i c a la n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s i n t h i s t h e s i s ，t h es y n t h e s i s r o u t ew a so p t i m i z e d c o n s i d e r i n g t h e c a r b o x y l a t e dd e g r e ea n dt h eq u a n t i t yo fd i g l y c o l i ca c i d aw a t e r sh p l cs y s t e me q u i p p e dw i t haa t l a n t i sc - 18 ( 5p m ，15 0 m i n x 4 6 m m t o ) c o l u m n ，s e ta tat e m p e r a t u r eo f3 0 w a su s e di nt h i ss t u d y t h em o b i l ep h a s ew a s c o m p o s e do fm e t h a n o la n dlo m m o l 。l - 1p o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e ( k d p ) ( p h 2 5 0 ) ( 3 9 7 ，v v ) t h ef l o wr a t ew a s0 6m l 。m i d 1 ，t h ed e t e c t e dw a v e l e n g t hw a s 2 0 4n m ，a n dt h ee x t r a c tw a sm o l m n o l w a t e r ( 8 2 ，v v ) t h ef i n a l o p t i m a l r o u t ew a sa sf o l l o w s ：r a t eo fr e a c t a n t s w e i g h t w a s w ( c h i t o s a n ) ：w o q a o h ) = 1 ：4 ，w ( n a o h ) ：w ( c i c h 2 c o o h ) = i ：1 ，a n dr e a c t i n g t e m p e r a t u r e5 0 。c ，r e a c t i n gt i m e3h o u r s t h ew a yf o rc l e a n i n gc m cw a sa l s o o p t i m i z e di nt h i st h e s i s i nt h i st h e s i s ，as p e c i a li m p u r i t y - - d g aw a sf o u n df o rt h ef i r s tt i m ei nt h e s y n t h e s i so fc m c ，t h es p e c i f i ch p l ca n a l y s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e d ，t h es y n t h e s i s r o u t eo fc m cw a so p t i m i z e d a l lo ft h e s ew o r ko f f e r e dt h eq u a l i t yc o n t r o li n d e xa n d t h es o l i df o u n d a t i o nb a s e do nw h i c ht of u r t h e rd e v e l o pc m c k 呵w o r d s ：c a r b o x y m e t h y r l a t e dc h i t o s a n ：d i g l y c o l i ca c i d ：h p l c ：s y n t h e s i s o p t i m i z a t i o n 羧甲基壳聚糖合成 目录 前言一1 l 甲壳素、壳聚糖简介”1 1 1 一般理化性质2 1 2 甲壳素、壳聚糖的生物活性2 1 3 甲壳素、壳聚糖在医药领域的应用3 1 4 甲壳素、壳聚糖的化学改性及应用研究4 2 羧甲基壳聚糖一7 2 1 羧甲基壳聚糖的制备7 2 2 羧甲基壳聚糖的应用1 1 3 常用药物中特殊杂质含量测定的分析方法一”13 3 1 光谱法“1 3 3 2 色谱法1 4 3 3 热分析法16 4 原料药和制剂分析中常用的样品处理方法1 7 4 1 非有机破坏分析方法1 8 4 2 有机破坏分析方法18 4 3 用过滤或萃取的手段除去扰1 8 4 4 用固相萃取的手段除去干扰1 9 5 论文思路”l9 第一章羧甲基壳聚糖中特殊杂质的高效液相分析方法的建立2 0 l 弓l 言”2 0 2 实验材料2 0 2 1 药品2 0 2 2 试剂2 0 2 3 仪器”2 1 3 特殊杂质的高效液相分析方法的建立2 1 3 1 色谱条件2 1 - 3 2 样品前处理方法2 1 3 3 标准溶液的制备2 1 3 4 方法学验证2 2 4 结果与讨论2 3 4 1 检测波长的选择2 3 4 2 流动相的选择2 3 4 3 样品前处理方法确定2 5 4 4 方法学验证2 6 4 5 精制前后药品的杂质检测对比2 9 5 本章小结”3 0 第二章羧甲基壳聚糖合成工艺条件优化3 1 l 弓i 言一3 l 2 实验材料“y 一3 1 2 1 药品与试剂3 1 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 2 2 仪器3 2 3 羧甲基壳聚糖的制备”3 2 3 1 脱乙酰度( d d ) 的测定一3 2 3 2 羧甲基壳聚糖制备步骤3 3 3 3 电位滴定法测定羧甲基度( d s ) 3 3 4 正交试验设计”3 4 5 结果与讨论3 5 5 1 壳聚糖脱乙酰度的测定3 5 5 2 产物羧甲基度滴定图表征3 5 5 3 反应母液液相色谱图3 6 5 4 空白实验检验3 6 5 5 改变氯乙酸加入方式对结果的影响3 6 5 6 正交试验结果”3 7 5 7 由正交试验引发的分段实验设计”4 0 5 8 关于样品提纯方式的讨论4 8 6 本章小结4 9 第三章结论”5 0 参考文献5 2 致谢5 7 2 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 - i 一- j l 刖罱 我国是水产品资源丰富的国家，随着水产加工业的发展，虾、蟹壳等废弃物 越来越多，在这些节肢动物的甲壳中，存在着大量类似纤维素的物质甲壳素， 其每年的生成量上百亿吨，如果将这些资源利用起来，不仅可变废为宝，减少环 境污染，同时还可以加大水产品资源利用率，实现水产品的高值化【l 】。 1 甲壳素、壳聚糖简介 自从1 8 1 1 年法国科学家h b r a c o n n o t 从菌类中发现甲壳素和1 8 9 4 年 h o p p e s t y l e r 将甲壳素与k o h 在1 8 0 c 熔融得到壳聚糖以来1 2 1 ，科学家对此类化 合物进行了大量的基础和应用研究，使甲壳素和壳聚糖在纺织、印染、造纸、医 药、食品、化工、生物、农业等众多领域得到广泛应用 3 - 5 1 。 甲壳素( c h i t i n ) 又名甲壳质、几丁质、壳多糖、聚乙酰氨基葡萄糖等同， 是一种维持和保护甲壳动物和微生物躯体的线性氨基多糖，广泛存在于节肢动物 如各种虾类、蟹类等甲壳类和昆虫类如独角仙、蟋蟀及其它动物的骨骼与生物表 皮中，也存在于真菌和藻类的细胞壁中川。甲壳素是自然界中贮量仅次于纤维素 的第二大可再生资源，每年生物合成近十亿吨之多，在蟹、虾、龙虾等水产品加 工后的甲壳废弃物中甲壳素的含量达到1 0 - 3 0 。甲壳素的化学名为b ( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧一d 葡聚糖，也称为聚科乙酰基- d 葡糖胺) ，其分子量一般都在 1 0 0 万以上i s 。 睡o 。1 l - t s 意。h 。 o 壳聚糖( c h i t o s a n 简称c t s l 9 1 ) 又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性 甲壳素等，是由甲壳素经脱乙酰化反应转化变成的分子量为1 2 5 9 万的生物大分 子。壳聚糖的化学名为聚( 1 ，4 ) - 2 氨基2 脱氧b d 一葡聚糖。其分子链中因脱乙酰 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 基不完全，通常含有2 乙酰氨基葡萄糖和2 氨基葡萄糖两种结构单元，两者的 比例随脱乙酰化程度而异。 0 1 1 一般理化性质 o c k t o s 粕 0 1 1 1甲壳素的一般理化性质 甲壳素为白色或灰白色半透明片状固体，于大约2 7 0 分解，它无毒、无味、 耐酸碱、耐腐蚀、耐高温、耐日光，性能十分稳定，不溶于水、稀酸、稀碱和乙 醇、乙醚等一般有机溶剂。能溶于浓无机酸，但同时其主链发生降解，产物的粘 度也随之降低。 1 1 2 壳聚糖的一般理化性质 壳聚糖为阳离子聚合物，白色或灰白色、略带珍珠光泽的半透明片状固体， 约1 8 5 c 分解，不溶于水和碱溶液及一般有机溶剂。它能与多种稀酸如盐酸、醋 酸、苯甲酸、环烷酸等结合形成盐类而溶于水中【m l 。因制备工艺条需求的不同， 脱乙酰度由6 0 至10 0 不等【1 2 1 。脱乙酰度和平均分子量是其两项主要性能指标。 产品粘度不同可将其分为高粘度( 粘度大于l p a s 的1 壳聚糖醋酸溶液) 、中 粘度( 粘度在o 1 0 2p a s 之间的1 壳聚糖醋酸溶液) 和低粘度( 粘度在 0 0 2 5 - 0 0 5p a s 之间的1 壳聚糖醋酸溶液) 三大类【1 3 1 。 1 2 甲壳素、壳聚糖的生物活性 1 2 1 抑菌活性 脱乙酰度为3 0 和7 0 的甲壳素能提高宿主抗s e n d a i 病毒及大肠杆菌感染 的能力【1 2 1 。壳聚糖是抗菌谱较广的天然抗菌物质，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴 2 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 性菌及白色念珠菌均有明显的抑制作用1 1 4 1 。 1 2 2 免疫活性 壳聚糖分子上有大量氨基，巨噬细胞和t 淋巴细胞表面带有负电荷，正负 电荷相互吸引而激活这些免疫细胞，从而启动免疫系统，产生各种免疫球蛋白， 增强机体的细胞免疫应答【1 5 】。 1 2 3 抗癌活性 甲壳素可以选择性地凝聚白血病的l 1 2 1 0 细胞、e h r l i c h 腹水癌细胞，对正 常的红血球骨髓细胞无影响【1 6 1 。壳聚糖对某些恶性癌细胞和体内肺癌有抑制和 治疗作用，对正常的宿主器官基本无副作用【1 7 1 。 1 2 4 促进组织修复及止血作用 甲壳素及其降解产物都带有一定的正电荷，能从血液中分离出血小板因子 _ 4 ，增加血清中血红蛋白水平，或促进血小板聚集启动凝血系统。作为止血剂有 促进伤口愈合、抑制伤口愈合中纤维增生、并促进组织生长的功能，对烧、烫伤 有独特疗效。 1 2 5 降血压、降血脂、降血糖 医学研究表明，带正电荷的壳聚糖对于血压降低、减少脂类乳化及抑制血糖 上升有明显疗效u 8 1 。 1 3 甲壳素、壳聚糖在医药领域的应用 甲壳素、壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，降解产物一般对人体 无毒副作用，在体内不积蓄，无免疫原性，因而在生物医学领域有着极广阔的应 用前景。 1 3 1 人工皮肤 用甲壳素、壳聚糖等原料作成的人工皮肤吸水性、透气性好，具有良好的生 物相容性和抗病毒性，能促进创面愈合。甲壳素无纺布人工皮肤用于整形内科、 皮肤科作为一、二度烧伤、采皮伤、植皮伤以及肤介伤的被覆保护材料，无刺激 和无过敏性反应，较常规疗法速度快得多0 3 , 1 9 1 。 1 3 2 手术缝合线 用壳聚糖纤维制成的手术缝合线材料柔软，易打结，机械强度高，易被机体 3 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 吸收，不改变皮肤胶原蛋白中羟脯氨酸，无炎症反应刚。 1 3 3 抗凝血剂 甲壳素、壳聚糖经硫酸酯化后的结构与肝素类似，体外一般具有1 5 - - 4 5 的 肝素活性，具有较高的抗凝血活性【2 l - 2 2 1 。其抗凝血效果与分子量关系较大，也与 脱乙酰度、硫酸酯化度等因素有关。由于其抗凝血性、通透性，可制成人工透析 膜。 1 3 4 药物缓释剂 壳聚糖膜无毒，可内服，无任何副作用，可做为理想的药物缓释膜材料。甲 壳素和壳聚糖用于制各药物控释膜，酸性药物的透过性好于碱性药物，小分子量 药物透过性好于大分子了药物。壳聚糖作为缓释剂可使药物的释放受到控制，血 药浓度平衡，保持在有效浓度范围内，延长有效时间而不出现毒性，提高药物的 生物利用度田1 。 1 3 5 其他 除了上述应用研究外，甲壳素和壳聚糖还有诸多功能。如对胃肠道循环具有 调节功能刚，强化肝脏功能】，减肥洲，作药物增稠剂圆，还可用于治疗过敏 性皮炎，预防龋齿和牙周炎，除去和减轻口臭 2 0 1 等。 1 4 甲壳素、壳聚糖的化学改性及应用研究 由于甲壳素在一般的溶剂中不容易溶解，壳聚糖也只能溶解于某些稀酸，限 制了其应用范围。近年来，国内外学者对甲壳素和壳聚糖的化学改性开展研究， 大大拓宽了其应用领域。 4 羧甲基壳聚 c h i t i n d e r i v a t i v e so fc h i t i na n dc h i t o s a n c h i t o s a n 1 4 1 酰化反应 甲壳素和壳聚糖通过与酰氯或酸酐反应，在大分子链上导入不同分子量的脂 肪族或芳香族酰基。酰化反应可在羟基( o 酰化) 或氨基 一酰化) 上进行f 2 6 1 。酰化 甲壳素可应用于化妆品方面，用作防晒护肤品的添加剂1 2 7 ；酰化壳聚糖可应用 与环境分析方面，用作分子筛或液相色谱载体【1 3 1 。 1 4 2 烷基化反应 烷基化反应可以在甲壳素的羟基上( o 烷基化) ，也可以在壳聚糖的氨基上 ( n 烷基化) 进行，以n 烷基化较易发生。一般是甲壳素碱与卤代烃或硫酸酯反应 生成烷基化产物。壳聚糖的烷基化反应主要发生在c 2 上的二n h 2 上，c 3 、c 6 位的一o h 上也可发生取代反应。烷基化的壳聚糖可用于化妆品和医学方面【捌。 1 4 3 醚化反应 甲壳素碱与氯代烷基酸或乙醛酸反应，在甲壳素或壳聚糖的氨基上引入羧烷 基基团，得到溶于水的羧烷基甲壳素或羧烷基壳聚糖。研究最多的羧甲基化反应， 可以得到羧甲基甲壳素( c m - c h i t i n ) ，包括o 羧甲基壳聚糖( o c m c h i t o s a n ) ，n 一 羧甲基壳聚糖叫一c m - c h i t o s a n ) 和o - n 羧甲基壳聚糖( o - n c m c h i t o s a n ) 。醚化甲 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 壳素在化妆品、环境保护、医药、食品方面具有广泛的应用1 2 7 净3 l 】。 1 4 4 酯化反应 常见的酯化反应有硫酸酯化和磷酸酯化【3 2 】。硫酸酯化试剂主要有浓硫酸、 s 0 2 、s 0 3 、氯磺酸等，通常发生在c 6 位的o h 上。磷酸酯化反应一般是在甲磺 酸中与甲壳素或壳聚糖反应。高取代度的壳聚糖磷酸酯化物溶于水，而低取代的 不溶于水。 1 4 5s h i f t 碱反应 壳聚糖上的氨基可以与醛酮发生s h i f t 碱反应，生成相应的醛亚胺和酮亚胺 多糖跚。可用此反应来保护游离n h 2 ，在羟基上引入其它基团；或用硼氢化钠 还原得到n 取代的多糖。这种还原物对水解反应不敏感，有聚两性电解质的性 质。 o k o h 1 4 6 壳聚糖季铵盐【3 3 1 用缩水甘油三甲基氯化铵对壳聚糖进行化学结构修饰，可在壳聚糖分子中引 入铵盐基团，制得壳聚糖季铵盐，主要发生在壳聚糖分子中亲核中心位的氨基上。 在壳聚糖中引入位阻大、水合能力强的季铵盐基团，也能大大削弱壳聚糖分子间 的氢键，增大壳聚糖衍生物的水溶性。 1 4 7 其他反应 甲壳素、壳聚糖的化学改性除了以上提到的外，还有接枝反应、交联反应、 水解反应、螯合反应等，为它们在农业、食品工业和医药学领域的应用提供了可 6 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 行性。 2 羧甲基壳聚糖 羧甲基壳聚糖是一种无定形纤维状或粉末状的固体，色泽为白色、淡黄色或 黄色，与壳聚糖原料近似。羧甲基壳聚糖是水溶性的，其分子中含有氨基和羧甲 基基团，是一种两性聚电解质。它既保持了甲壳素、壳聚糖的抗菌性、保湿性、 抗凝血、抗肿瘤、促进伤口愈合、无毒、无味、生物相容性良好等优良特性，并 且溶解性良好，可溶于水、酸性和碱性等多种溶液，极大的扩展了其在生物医学 领域中的应用。 2 1 羧甲基壳聚糖的制备 在众多的壳聚糖衍生物中，羧甲基壳聚糖的研究较早，也最令人瞩目。由于 壳聚糖分子链节上含有o h 基和已裸露的- n h 2 基，进行羧甲基化反应的活性顺 序刚是c 6 o h c 3 o h c 2 - n h 2 ，所以可以利用壳聚糖各反应位点的活性差异， 通过控制反应条件来制备不同取代位点的羧甲基壳聚糖：o 羧甲基壳聚糖，n 羧甲基壳聚糖及n ，o 羧甲基壳聚糖。 7 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 ；簿羧嗽聚糟j：繇羧甲基壳聚弗雾 ：1 。? - 1 t ：t iej一一1 ? 辩辩宁摹枣暴壤 2 1 1 以壳聚糖为原料合成羧甲基壳聚糖 传统的羧甲基壳聚糖合成方法一般分为：溶胀、碱化、羧甲基化、提纯四个 步骤。其中溶胀，采用乙醇、异丙醇等有机溶剂浸泡数小时即可；碱化，采取 n a o h 浓度为3 8 一6 0 的碱液为佳，温度可控制在2 0 6 0 之间，且时间也是 一个关键的控制参数；羧甲基化，将适量的氯乙酸加到碱化后的壳聚糖中，控制 反应温度、反应时间，数小时后得粗品；最后一步为提纯，提纯的目的是除去反 应过程中生成的盐类，一般采用7 5 或8 0 的乙醇或甲醇溶液进行洗涤1 3 5 - 3 6 。 异丙醇氯乙酸 ll 壳聚糖一粉碎_ + 搅拌分散保温反应。洗涤一烘干_ 成品 t n a o h 反应机理为：在碱性环境中，壳聚糖与氯乙酸反应引入羧甲基形成具有强极 性的羧酸盐基结构，因而直接溶解于水。壳聚糖分子结构中有两个羟基( c 3 位和 8 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 c 6 位) 和一个氨基，理论上三者均可引入羧甲基，但3 个基团所处的位置及电负 性大小不同，因而反应活性有差别。氧的电负性大于氮的电负性，因而o h 的亲 核反应大于- n h 2 ；在c 3 位和c 6 位中，因伯醇基( c 6 位) 的反应速度大于仲醇基( c 3 位) ，而且仲醇基上的氢原子可与- n h 2 上的未共用电子对形成氢键，使c 3 位羟基 上的氢不易离去，因而羧甲基化反应的活性顺序是c 6 o h c 3 一o h c 2 - n h 2 。主产 物为o 羧甲基壳聚糖，另外产物中还有少量n 羧甲基壳聚糖单元和n ，o 羧甲基 壳聚糖单元生成。 若加热n 6 0 ，可得到n ，o 一羧甲基壳聚糖3 7 1 。 9 少量 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 螽 瓤露糖甲誊亮兼话 赤量 少量 2 1 2n 羧甲基壳聚糖的制备 壳聚糖溶于乙醛酸水溶液中，形成席夫碱后，用氢氧化钠将p h 值调整至6 ， 再用氢硼酸钠在室温下搅拌处理数小时，使席夫碱还原，将反应液倒入乙醇中， 将会析出白色沉淀物，过滤，取滤出物用无水乙醇及丙酮洗涤后，在五氧化二磷 存在下，真空干燥得到白色粉末的n 一羧甲基化壳聚糖产品1 3 8 - 3 9 1 。 2 1 3 微波法合成羧甲基壳聚糖 用微波辐射代替传统的加热方法提高加热的效率，使反应时间大大缩短，适 当提高反应收率。 将预处理过的壳聚糖在异丙醇中制成悬浮液，于搅拌下等份加入一定浓度的 n a o h ，然后再将固体氯乙酸分间隔等份加到上述悬浮液中，将制好的样品放置 到微波炉中，微波辐射若干分钟，后加入冷蒸馏水混匀，并用冰醋酸将p h 值调 1 0 羧甲 到7 0 ，然后将反应后的混合物过滤，固体产物依次用7 0 的甲醇水溶液、无水 甲醇洗涤，所得的羧甲基壳聚糖再真空干燥箱中6 0 c 真空干燥嗍。 2 1 4 半微波法合成羧甲基壳聚糖【4 1 】 取若干经纯化超微波粉碎的壳聚糖，按照1 ：2 5 l ：2 5 比例加入3 5 氢氧 化钠溶液，加活化剂( 对甲苯磺酸、聚乙二醇、四丁基溴化铵、二甲亚砜中的一 种或其混合物) ，少量3 0 过氧化氢，混合均匀装入反应器中，采用1 0 0 3 0 0 w 微波5 1 0 分钟，置于1 0 以下温度冷却，冷却后加入3 0 氯乙酸微波三次，冷 却后再加入氢氧化钠，微波，冷却即制成成品，再经过甲醇和乙醇洗去多余的氯 乙酸、氢氧化钠即制成纯品。 2 2 羧甲基壳聚糖的应用 羧甲基壳聚糖与甲壳素和壳聚糖相比，溶解性增加，水溶性提高，使之具有 成膜、增稠、保湿、絮凝、螯合等特性，为应用提供了方便。 2 2 1 医学领域的应用 2 2 1 1 降脂和防治动脉硬化 动物实验表明羧甲基壳聚糖具有降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白 胆固醇的作用，而对高密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白均无明显变化。 2 2 1 2 抗肿瘤 小分子壳聚糖具有优良的抗肿瘤活性，特别是壳聚糖六聚糖具有很强 的抑制肿瘤盼作用。 2 2 1 3 术后防黏连1 4 2 】 心包黏连心脏手术后心包黏连增加了术后发病率和死亡率，实验证明羧甲基 壳聚糖可防止心脏手术后心包黏连，提高手术的安全性和有效性。 药理学研究表明羧甲基壳聚糖在术后防黏连过程中的分子机制为：减小炎症 细胞浸润，有效减少成纤维细胞的增殖和胶原的形成，从而减少炎症反应和纤维 细胞增生而起到减少黏连的作用。另外，羧甲基壳聚糖还可用于腹腔手术4 3 1 ， 防止腹膜黏连，效果也较为理想。 2 2 1 4 生物医用材料 羧甲基壳聚糖具有生物相容性、可降解性、可塑性、杀菌性等优点，作为组 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 织工程材料已被广泛应用。羧甲基壳聚糖可应用于伤口贴、包扎带、人造骨骼和 人造皮肤以及酶的固定化载体等方面。 由于羧甲基壳聚糖形成的凝胶粘度和弹性大于血浆，可阻止血液在组织表面 凝结从而阻止粘结 4 4 4 5 1 ，可将其凝胶或膜做成伤口贴、包扎带用于外科伤口。 2 2 1 5 抗菌抗感染 羧甲基壳聚糖及其多种衍生物均具有不同程度的抗感染作用，以壳聚糖 六聚糖为最强。小分子的脱乙酰壳聚糖具有质子化铵，质子化铵与细菌带 负电荷的细胞膜作用，吸附和聚沉细菌，同时穿透细胞壁进入细胞内，扰 乱细菌的新陈代谢及合成而具有抗菌作用。口服羧甲基壳聚糖具有促进肠内 共生有益菌群的繁殖如双歧杆菌的繁殖，抑制有害菌的生存，提高身体免疫力， 有显著的降血脂及胆固醇的作用，并能清除机体内的铅、汞h 6 - 4 q 。 2 2 1 6 新型补铁剂 利用n ，o 羧甲基壳聚糖与亚铁离子络合的基本特性，可以用于治疗缺铁性 贫血，因为人体对羧甲基壳聚糖壳聚糖亚铁络合物的吸收远远大于传统的 f e s 0 4 药物，这方面的研究以期为开发天然生物补铁制剂开辟新途径【4 8 】。 2 2 2 农业领域的应用 羧甲基壳聚糖可作为一种新型的植物蛋白质生长调节剂，提高玉米等粮食和 蔬菜的品质和蛋白质的含量。当n c m c 作为生长调节剂应用玉米、马铃薯用时， 可使贮存蛋白质的含量增加2 3 成，应用于西红柿，使贮存蛋白质含量倍增1 4 9 1 。 羧甲基壳聚糖本身就是生物农药，它可以作为植物病原菌生长抑制剂，杀线 虫剂，还可以作为农药的载体，生产低毒、高效、优质的农药i 姗。 2 2 3 食品工业领域的应用 n ，0 c m c 水溶液形成的薄膜对气体有选择性的通透，特别适合于作为水果 保鲜剂【5 1 】。美国和加拿大有一种商品名为t n u t r i s a v e ”的n o c c 水果保鲜剂已经 上市。国内近几年来，研究了n ，o c m c 对猕猴桃、草莓、水蜜桃等水果的保鲜 作用【5 2 。5 3 1 。 n c m c 的螯合性能在保存肉类方面发挥了有利的作用，它能避免己醛和不 愉快气味的形成，起抗氧化的效果1 5 4 删。例如，美国学者用n 羧甲基壳聚糖制 成肉食防腐剂，此防腐剂可用于防止熟牛肉、鱼、禽，蛋以及日用食品的酸败和 1 2 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 变味，其效果很好，是一种理想的防腐剂【5 6 1 。 2 2 4 化妆品领域的应用 n c m c 由于优良的水溶性、乳化性、成膜性能而适用于作为水质化妆品的 功能性成分网。特别是对口腔中典型的蛀齿细菌有非常高的抑菌作用，可作为 牙膏的配方成分【锄。n ，o c m c 也具有较好的润湿性。其润湿作用类似于透明 质酸，能成膜，具有乳化稳定作用，增稠作用，适用于化妆品膏、乳、霜的各种 配方，与配方中各种成分相容性好1 5 9 1 。 3 常用药物中特殊杂质含量测定的分析方法1 6 0 i 药物杂质是指在药物制备和贮存过程中，合成过程中产生的副产物，或由于 药物性质不稳定而产生的降解产物等，多指有机杂质，也包括残留溶剂和手性化 合物中无特殊毒性的对映体【6 1 1 。药物中含有特殊杂质可能会降低疗效和影响稳 定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他毒副作用。因此，特殊杂质检查是确 保用药安全、有效，保证药物质量的一个重要方面【6 2 l 。 特殊杂质的检查主要是根据药物和特殊杂质在理化性质上的差异来进行 【6 3 】。药物中特殊杂质的检测方法有很多，主要包括光谱法、色谱法及热分析法， 此外还有一些更专一、高效、快捷的检测技术，如毛细管电泳法( c e ) 、超临界 流体色谱法( s f c ) 及联用技术等。 3 1 光谱法 光谱检查法是依据药物和药物中的杂质对光选择吸收性质的差异，通过相对 系数的测定来进行杂质检查的。 3 1 1 紫外分光光度法 利用药物与杂质紫外特征吸收的差异进行检查，如果药物在杂质的最大吸 收波长处没有吸收则可在此波长处测定样品溶液的吸光度，通过控制样品溶液的 吸光度来控制杂质含量。凭借其灵敏度高、操作简便、重现性好等优点，紫外分 光光度法已成为杂质检测应用晟广泛的方法之一。 3 1 2 原子吸收分光光度法 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 原子吸收分光光度法是一种灵敏的测定方法，广泛用于微量元素的分析，在 杂质检查中，主要是用于药物中重金属杂质的检查，通常采用标准加入法控制金 属杂质的限量：取供试品，按各品种项下的规定，制各供试品溶液；另取等量的 供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照品溶液。若对照品溶液的读数为 a ，供试品溶液的读数为b ，则b 值应小于( a - b ) 值。 3 1 3 火焰光度法i 叫 中华人民共和国药典2 0 0 5 版中还收载了火焰光度法，它是将含待测元素杂 质的供试品溶液用喷雾装置以气溶胶形式引入火焰光源中，靠火焰的热能将供试 品元素原子化并激发出它们的特征光谱，通过光电检测系统测量出待测元素特征 光谱的光强程序，以此求出供试品中待测元素杂质的含量。 此外，旋光分析法主要受到物质旋光度的限制，在特殊杂质检查中应用并不 广泛；红外分光光度法仅用于检查药物中的低效( 或无效) 晶型；核磁共振谱只 能进行特殊杂质的结构确证及定性检查。 3 2 色谱法 药物中的有机杂质多为未反应完全的原料、中间体、副产物、降解产物等， 在药物的精制过程中未能除尽，其结构和性质往往和药物相近，比如药物和杂质 与某些试剂的反应相同或相似，或者它们的光谱特征相似，这就难以采用上述方 法对杂质进行检查。由于色谱法可以利用药物与杂质的色谱性质的差异，能有效 地将杂质与药物进行分离和检测，因而色谱法广泛应用于药物中杂质的检查。 3 2 1 薄层色谱法 t l c 法被许多国家药典用于药物中杂质的检查，具有设备简单、操作简便、 分离速度快、灵敏度和分辨率较高等优点，并可以同时应用多种检视斑点的方法， 获得更多的杂质信息。常用的方法有： ( 1 ) 杂质对照品法：适用于已知杂质并能获得杂质对照品的情况。根据杂质 限量，取供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液，分别点样于同一薄层板上， 展开、斑点定位，将供试品溶液除主斑点外的其他斑点与相应的杂质品对照溶液 或系列杂质对照溶液的主斑点进行比较，判断药物中杂质限量是否合格。 ( 2 ) 供试品溶液自身稀释对照法：适用于杂质的结构不能确定，或无杂质对 1 4 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 照品的情况仅限于杂质斑点的颜色与主成分斑点颜色相同或相近的情况下使用。 方法为配制一定浓度的供试品溶液，然后将供试品溶液按限量要求稀释至一定浓 度作为对照溶液，将供试品溶液和对照溶液分别点样于同一薄层板上，展开、斑 点定位。结果判断：供试品溶液所显杂质斑点与自身稀释对照溶液系列或系列自 身稀释对照溶液所显主斑点比较，不得更深。 ( 3 ) 杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用：药物中存在多个杂质 时，其中已知杂质有对照品时，采用杂质对照品检查；共存的未知杂质或没有对 照品的杂质，可采用供试品溶液自身稀释对照法检查。 ( 4 ) 母体药物对照法：当无适合的杂质对照品，或只是供试品显示的杂质斑 点颜色与主成分班点颜色有差异，难以判断限量时，可用母体药物作为对照品， 此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，难以判断限量时，可用母体药物作 为对照品，此对照药物中所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。 3 2 2 高效液相色谱法1 6 5 】 h p l c 因其分离效能高、专属性强和检测灵敏，可以准确地测定各组分的峰 面积，在杂质检查中的应用日益增多，对于使用h p l c 法测定含量的药物，可采 用同一色谱条件进行杂质检查阁。采用h p l c 法检查杂质，c l a p 规定应按各品 种项下要求，要进行色谱系统适用性试验，以保证仪器系统达到杂质检查要求。 h p l c 杂质测定方法主要分内标法和外标法两种。 采用h p l c 检测杂质时，还应注意以下问题：检测器的选择：目前可用于 h p l c 的检测器很多1 6 7 - 6 s ，已根据对杂质结构的分析进行有目的地选择。因大多 数药物及杂质在紫外光区均有吸收，故u v 检测器是常用的检测器。对于在紫外 光区吸收较弱或无吸收的杂质，可采用其他通用型检测器( 如蒸发光散射检测器、 质谱检测器等) 进行研究。二极管阵列检测器( d a d ) 是杂质、特别是复方制 剂中杂质研究的有效手段。通过该检测器可获得各杂质的全光谱信息，有助于判 断杂质检测波长选择的合理性，并可进行峰纯度检查。检测波长的选择：应选 用各杂质均有较强吸收的波长作为检测波长，当一个测定波长无法兼顾所有杂质 时，可选用不同波长分别测定。例如在氯喹那多( c h l o r q u i n a l d 0 1 ) 及有关物质的 h p l c 分析中，用d a d 检测器选择测定波长，氯喹那多在2 5 1 n m 和3 6 0 n t o 处有 最大吸收，有关物质的最大吸收分别在2 5 1 n m 、2 5 3 n m 、2 5 4 n m 处，为了兼顾氯 羧甲基壳聚糖合成中特殊杂质的分析及合成路线优化 喹那多的含量测定，选择测定波长在2 5 1 n m 处。 3 2 3 气相色谱法 气相色谱法用来测定药物中挥发性特殊杂质，特别是各国药典1 6 9 - 7 0 均规定采 用气相色谱法检查药物中的残留溶剂，包括苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、二氧六 环、吡啶及环氧乙烷等【7 1 1 。测定法与高效液相色谱法相同的有内标法加校正因 子测定法、外标法测定法和面积归一化法，不同的有标准溶液加入法，将一定量 的杂质对照品溶液精密加入供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质的含 量，在扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中杂质的含量。也可按以下 方法进行计算： a c x c x = - - - - - - - - - - - - - - - - - ( a i s a x 卜l 式中，c x 为供试品中组分x 的浓度；a x 为供试品中组分x 的色谱峰面积a c x 为所加入的己知浓度的待测组分对照品的浓度；a s 为加入对照品后组分x 的色 谱峰面积。 3 2 4 毛细管电泳法 又称高效毛细管电泳(