（农产品加工及贮藏工程专业论文）γ谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系.pdf

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1 8 0 m i n 内基本呈线性关 系，选择3 0 r a i n 作为最佳反应时间；该酶在5 0 以下具有较好的稳定 性，最适反应温度为4 2 ；在p h 8 0 - 9 0 有较好的酸碱稳定性，最适 p h 值为8 5 ：2 m m o l l 金属盐离子浓度时，c a 2 + 、m d 十对丫谷氨酰转肽 酶的活力有一定的促进作用，灿3 + 、k + 、n 矿对酶活力影响不大，其他 1 ，- 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 金属离子均表现出不同程度的抑制作用，在钙离子浓度低于l o m r n o l l 范围内，对酶均有激活作用。 4 、大蒜绿变验证试验通过验证试验表明丫谷氨酰转肽酶不直接参 与大蒜绿色素的生成，而可能是1 ，一谷氨酰转肽酶参与大蒜体内生理生化 反应，提供二级生成物质并累积到一定量，从而使大蒜具有绿变能力， 蒜氨酸酶参与大蒜绿变过程，但不是唯一条件；通过体外模拟试验证明 氨基酸并未使新蒜变绿。 关键词：大蒜；绿变；y - 谷氨酰转肽酶；蒜氨酸酶；氨基酸 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t g a r l i c ，a i l i u ms a t i v u ml ，i st h ep e r e n n i a lh e r b o fl i l yf a m i l y t h eb u l b o fg a r l i ch a sh i g hn u t r i t i o na n dm e d i c i n ev a l u e 1 1 1 ey i e l do fg a r l i ci nc h i n a i s7 6p e r c e n to ft h ew h o l ew o r l da n dg a r l i ci so f t e nm a d ei n t od i f f e r e n tk i n d s o fp r o d u c t s ，s u c ha sg a r l i cp u r e e ，g a r l i cj n i c e ，d e h y d r a t e dg a r l i cs l i c eg a r l i c p o w d e ra n ds oo n b u tg a r l i cu s u a l l yb e c o m e sg r e e ni nt h em a n u f a c t u r eo f p u r e ea n dt h ep r o d u c t sa r ed a m a g e d i nb o t ha p p e a r a n c ea n dq u a l i t y s oi t s o fg r e a ts i g n i f i c a n c et os t u d yg a r l i cg r e e n i n g i nt h i sa r t i c l e ，t h ea c t i v i t yo f7 一 g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ea n da l l i i n a s e ，a n dt h ea b i l i t yo fg a r l i cg r e e n i n gi n d i f f e r e n ts t a o r a g ec o n d i t i o n sw e r es t u d i e d 7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ew a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e ds u c c e s s f u l l yf r o mg a r l i cb u l b ，a n di t sp r o p e r t i e sw e r e s t u d i e d a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fg a r l i ci nd i f f e r e n tp e r i o d s w a s r e s e a r c h e d r e l a t i o n s h i pb e t w e e n7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e ，a l l i i n a s e ，a m i n o a c i da n dg a r l i cg r e e n i n gw a sc o n f i r m e d t h em a i ns t u d yr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 c h a n g eo fe n z y m ea c t i v i t ya n dg a r l i cg r e e n i n ga b i l i t ya td i f f e r e n t s t o r a g e l o wt e m p e r a t u r ew a sa ni m p o r t a n tf a c t o ro fa c t i v a t i n ga l l i i n a s ea n d a r l i c g r e e n i n g 硼a c t i v i to f3 , - g l u t a m , , t r a n s ) t i d a s e wasgarlic g r e e n i n g h e a c t l v x t yl f l u t a m y lt r a n s p e p t l a a s e 1 c o r r e s p o n d i n gt o t h ea b i l i t yo fg a r l i c g r e e n i n gd u r i n gs t o r a g ep e r i o d a l l i i n a s ep l a y e dav e r yi m p o r t a n tr o l ei ng a r l i cg r e e n i n g 2 s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f 丫- g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e 丫 g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ew a sp u r i f i e du pt o1 4 3 9t i m e s 、析t har e c o v e r yo f 19 4 b yt h em e t h o do fa m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n , h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，c o n a s e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h yc o l u m n 丫 g l u t a r n y lt r a n s p e p t i d a s ei ns e q u e n c e t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to f7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ew a s6 8 ，0 0 0a n di t st w os u b u n i t sw a s5 4 ，0 0 0a n d 14 ，0 0 0r e s p e c t i v e l y 7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s eh a dac a r b o h y d r a t ec o n t e n t o f11 31 t h eg l y c o s i d i cl i n k a g ew a si n f e r r e dt ob en - t y p eb yp - e l i m i n a t i o nt e s t t h em a x i m u ma b s o r p t i o ns p e c t r aw a sa b o u t2 7 5 n m 3 p r o p e r t i e so f7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e k i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c so f 3 , - g l u t a r n y lt r a n s p e p t i d a s ew e r ea sf o l l o w s ：t h ek m w a s10 8 3m m o l la n d 3 十谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 v m a xw a s2 8 6 5 u lu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ee n z y m e c a t a l y z e d r e a c t i o nr a t eo f7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s eh a dag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t h t i m eb e t w e e n3 0 - - - 18 0 m i n , a n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fr e a c t i o nt i m ew a s 3 0 m i n i t so p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r ew a s8 5a n d4 2 0 cr e s p e c t i v e l y i t w a ss t a b l ec o m p a r a t i v e l ya tp hv a l u eo f 乒7a n dt e m p e r a t u r el o w e rt h a n 5 0 0 c c a 2 + ，m g 十h a db e t t e ra c t i v a t i o ne f f e c to n ? - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e t h a n 舢3 + ，k + ，n a 十o t h e rm e t a li o n ss u c ha sf e 2 + ，f e 3 + w e r et h ei n h i b i t i v e f a c t o r so f7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ea c t i v i t y 4 v e r i f i c a t i o nt e s to fg a r l i cg r e e n i n g t h ee x p e r i m e n tp r o v e dt h a t 丫 g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ed i dn o tp a r t i c i p a t ei nt h eg e n e r a t i o no fg a r l i cg r e e n p i g m e n t i tw a sp o s s i b l et h a t7 - g t pi n v o l v e di n p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lr e s p o n s e ，t h e ng a r l i cc o u l dg r e e nw h e ns e c o n d a r yp r o d u c t s a c c u m u l a t e di ns o m ed e g r e e a l l i i n a s et o o kp a r ti nt h ep r o c e s so fg a r l i c g r e e n i n g i tp r o v e dt h a ta m i n oa c i dd i dn o tc a u s eg r e e n i n go f t h ef r e s hg a r l i c b ye x t e r n a ls i m u l a t e dt e s t k e yw o r d s ：g a r l i c ；g r e e n i n g ；7 - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e ；a l l i i n a s e ；a m i n o a c i d 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 大蒜概述 大蒜为百合科葱属植物蒜( a l l i u ms a t i v u ml ) 的鳞茎，属多年生草 本植物，为香辛类蔬菜，又名葫蒜、葫、独蒜等。它原产于欧洲南部和 亚洲西部，最早在古埃及、古罗马和古希腊等地中海沿岸国家栽培；公 元前1 1 6 年，由张骞从西域引入中国陕西汉中地区，以后遍及全国；9 世纪初传入日本；1 6 世纪前叶扩展到非洲和南美洲，1 8 世纪后叶北美 洲开始栽培，现在已遍及全世界，我国各省均有栽培。 目前国内外对大蒜类型的划分方法很不统一，可以分为两个变种、 六个品种群，两个变种是双层蒜衣变种和单层蒜衣变种( 陈功等， 2 0 0 3 ) 。大蒜品种还可以分为三大生态型：低温反应敏感型、低温反应 中间型和低温反应迟钝型( 樊治成等，1 9 9 7 ) 。根据外皮颜色，大蒜可 以分为紫皮蒜和白皮蒜，是国内对大蒜地方品种经常采用的分类方法。 白皮蒜主要品种有2 3 种，苍山蒜、金乡白皮蒜、河北狗牙蒜等，外皮 呈白色，辛味浓，耐寒性强，一般在晚秋播种。紫皮蒜主要品种有2 6 种，北京紫皮蒜、黑龙江阿城大蒜、陕西蔡家玻大蒜等，外皮呈紫红 色，瓣肥大，瓣数少，辛味浓，品质佳，但耐寒性差，一般在早春播 种。我国大蒜品种资源十分丰富，南北各地均有名特品种，如苍山大 蒜、嘉定大蒜、蔡家坡大蒜、茶陵大蒜、川西大蒜、海城大蒜、毕节大 蒜、舒城大蒜、阿城大蒜、天津六瓣红、应县大蒜、荆州独蒜、拉萨白 皮大蒜、普宁大蒜、金山火蒜、来安大蒜、襄樊大蒜、吉木萨尔白皮 蒜、太仓白蒜、余姚白蒜、普陀大蒜、伊宁红皮蒜等( 陈功等，2 0 0 3 ； 严根元，1 9 8 9 ) 。 国内外的科学家们对大蒜的研究都给予高度的重视，从药理、临 床、应用等各个领域进行了比较深入系统的研究，获得了大量的研究成 果，证明了大蒜不仅是一种优良的保健食品，而且是一种具有广泛用途 的天然药品。近年来，随着人们保健意识的增强，日益强调食品原料及 添加剂的天然性、功能性，使得人们更加关注大蒜的药食兼用的特性。 2 0 0 2 年美国时代周刊专辑推荐大蒜为现代人十大最健康的食品之 一。我国是世界上大蒜的主要生产国和主要出口贸易国之一，大蒜产业 p 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 在我国有着举足轻重的地位。因此，研究开发利用大蒜资源具有重要意 义。 1 1 1 大蒜的化学成分 大蒜的化学成分较复杂，也较齐全，其中含有大量对人体有益的脂 肪、蛋白质、微量元素、氨基酸、维生素、硫化物等。不同产地的大蒜 都含有相同的化学成分，只是含量随产地、品种的不同有所差异。大蒜 中矿物质含量以磷最高，其次为镁、钙、铁、硅、铝和锌等，另外有机 锗和硒的含量也较高( 谢周芳，2 0 0 1 ) 。大蒜中氨基酸种类比较全，其 中精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸的含量较高，蛋氨酸的含量较低， 白皮蒜的必需氨基酸含量低于红皮蒜，但氨基酸总量略高于红皮蒜( 谢 周芳，2 0 0 1 ) 。除上述化学成分外，大蒜中还含有多糖、凝集素( d a m t k p ra 1 ，1 9 9 8 ；s m e e t sk e ta 1 ，1 9 9 7 a ) 和一些酶类( 如蒜氨酸酶、 过氧化物酶、丫谷氨酰转肽酶等) ( c e c il n e ta 1 ，1 9 9 2 ；程龙军等， 2 0 0 1 ) 。 1 1 2 大蒜的重要生理功能 从古至今，世界上许多民族如埃及人、犹太人、中国人、日本人、 罗马人就一直用大蒜治疗多种疾病。大蒜味辛性温，有驱风、利尿、镇 咳、暖脾健胃、促进食欲、帮助消化、消渴止血、行气消积、解毒杀虫 等功效，特别引人注目的是其强烈的抗菌性和强壮作用( a n k r is e t a 1 ，1 9 9 9 ；h a r r i sj c 甜甜，2 0 0 1 ) 。此外，还有促进胆汁分泌、镇 痉、肠内杀菌的作用，可辅助治疗肠胃病、扁桃体炎、哮喘、风湿等 症。我国明代本草纲目记载，大蒜有散痛肿、除风邪、消毒气、去 风湿、疗疮癣、健脾胃、止霍乱、解瘟疫等功效。 我国从5 0 年代开始对大蒜的化学成分、药理作用及临床进行研究， 并阐明了大蒜的多种有价值的药理作用。随着研究的深入，国内外学者 已研究证实了大蒜在抗凝血( 黄雅乐等，1 9 9 4 ) 、抗肿瘤( 高玉民等， 1 9 9 8 ) 、降血脂、降低血糖( 钱岳晟等，1 9 9 9 ) 、解毒、抗感染、抗氧 化、抗衰老( 张久亮等，2 0 0 2 ) 以及在保护肝脏、保护心血管系统、细 胞介导免疫、体液免疫调节( 叶海英等，2 0 0 3 ) 过程中起着十分重要的 作用。大蒜制剂对肺癌、胃癌、脑癌、肠癌、食道癌具有一定的治疗功 6 山东农业大学硕士学位论文 能，还有减慢心率、扩张毛细血管、降低血压等作用，并能降低血清胆 固醇、甘油三酯，从而防治动脉粥样硬化( t i l l ic m l j p fa 1 ，2 0 0 3 ： 李干红等，2 0 0 2 1 汪承亚等，2 0 0 0 ) 。另外，大蒜中的微量元素锗能把 氧元素供给机体，所以大蒜能消除疲劳，增强机体的体力和耐力。 1 1 3 大蒜的生理休眠期 大蒜是具有休眠特性的植物，有6 0 - - 8 0 天的休眠期( 刘淑娴等， 1 9 9 6 1 姜华武等，1 9 9 8 ；李曙轩，1 9 7 9 ) ( 不同产区、不同品种的休眠 期长短不同) ，其休眠期分三个阶段：( 1 ) 休眠前期。大蒜收获后 2 0 - 3 0 天，蒜瓣和蒜头外层叶鞘逐渐变薄，并干缩成具有保护作用的 膜质鳞片。( 2 ) 深休眠期( 也称生理休眠期) 。一般可持续3 0 , - - , 6 0 天，期间即使外部条件适宜生长，大蒜也不会发芽生长。( 3 ) 强制休 眠期。深休眠期过后，通过环境条件或其它措施控制，抑制其发芽生 长，使之继续处于休眠状态，大蒜仍不发芽。 深休眠期环境高温( 3 2 左右) ，有利于使大蒜长期滞留于休眠状 态，抑制鳞茎组织细胞内含物的解体、物质外运及呼吸消耗，但低温 ( 8 1 0 c ) 则会促使大蒜提前萌芽：而5 c 低温可迅速解除休眠( 姜 华武等，1 9 9 8 ；程智慧等，1 9 9 6 ；李晓东等，1 9 9 6 ；杨德琪等， 2 0 0 4 ) 。强制休眠期可利用：自然低温( 通风贮藏) 、人工制冷或气调 贮藏；生长调节剂马来酞脐处理；c 0 6 0 r 射线辐照等来强制其休眠，不 使其发芽生长( 周德庆等，1 9 9 6 ) 。 张伟成等( 张伟成等，1 9 8 8 ) 将大蒜于6 月下旬收获，7 月初分三 组分别贮存于高温( 3 2 , - - - , 3 4 ) ，室温及低温( 8 1 0 ) 条件下，观 察发现高温对幼芽的生长有突出的抑制效应，使它基本上处于潜伏状 态，这种抑制在脱离高温后可以解除。关于高温阻抑蒜瓣休眠进程的生 理效应，张伟成等分别于1 0 ，2 5 c ，3 5 下测其呼吸强度，发现高 温贮藏下，蒜瓣的呼吸强度反而比低温贮藏时低的多。这说明，休眠状 态是决定蒜瓣低呼吸代谢活性的关键因子。邵莉嵋等( 邵莉嵋等， 1 9 8 9 ) 对蒜瓣在温度调节下解除休眠的前后进行了细胞学观察。试验表 明：恒温3 0 贮存大蒜，可以延长休眠1 0 个月左右，短时期的放置在 4 。c 下就能解除休眠。蒜瓣外表皮细胞核的变化可以作为判断休眠解除 7 t - 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 与否的指标。解除休眠后，蒜瓣外表皮细胞核显示出酸性磷酸酯酶， a t p 酶与过氧化物酶的活性；而处于休眠状态的表皮细胞中，细胞核则 一直保持休眠期所特有的圆形，位于细胞中央，细胞内没有上述三种酶 的活性。如果蒜瓣在3 0 。c 条件下贮存一年以上，细胞也会发生局部解 体与细胞内含物的撤离，细胞内明显地分布着许多蛋白质颗粒，细胞间 有核穿壁现象。这表明即使在较高温度下，贮藏期也有一定界限。 1 2 国内外有关葱属植物组织变色研究进展 1 2 1 洋葱泥的红变 1 9 5 9 年，l u c k s 在研究洋葱泥的红变时，用乙醚提取到一种无色醚 溶性前体物( c o l o rd e v e l o p e r ) 在此物质的行程中，酶是必需的，他还 发现当纯氨基酸与含有醚溶性前体物的提取液混合时，红色素形成了， 他提出氨基酸参与了色素的形成( l u c k s ，1 9 5 9 ) 。后来，j o l s y n 和 p e t e r s o n 证实了l u c k s 关于醚溶性前体物形成时，酶是必需的，且此酶 是蒜氨酸酶，同时他们的研究还表明，羰基化合物在色素的形成也是必 需的( j o l s y n ，1 9 6 0 ) 。s h a n n o n 等人的研究表明，在洋葱泥红色素的 形成中，存在着第二种无色非醚溶性的色素前体物( p i g m e n t p r e c u r s o r ) ，其形成是通过加热c o l o rd e v e l o p e r 和氨基酸，然后此化合 物再与羰基化合物形成色素，而形成的颜色随羰基化合物而异，如甲醛 形成红色、不饱和酮形成蓝绿色、丙稀醛则形成蓝色素( s h a n n o n ， 1 9 6 7 ) 。 1 2 2 蒜泥的绿变 有关大蒜绿色素生成的研究，国外从四五十年代就已经开始了。 1 9 4 4 年，c r u s s 报道了在某些时候，将大蒜打成泥后，再加入乙酸，就 会变成绿色。j o l s y n 通过试验得出大蒜绿色素不是叶绿素，其形成与酚 酶和过氧化物酶无关( j o l s y n ，1 9 5 6 ) 。后来l u c k s 等研究表明，大蒜 在较高温度贮藏，可抑制蒜泥的绿变，而在低温下贮藏，则易变绿。在 不产生绿变的大蒜中，p e c s o ( 反式十 - 蹦1 一丙烯基h 卜半胱氨酸亚 砜) 的含量很低，在产生绿变的大蒜中，p e c s o 的含量很高；在较高 温度贮藏的大蒜中，p e c s o 的含量很低，而低温贮藏的大蒜中p e c s o 的含量增加。如将少量p e c s o 添加到不能绿变的蒜泥中，则会使蒜泥 8 山东农业大学硕士学位论文 变绿，添加量在o 1 1 8 m g 绿变程度与p e c s o 的添加量呈直线关系， 由此证实了p e c s o 的存在是蒜泥变绿的原因( l u c k s ，1 9 8 6 ) 。国内也 有研究证明，在蒜泥绿色素形成的过程中，氨基酸也是必须的，而不同 的氨基酸形成色素的程度不同，只有氨基和羰基游离的氨基酸才能形成 色素。同时，在蒜泥色素的形成中，羰基化合物参与了反应，而且所形 成的色素的颜色随着羰基化合物而异( 江英，2 0 0 2 ) 。 近年来，有关大蒜绿变机理的研究却很少，根据l u c k e s 的研究， 大蒜绿变的主要物质之一是s 一1 一丙烯基l _ 半胱氨酸亚砜，而结合对洋 葱红变的研究结果，推断大蒜绿色素的形成的过程可能为( 江英， 2 0 0 2 ) ： k ： ： 入刀诃 j ， 打破休眠 、l 反式( + 卜s _ ( 1 一丙烯基h h 生胱氨酸亚砜e c s o ) 很快土蒜酶( a i l i i l l a s c ) 色素中间体( c o l o rd e v e l o p e r ) 很慢j ，+ 游离氨基酸( f r e ea m i n oa c i d ) 色素前体物( p i g m e n tp r e c u r s o r ) 慢、l + 羰基化合物( c 酬) 伽【y 1 ) 色素( p i g m e n t ) 在此过程中，丫- 谷氨酰转肽酶起水解酶的作用。它可使蒜中的某种 卜谷氨肽水解，产生可使蒜泥绿变的前体物质即p e c s o ，此物质在不 产生绿变的大蒜中含量很低，在产生绿变的大蒜含量很高。 1 2 3 影响大蒜绿变的因素 近年来，对这种绿色物质的研究主要集中于研究解决实际生产中蒜 泥变绿的问题。有以下几个因素会对绿变色素的形成及其本身的性质产 生影响( j o s l y n ，m a ，e ta 1 ，1 9 5 5 ；b a e ，r n ，1 9 9 0 ；江英等，2 0 0 1 a , b ； 9 r - 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 江英等，2 0 0 2 a , b ；师玉忠等，1 9 9 9 ；徐为民等，2 0 0 3 ；l u k e s ，t m e t a 1 ，1 9 8 6 ；袁丽等，2 0 0 3 ；b a e ，r n ，e ta 1 ，1 9 9 0 ；k i m ，w j ，e ta 1 ， 1 9 9 9 ；李秀娟，2 0 0 0 ；杨明等，2 0 0 3 ：别小妹等，1 9 9 8 ) ： 1 2 3 1 p h 值 1 9 5 5 年，j o s l y n 和s a n o 研究发现，在p h 5 或以上形成的色素与在 p h 4 或以下形成的色素不同，后者更蓝些。推测或许是由于不同的色素 混合物组成发生了变化或p h 影响色素形成。1 9 9 8 年，别小妹等指出 p h 值越低，色泽变化越慢。2 0 0 3 年j 袁丽等在防止蒜泥绿变的研究中 得出p h 8 1 时可以有效地防止蒜泥绿变。1 9 9 9 年，史玉忠等在腊八蒜生 产过程中发现大蒜绿变速度与浸液中的醋酸的浓度呈正相关，即醋酸浓 度越高，变绿速度越快；同时得出，大蒜的浸泡绿变可能与酸的种类有 关，而与其的p h 值无关。 1 2 3 2 温度 1 9 8 6 年，l u k e s 等研究表明，大蒜在较高温度贮藏，可抑制其所制 成的蒜泥的绿变，而在低温下贮藏，则易绿变；别小妹、江英、袁丽等 指出蒜泥经过适度热处理可以有效防止其发生绿变现象( 8 0 8 5 2 4 m i n ) ；同时袁丽等观测到不同生长期的大蒜有不同的绿变效果，新蒜 制成的蒜泥没有绿变现象，只有通过一段较低温度的贮藏之后制成的蒜 泥才有绿变发生；江英等研究表明即将大蒜在较高温度( 3 0 3 5 ) 贮 藏段时间后，可防止蒜泥绿变；徐为民等则发现，大蒜贮藏温度在 2 2 以上就可以有效地防止蒜泥产品地绿变。史玉忠等在大蒜浸泡绿变 过程中发现，1 0 - 2 5 温度范围内大蒜绿变速度同浸泡温度呈正相关。 我国制作腊八蒜一般在冬季，因为将六月新收获的大蒜直接用于加工腊 八蒜，是不会变绿的；而大蒜经过低温贮藏过一段时间，就可以变绿。 民俗认为只有在农历腊八这天泡的蒜才可以变绿，这也是腊八蒜名称的 来历。 1 2 3 3 其它化学物质 1 9 7 6 年，k a z a r y a n ，r a 等研究发现一定浓度的环丝氨酸可以完全 抑制蒜酶，从而完全抑制绿变( 江英等，2 0 0 1 b ) 。1 9 9 0 年，b a e ，1 ln 和l e e ，s k 的研究发现用植物油处理可减轻蒜泥的绿变，蒜泥中的总 l o 山东农业大学硕士学位论文 丙酮酸含量可很好地指示绿变的程度。别小妹等发现高浓度的食盐对蒜 泥变绿变褐现象稍有抑制效果，但不明显：v e 对防止蒜泥褐变有一定 作用，但与变绿现象无关；浓度大于o 3 焦亚硫酸钠可以有效地抑制 蒜泥的绿变。1 9 9 9 年，k i m 和c h o 报道，抗坏血酸、半胱氨酸、偏亚 硫酸钠和磷酸三钠可以有效地抑制蒜泥绿变。1 9 9 9 年，史玉忠等指出 用盐酸与醋酸水溶液p h 值相对应的浸液，浸泡大蒜，没有绿变现象发 生。半胱氨酸的添加对抑制蒜泥绿变有很好的效果。2 0 0 2 年江英等利 用盐酸羟胺和环丝氨酸成功地抑制了蒜泥的绿变，其原因在于盐酸羟胺 和环丝氨酸对蒜酶有抑制作用。同年江英将7 谷氨酰转肽酶添加到不能 绿变的蒜泥中，可致使蒜泥变绿，从而确定了丫谷氨酰转肽酶对蒜泥绿 变的作用。 1 2 3 4 蒜泥破碎程度 1 9 5 6 年j o a l y n 和s a n o 等发现，在蒜泥中大块的蒜瓣，即使蒜泥变 绿之后，蒜瓣也不会变色。另t l d , 妹等同样也发现指出蒜色泽变化与其破 碎程度直接相关，破碎越细，色泽变化越快，越明显。 1 3y - 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 1 3 1 丫谷氨酰转肽酶与大蒜绿变的关系 在葱属植物休眠和打破休眠的过程中，丫- 谷氨酰转肽酶的活性变化 很明显。根据对不同休眠期的大蒜中丫- 谷氨酰转肽酶活性的测定，发现 7 谷氨酰转肽酶的活性差异很大，在已打破休眠的大蒜中此酶的活性很 高，而处于休眠期的大蒜中此酶的活性很低。同时，处于休眠期的大蒜 蒜泥不绿变，而已经打破休眠的大蒜蒜泥绿变。 “ 低温储藏新收获的大蒜，可使蒜泥变绿，在5 c 下储藏新鲜蒜，随 着储藏时间的延长，新蒜中的7 谷氨酰转肽酶的活性增加，同时所制得 的蒜泥绿变加深，7 谷氨酰转肽酶的活性与蒜泥绿变变化一致。另一方 面，高温储藏大蒜，会抑制蒜泥的绿变。当储藏温度为3 5 时，随着 储藏时间的延长，蒜中y 谷氨酰转肽酶的活性降低，同时所制得的蒜泥 绿变减轻，丫。谷氨酰转肽酶的活性与蒜泥绿变的变化一致( 江英等， 2 0 0 2 a ) 。因此推测丫谷氨酰转肽酶与蒜泥绿变有着密切的关系。 1 3 2 蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 r - 谷氨酰转肽酶、蒜氮酸酶与大蒜绿变的关系 不同的葱属植物中的蒜氨酸酶含量差别较大，其中洋葱和大蒜中蒜 氨酸酶含量较大，分别占水溶性蛋白的6 、1 2 左右。此酶的催化作 用要依赖于磷酸吡哆醛，有较宽的p h 范围，适宜的p h 范围为5 - - - 8 ， 最适反应温度为3 7 ( 孙君社，1 9 9 5 ) ，对底物有特异性要求，底物 为s l 一半胱氨酸衍生物。 蒜氨酸酶存在于大多数葱属植物中，但不同葱属植物中的蒜酶其理 化性质略有不同，而大蒜中蒜氨酸酶的抑制剂有：羟胺、氨基氧乙酸、 氨基氧丙酸、环丝氨酸、半胱氨酸及大多数非氧化形式的衍生物。在蒜 泥中加入一定量的盐酸羟胺可抑制蒜泥的绿变。但盐酸羟胺对蒜氨酸酶 的抑制作用是可逆的，在已用盐酸羟胺抑制绿变的蒜泥中再加入蒜氨酸 酶，蒜泥又变绿了，这说明在蒜泥绿色素的形成过程中，蒜氨酸酶参与 了反应( 江英等，2 0 0 1 ) 。 1 4y 谷氨酰转肽酶研究现状 1 4 1 丫谷氨酰转肽酶的酶源 p 谷氨酰转肽酶广泛的分布于真核生物及原核生物体内，在不同生 物体中，其分布有一定的特异性( h i d e h i k ok u m a g a i ，e ta 1 ，1 9 8 9 ) ，在 真核生物中，主要是以膜结合酶的形态存在，存在于肾、胰、肝、脾和 小肠等组织的微绒毛上( s u r e s hs t a r e ，1 9 8 1 ) 。在哺乳动物组织中， 丫一谷氨酰转肽酶是一种质膜结合的糖蛋白，是谷氨酰循环中的关键酶， 常见于具有分泌和吸收功能的上皮细胞膜上。植物中的y 谷氨酰转肽酶 在催化特性方面与哺乳动物中的丫谷氨酰转肽酶相似。在原核生物中， 酶主要存在于浆液中或是分泌到细胞外，为游离酶。对于不同茵属，酶 的分布是不同的，如在大肠杆菌中，酶主要存在壁膜空隙中，而在枯草 杆菌中，大部分酶能直接分泌到胞外( r e i k on a k a y a m a ，1 9 8 4 ) 。 1 4 2y 谷氨酰转肽酶的酶学性质 y 谷氨酰转肽酶是一种特异性酶，在生物体内能够催化转移l 吖- 谷 氨酰基，形成y 谷氨酰循环。 y 谷氨酰转肽酶可以将谷氨酰化合物上的丫- 谷氨酰基转移到其他氨 基酸的氨基上从而形成y 位肽键，生成新的肽。基于酶的这种性质，日 1 2 山东农业大学硕士学位论文 本一些专家学者将其广泛应用于含有谷氨酰基的小肽或多肽合成的研究 上( n a i m ac h i k h i ，e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 y 谷氨酰转肽酶由一个大亚基( 4 0 k d ) 和一个小亚基( 约2 0 k d ) 构成，酶的催化位点位于小亚基上( p a u ld c o m w e l l ，2 0 0 1 ) 。 在酶的活性中心，有三个亚位点，分别与l 吖谷氨酰基、d y 谷氨 酰基，以及l 吖( a 甲基) 谷氨酰化合物相结合；受体的位点由半胱氨酰 亚位点和甘氨酸亚位点组成，其中半胱氨酸亚位点易与中性氨基酸， 如：l 半胱氨酸、l 吖蛋氨酸、l 丫丙氨酸等结合；而甘氨酸亚位点主 要与甘氨酸相结合，因此，只有l 构型的氨基酸或二肽才适宜作为酶转 肽反应的受体( h i d e y u k is u z u k i ，1 9 8 9 ；m o s h ey g o o r e l 9 6 7 ) 。 1 ，谷氨酰转肽酶可以催化以下三类反应： ( 1 ) 转肽反应( 谷氨酰残基从供体转移到受体) ； 1 ，g l u x + a h _ ) - g i u - a + x i - i ( x ，a ：氨基酸或肽) ( 2 ) 自转肽反应( 丫谷氨酰残基从一个供体分子转移到另一个供 体分子) ； ( 3 ) 7 - 谷氨酰基的水解反应( 7 j - y 寸受体，丫谷氨酰基从供体分子转 移到水分子，形成谷氨酸盐) 。 y - g i u - x h 2 0 g i u + x h 在不同的p h 值下，其酶活的稳定性也有变化，总的说来，比较耐 碱，一般的情况下，它的转肽反应的最适p h 值为8 0 - - 9 0 ，而它的最 适水解p h 值为6 o 8 o 。同时二价离子也对它的活性有影响作用，如 钙离子和镁离子对7 g t p 的活力有促进作用。 丫谷氨酰转肽酶对作为丫谷氨酰基供体的丫- 谷氨酰氨基酸或肽表现 出了高度的专一性( k e n j it o m i t a ，1 9 8 8 ；t a t s u ow a t a n a b e ，1 9 9 5 ； h i d e y u k is u z u k i ，19 9 3 ；j a s w a n ts i n g h ，19 8 6 ；h i d e h i k ok u m a g a i ， 1 9 9 3 ) ，而且对各种受体氨基酸和肽也表现出了较高的专一性。 1 4 3 丫谷氨酰转肽酶的功能 y 谷氨酰转肽酶能够催化转移谷胱甘肽或者其他谷氨酰基化合物上 的谷氨酰基到受体( 氨基酸，二肽，谷胱甘肽等) ，同时它还催化谷胱 甘肽和其他谷氨酰基化合物的水解反应产生谷氨酸盐。 r 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 在生物体内，y 谷氨酰转肽酶可以通过催化转肽生成谷氨酰氨基 酸，这些氨基酸将通过谷氨酰循环转运到细胞中。该酶还可以催化谷胱 甘肽生成谷胱甘肽二硫化合物，这种二硫化合物还可以进一步代谢形成 胱氨酸。这一转变在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用 ( m d e y u l 【is u z u k i ，19 8 7 ；w a t a r uh a s h i m o t o ，19 9 5 ：h i d e y u k is u z u k i ， 1 9 8 6 ：a b r a h a mm k a r k o w s ，1 9 7 6 ；s u s a nj s u l a k h e ，1 9 8 6 ) 。 1 5 本课题研究的目的、内容和意义 1 5 1 研究目的 ( 1 ) 通过研究不同贮藏温度下蒜氨酸酶和丫谷氨酰转肽酶的活性 及大蒜绿变能力的变化，确定其与大蒜绿变的关系。 ( 2 ) 通过比较多种丫谷氨酰转肽酶的粗分及纯化的方法，确定一 个合理的分离纯化方案。 ( 3 ) 研究y 谷氨酰转肽酶的酶学性质，以期为大蒜绿变提供理论 据。 ( 4 ) 通过试验验证丫谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶、羰基化合物、氨 基酸与大蒜绿变的关系。 ， 1 5 2 研究内容 ( 1 ) 不同贮藏温度下蒜氨酸酶和丫谷氨酰转肽酶的活性变化及对 大蒜绿变能力的影响。 ( 2 ) 选用分离纯化蛋白质的多种方法，并研究各种方法的分离纯 化条件，综合比较各种方法的效果，选择确定分离纯化大蒜y 谷氨酰转 肽酶的具体步骤。 ( 3 ) 对分离纯化的丫谷氨酰转肽酶的纯度进行鉴定及丫谷氨酰转 肽酶的动力学特性及其酶学性质进行研究。 ( 4 ) 验证y 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶、羰基化合物、氨基酸与大 蒜绿变的关系。 1 5 3 课题的意义 我国是大蒜的主要生产国，其产量占世界总产量的四分之三。除鲜 食外，大蒜还加工成蒜泥、蒜汁、脱水蒜片、蒜粉等制品，但在加工过 程中常出现绿变现象，严重的影响了产品的外观质量，成为妨碍大蒜进 1 4 山东农业大学硕士学位论文 一步加工的主要问题。因此研究大蒜制品绿变的机理，对有效控制发绿 现象，达到规模化生产具有重要意义。 t - 谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶与大蒜绿变的关系 2 材料与方法 2 1 实验原料 原料：鲜蒜鳞茎( 泰安种植) 购于山东农业大学农贸市场( 购后一部分冷藏于4 c 冰箱中，一部 分放于室温下) 2 2 主要试剂 试剂名称生产单位纯级 磷酸吡哆醛s i g m a 公司生化试剂 p e g 8 0 0 0 a m l e s c o 公司生化试剂 l 吖- g p n as i g m a 公司生化试剂 裟s 印ep h a r m a c i a 公司 生化试剂 c o n a s e p h a r o s ep h a r m a c i a 公司生化试剂 凳瓣嚣上海升正生物技椭限公司 生化试剂 暑羞吨。d 比喃葡s i g m a 公司 生化试剂 6 氨基己酸s i g m a 公司生化试剂 l 天冬氨酸s i g m a 公司生化试剂 l 甲硫氨酸 上海伯奥生物科技有限公司生化试剂 l 半胱氨酸上海伯奥生物科技有限公司生化试剂 l 赖氨酸上海伯奥生物科技有限公司生化试剂 l 精氨酸上海伯奥生物科技有限公司生化试剂 d l - 洳丙氨酸济宁市化工研究所生化试剂 l 酪氨酸上海蓝季科技发展有限公司生化试剂 l 脯氨酸国药集团化学试剂有限公司生化试剂 l 苯丙氨酸国药集团化学试剂有限公司生化试剂 l 异亮氨酸北京夏斯生物技术有限公司生化试剂 l 亮氨酸北京夏斯生物技术有限公司生化试剂