（环境科学专业论文）微囊藻毒素mclr纯品的制备工艺研究.pdf

f a b r i c a t i o np r o c e s sr e s e a r c ho fm c - - l r b y c h e n y o n g f a n g u n d e rt h es u p e r v i s i o no f p r o f w a n gl i g u oa n dp r o f l i us i q u a n at h e s i ss u b m i t t e dt ot h eu n i v e r s i t yo fj i n a n i np a r t i a lf u l f i l l m e n to f t h er e q u i r e m e n t s f o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro fe n g i n e e r i n g u n i v e r s i t yo f j i n a n j i n a n ，s h a n d o n g ，p r c h i n a m a y ，2 0 1 1 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：妊盘蒸 e l期：吵上韧 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 函公开口保密(年，解密后应遵守此规定) 论文作者签名：j 毡业萼一导师签名：通日期： 堡丛皇圣! 济南大学硕 ：学位论文 目录 摘要v 自l 】b s t r a c t v i i 第一章绪论1 1 1 微囊藻毒素特性及毒性机理。l 1 1 1 蓝藻水化及其危害1 1 1 2 微囊藻毒素的结构及性质3 1 1 3 微囊藻毒素的毒性机理5 1 2 微囊藻毒素的提纯与表征6 1 2 1 微囊藻毒素的提纯6 1 2 2 浓缩与预纯化9 1 2 3 分离与纯化1 0 1 2 4 微囊藻毒素的表征。1 3 1 3 微囊藻毒素的检测方法以及迁移去除1 4 1 3 1 微囊藻毒素的检测方法一1 4 1 3 2 微囊藻毒素的迁移与去除1 6 1 4 本研究的目的及意义1 9 第二章蓝藻中微囊藻毒素粗品提取条件优化2 1 2 1 铜绿微囊藻的培养2 1 2 1 1 铜绿微囊藻培养基2 1 2 1 2 铜绿微囊藻培养方法2 1 2 2 材料与方法2 2 2 2 1 仪器与试剂2 2 2 2 2 实验方法一2 3 2 3 结果与分析2 4 2 3 1 甲醇水溶液浓度的影响2 4 2 3 2 不同提取体系的影响一2 5 2 3 3 萃取时间的影响一2 6 2 3 4 辅助条件的影响2 8 微囊藻毒素m c - l r 纯品的制备丁艺研究 2 3 5 提取剂体积与藻细胞质量比的影响一2 9 2 3 6p h 的影响3 1 2 4 小结一3 2 第三章微囊藻毒素初步纯化与富集条件优化3 3 3 1 材料与方法3 3 3 1 1 仪器与试剂3 3 3 1 2 实验方法3 3 3 2 结果与分析3 3 3 2 1 淋洗液的选择3 3 3 2 2 洗脱液的优化3 6 3 3 小结。3 8 第四章微囊藻毒素的分离纯化条件优化及表征3 9 4 1 材料与方法3 9 4 1 1 仪器与试剂3 9 4 1 2 实验方法3 9 4 2 结果与分析一4 0 4 2 1 甲醇水溶液体系4 0 4 2 2 乙腈水溶液体系4 6 4 2 3 高效液相色谱质谱表征：5 0 4 3 小结5 1 第五章m c l r 纯品制备的条件优化5 3 5 1 材料与方法5 3 5 。1 1 仪器与试剂5 3 5 1 2 实验方法5 3 5 2 结果与分析5 4 5 2 1 制备色谱条件5 4 5 2 2 分析色谱探讨5 8 5 3 小结6 0 第六章结论与展望6 1 济南大学硕上学位论文 6 1 主要结论6 1 6 2 展望一6 2 参考文献6 3 致谢6 9 附录7 1 一、在校期间发表的学术论文7 1 二、在校期间参加的项目7 1 三、在校期间获奖情况7 2 i i i 微囊藻毒素m c i ，r 纯品的制备工艺研究 i v 济南大学硕士学位论文 摘要 近几十年来，蓝藻水华引起的淡水湖泊污染逐渐加剧。最近几年我国云南滇 池、江苏太湖等地蓝藻水华的爆发程度逐年加剧，其释放的主要有害物质为微囊 藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) 。微囊藻毒素l r 作为m c s 的主要异构体，其标样 是饮用水水质非常规指标检测所需要的主要标准样品之一。目前，微囊藻毒素异 构体纯品的提取、纯化与制备等方面的研究国内外文献报道很多，涉及固相萃取、 高效液相色谱、薄层层析等。但我国对于从蓝藻中提取与制备m c - l r 的研究尚 未形成成熟的方法，所需要的标准品几乎全部从国外进口。 本研究以从云南滇池得到的天然蓝藻为原料，通过对蓝藻提取藻毒素的提取 条件、藻毒素异构体混合物分离条件、微囊藻毒素l r 制备条件等三个方面开展 深入研究，得到了能够满足水质监测要求的m c l r 标准品。并对得到的样品通 过h p l c m s 进行了表征。 对从天然蓝藻中提取微囊藻毒素异构体的条件进行了探索与优化。研究了不 同溶剂体系，提取手段及提取时间等因素对藻渣中微囊藻毒素提取效果的影响， 得到了微囊藻毒素粗提的最佳条件：以甲醇水( 6 5 v v ) 作为提取溶剂在室温 条件下，磁力搅拌1 5 h ，超声2 0 m i n 萃取得到粗提液，然后用0 4 5 1 a m 的微滤膜 过滤去除大分子物质以及纤维等杂质，得到m c s 的粗品。m c s 粗品通过固相萃 取手段进行前期纯化，探索了固相萃取过程中淋洗液与洗脱液的配比对纯化效果 的影响，7 0 洗脱液可以将微囊藻毒素最大限度地从固相萃取柱上洗脱下来。 使用高效液相色谱( h p l c ) 手段对所提取的微囊藻毒素的异构体粗品进行 纯化分离，考察了不同比例、不同种类的流动相等色谱条件对m c s 异构体分离 效果的影响，得到了微囊藻毒素异构体的最佳色谱分离条件：流动相：乙腈水 溶液( 8 0 v v ) ；柱温：室温；检测波长：2 3 8 衄；流速：0 5m l m i n ；进样量： 2 1 x l 。微囊藻毒素的三种主要异构体在此条件下可以得到良好的分离。 利用制备型高效液相色谱对微囊藻毒素主要异构体进行制备分离，通过探讨 不同比例的流动相及进样量对制备效果的影响，得到最佳制备色谱条件：流动相： 乙腈水溶液( 5 0 v v ) ；柱温：室温；检测波长：2 3 8n l t l ；流速：2m l m i n ： 进样量：1 0 0 p l 。收集l o 组色谱峰对应的组分，各组分在高效液相色谱上进行 v 微震漂霉素m c l r 纯品的制备工艺研究 色谱和光谱分析( d p d ) ，微囊藻毒素的主要三种异构体m c l r 、m c r r 以及 m c y r 可以基本定性，其中m c l r 的纯度超过9 0 。以h p l c m s 对制备得到 的m c l r 进行了表征，分子离子峰和相关的特征峰与m c l r 相符。 本研究最后通过从中科院武汉水生所得到的铜绿微囊藻菌种，实验室自行培 养了铜绿微囊藻，以相同提取制备方法得到m c l r 标准品，制备及表征结果与 以天然蓝藻为原料的结果一致。 以天然蓝藻为起始原料制备微囊藻毒素l r 方法简便，易于操作，产品单批 次制备量较大，纯度较高，对研究微囊藻毒素其他异构体的提取和制备具有很好 的指导意义。 关键词：微囊藻毒素一l r , 制备；高效液相色谱，高效液相色谱质谱；表征 v l 济南人学硕士学位论文 a bs t r a c t b l u e g r e e na l g a lb l o o ma g g r a v a t e di nr e c e n ty e a r sc a u s i n gb yt h ep o l l u t i o no f 微囊藻毒素m c l r 纯品的制备t 艺研究 f i n a l l y , m c l rw a sp r e p a r e dw i t ha l g a ea e r u g i n o s ac u l t u r e di n0 1 1 1 l a b o r a t o r y t h er e s u l t sw e r et h es r n l ea st h ep r e p a r a t i o nm c - l rf r o mn a t u r ea l g a e t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so fm c sw e r es i m p l ea n de a s yt oo p e r a t ei no u rr e s e a r c h t h es t u d i e sh a v eag o o dg u i d a n c et ot h ep r e p a r a t i o no fo t h e rm c si s o m e r s k e yw o r d s ：m c l r ；p r e p a r a t i o n ；h p l c ；h p l c - m s ；c h a r a c t e r i z a t i o n v 1 1 1 济南大学硕 ：学位论文 第一章绪论 1 1 微囊藻毒素特性及毒性机理 1 1 1 蓝藻水化及其危害 水环境与人类生活有着密切的联系，人们对藻类水华现象很早就有了一定的 认识。蓝藻，又称蓝绿藻，是由于其光合作用而形成的颜色得名，是广泛出现在 世界各地的主要藻种之一。在淡水中生长的蓝藻在水体表面聚集形成水华，或集 中在表面形成蓝绿色的浮藻群。蓝藻水华是水体中的蓝藻大量增殖而形成肉眼可 见的蓝藻群体或导致水体颜色发生变化的现象，严重时会在水体表面漂浮积聚形 成一层绿色的藻席，甚至是藻浆。蓝藻水华发生的主要原因是氮、磷等无机营养 物质大量进入相对较封闭、水流较缓慢的水体，引起藻类以及其它水生植物大量 繁殖，水体溶解氧下降，水质恶化，大量水生生物死亡的现象，即水体富营养化。 水体富营养化可分为两种：天然富营养化及人工富营养化。近年来，蓝藻水华在 养殖水体中呈现出高发、频发、暴发态势。最早观察到的水华现象是在英国威尔 士附近的淡水湖中，后来，在北爱尔兰、北美等地又陆续有类似的报道【l j 。近十 余年来，随着水体环境污染的逐步加重，世界上淡水湖泊水华现象发生频率呈增 长趋势，我国许多水体的富营养化程度也在逐渐加剧。我国淡水湖泊如云南滇池、 江苏太湖、巢湖等相继由于藻类特别是蓝藻的大量繁殖发生了不同程度的高浓度 水华现象【引。 蓝藻爆发主要就是因为水体的富营养化。水体中过量的养分主要来自于以下 几个方面：生活污水，包括人类含磷洗衣粉清洁剂等以及各种生产生活废水：并 且畜禽养殖的粪便含有大量营养废物，如氮、磷等，这些元素都能引起水体的富 营养化；农田化肥流失，化肥是很多富营养化区域的主要养分来源，例如，波罗 的海和太湖中有超过5 0 的氮来自化肥的流失；工业废水废渣废物污染，包括各 种化肥厂和废水排放；燃烧矿物燃料，例如，波罗的海中约3 0 的氮，密西西比 河中约1 3 的氮均来源于此p j 。 微囊藻毒素m c l r 纯品的制备t 艺研冗 蓝藻水华对水体产生了极为严重的破坏，常见的危害主要有：( 1 ) 消耗水体 中的溶解氧，一方面可以抑制浮游生物产生的氧气，另一方面同时也阻碍了空气 中的氧气进入水体中；从而导致了水体中溶解氧的不足，其它生物由于无法进行 正常的呼吸作用而死亡；( 2 ) 降低生物的多样性，蓝藻的过度增殖使水体中通风 和光照等条件持续的恶化，从而抑制了水体中有益浮游生物的生长繁殖、导致了 其它藻类不能合成本身所需要的营养物，让光合作用停滞，最后死亡；( 3 ) 严重 污染水体，蓝藻水华过程中会产生大量蓝藻毒素以及硫化氢等有毒有害物质，危 害水体中的生物生长；另外死亡的蓝藻还释放出大量有机质，散发腥臭味，刺激 了一些有害细菌的滋生，污染了水体环境，间接通过食物链而影响人类的身心健 康。 蓝藻在水华时能产生大量的毒素，这些毒素溶解在水中，不仅会影响水体中 的各种生物的正常生长和代谢，而且也间接影响了人类的健康和发展，由于大量 生产和生活废弃物未经过处理而排入各种水体，加之公共卫生设施也跟不上发展 的需要，导致农村大量人口饮用不安全卫生水。当前，微生物污染仍然是农村饮 用水污染的主要类型。这些毒素对人类和水体生物产生了严重的危害，它能导致 各种鱼类、鸟类以及野生生物等中毒死亡，更为严重的是，它能够间接的通过食 物链来危害人类的身体健康，如人类饮用了含有大量藻毒素的水时，会出现呕吐、 腹泻、厌食、乏力等症状；人类少量喝入可引起急性肠胃炎长期饮用则可能引发 肝癌。1 9 7 5 年美国宾夕法尼亚的s e w i c k l e y 爆发了一起8 0 0 0 多人感染的急性肠 胃炎事件 4 1 ，1 9 8 3 年澳大利亚的m a l p a s 水库发生蓝藻水华现象，导致以该水库 为饮用水的周围居民出现了血清谷氨酰胺转移酶、丙氨酸转移酶及碱性磷酸酶明 显升耐5 1 。流行病学调查表明，我国江苏海门、启东和广西扶绥地区的当地居民 由于长期饮用含有微囊藻毒素的浅塘水和河流水，从而导致原发肝癌发病率相对 较高1 6 , 7 1 。另外，由于毒素常可在浮游动物和鱼类体内存留和富集，因此，也间 接地通过生态系统和食物链给人类带来了潜在的威胁。我国“三湖”( 滇池、太 湖、巢湖) 氮、磷污染严重，富营养化问题突出，藻类丛生，湖水浑浊，透明度 下降，水质存在严重问题，形势十分严峻。 2 济南大学硕士学位论文 世界各地由蓝藻引发的水环境污染问题，及藻毒素引起的各种动植物甚至人 类中毒事件的日益增加，对人类社会、经济和水体环境造成了不良影响。蓝藻水 华及其产生的毒素已成为当今社会重要的环境问题之一。 1 1 2 微囊藻毒素的结构及性质 微囊藻是微囊藻属的简称，是蓝藻门的一个重要的属，常见有铜绿微囊藻 ( m a e m g m o s a ) ，水华微囊藻( m f l o s - a q u a e ) ，具缘微囊藻( m m a r g i n - m ) ，不 定微囊藻( m i n c e r t a ) ，绿色微囊藻( m v i r i d s ) 以及新发现的在太湖采集到的蓝 藻水华的种类一惠氏微囊藻( m w e s e n b e r g i i ) 等。在已经发现的各种不同藻毒素 种类中，微囊藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，m c s ) 是在蓝藻水华中出现频率最高、产 生量最大、造成危害最严重的藻毒素【8 】。自然界水体中产生微囊藻毒素的蓝藻主 要包括微囊藻属、项圈藻属、鱼腥藻属、颤藻属、念珠藻属等，而也有人从软管 藻中分离得到微囊藻毒素 9 1 。微囊藻毒素能够抑制蛋白磷酸酶的活性，是强烈的 肝脏肿瘤促进剂，由于微囊藻毒素的环状结构和间隔共轭双键结构，而具有相当 的稳定性，微囊藻毒素通常大部分存在于蓝藻细胞中，当细胞破裂或衰老时毒素 释放进入水中。其结构为一组环七肽复合物，分子量在1 0 0 0 左右【l o l 。一般认为其 结构是由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽【1 1 j ( d 丙氨酸一l x d 赤甲基天 冬氨酸l z a d d a - d 异谷氨酸_ n 甲基脱氢丙氨酸) 。其中，m e a s p 为d 2 d 甲基 天冬氨酸，a d d a 为( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) - 3 氨基9 一甲氧基2 ，6 ，8 一三甲基1 0 苯基 - 4 ，6 二稀酸，m d h a 为n 甲基脱氢丙氨酸，d h a 为脱氢丙氨酸，x 、z 为两种可变 的l 一氨基酸【1 2 】。在整个环状结构中2 、4 位置上的两个l 氨基酸是不同的，例如， 如果在这些位置是亮氨酸和精氨酸，则为m c l r 。由于在这两个位置氨基酸的 不同，以及还有其它一些基团的细微变化，造成微囊藻毒素的种类较多，目前发 现有大约8 0 种异构体【2 】。其中，m c l r 、m c r r 及m c y r 是我国富营养化水体 中最主要的3 种藻毒素，也是目前世界范围内研究最为广泛的几种藻毒素，其中l 、 r 、y 分别代表l e u 、a r g ；f i j t y r l l 3 , 1 4 1 。m c s 的分子结构见图1 1 。 微囊藻毒素m c l r 纯品的制备工艺研究 o 图1 1m c s 的分子结构组成 f i g 1 1t h em c sc o m p o s e do ft h em o l e c u l a r s t r u c t u r e o 上图中当r l 、r 2 为不同的氨基酸时，对应为m c s 的异构体。目前研究比较 广泛的五种m c s 异构体组成及其分子量见表1 1 【1 5 1 。 表1 1 常见五种m c s 异构体的组成及其分子量 t a b l e1 1s e v e r a lm i c r o c y s t i n si s o m e r ss t r u c t u r ea n dm o l e c u l a rw e i g h t 藻毒素具有水溶性和耐热性。易溶于水，甲醇( 或丙酮) ，不易挥发， 抗p h 变化，不易沉淀或被吸附在沉淀物以及悬浮物中。其在水中的溶解度 在l g l 左右，化学性质相当稳定。一般情况下，在15 。3 0 温度的富营养化 水体中微囊藻毒素可以长时间存在，而在去离子水中微囊藻毒素也可以保 持一个月左右的稳定性【l 们。藻毒素的耐热性还表现在，当其处于3 0 0 水体 中，仍能够保持分子结构不被分解破坏。即使是在加氯过滤、混凝沉淀等 净水工艺中，以及有真核生物和细菌等存在时，结构也不会轻易被破坏变 4 济南大学硕f ：学位论文 性；而蛋白质水解作用也很难对藻毒素的多肽环状结构发挥任何作用【1 7 】， 但是当有色素存在，m c s 却能够被很快降解，降低其活性1 1 8 】。当藻毒素经 过一系列反应之后，得到的m c s 异构体组分也依然保持其固有的稳定性， 但是当微囊藻毒素直接暴露在紫外线或者被紫外灯直接照射时，可发生化 学反应使其毒性立刻丧失。藻毒素的紫外吸收峰一般在2 3 8 n m 左右，各异 构体相差不大，当紫外线波长接近此数值时，通过异构使得m c s 被降解【19 1 。 相对分子质量均1 0 0 0 左右。由于m c s 分子结构中含有羧基、氨基和酰胺基， 所以在不同的p h 值下，m c s 的离子化倾向不同。m c s 是细胞内毒素，在细胞内 合成，因此，若想得到m c s 必须设法使细胞壁破裂。 1 1 3 微囊藻毒素的毒性机理 水中微囊藻毒素强烈的毒害作用已引起了全世界的广泛关注。世界卫生 组织( w h o ) 及国内卫生部门制定的饮用水水质标准中，m c l r ( m c s 的代表 亚型) 的标准值定为1 “g l 【2 0 1 。中国新饮用水标准中同样规定微囊藻毒素的限值 为1 肛g l 洲。 目前，由于暴露途径增多，实验室内对微囊藻毒素的毒性效应以及其致毒机 理的研究都可通过利用各种实验动物或植物而获得。早期就有报道m c s 具有高 毒性，当机体致毒时，毒素会从血液中转移到肝脏，使肝脏充血肿大，严重时可 导致肝细胞破裂出血甚至坏死，主要作用的靶器官是肝脏。其致毒机理是m c s 可抑制蛋白磷酸酶中的丝氨酸苏氨酸亚基的活性，使哺乳动物肝细胞由于角蛋 白的高度磷酸化而微丝分解、破裂和出血，导致肝细胞充血肿大，动物失血休克 甚至死亡【2 2 1 。微囊藻毒素的肝毒性一般通过两种作用表现：毒素可激活肝细 胞内的核酸内切酶，使得d n a 链无规则断裂，破坏了d n a 的结构；藻毒素 可导致脂质的过氧化作用，引起体内的氧化作用损伤【2 3 ，2 4 1 。通过对小鼠染毒致死 亡的解剖发现，肝脏有明显的形态结构和酶学的改变。 m c s 还能够对肾脏产生作用，使其肾小球内的红细胞大量减少，但肾小球 外部的红细胞反而增多，扩大管腔，以及导致肾小球滤过率增加等1 2 引。m c s 也 可导致脾脏的肿大，一些m c s 异构体可能具有神经毒性，对细胞具有免疫抑制 和刺激等作用。m c s 还能改变动物血液动力学，引起血管扩张、心脏输出量、 微衰藻毒素m c l r 纯品的制备_ t 艺研究 心率以及血压等的下降的现象。此外，经过m c s 的毒性还能够作用在细胞骨架 上，当机体致毒时，会导致细胞内的整个形态发生变化，如内质网折叠，内部线 粒体膨胀等现象；同时，毒素进入体内过多，会导致细胞代谢紊乱，释放出通常 情况下不会存在细胞内的炎性物质和细胞因子等，直接引起机体损伤【2 6 1 。 m c s 的中毒后的表现情况各有差异，不同种类的动物、体内积攒的毒素剂 量等都会对其产生不同的生理反应。例如，鸟类中毒后，主要表现为不安、通便、 眼球闪烁、阵发性痉挛等，可以很好的观察到中毒后的特征；而牛和羊等中毒后 则主要是内在表现，如呼吸加快、发热、心动过速等症状。在实验室的研究中， 小动物中毒症状则主要表现为厌食、颤抖、呕吐、腹泻、虚弱等【2 7 1 。对于水体中 的生物而言，低级和高级生物所表现的也不尽相同，例如，处于生物链最底层的 蚤类会直接死亡，而稍微高级的鱼类则会表现出行为异常，生长迟缓，最后死亡。 目前，很多饮用水体中会加入氯消毒，此时当微囊藻毒素进入水体，则与其产生 协同作用，使人体致癌。 1 2 微囊藻毒素的提纯与表征 1 2 1 微囊藻毒素的提纯 长期以来，国内外学者对生物样品分离、提纯给予了很大的关注，并进行了 大量相关技术的研究，尤其在色谱分离技术方面出现以后，生物制品的纯度得到 了很大提高。而m c l r 纯品是生活饮用水卫生标准( g b 5 7 4 9 2 0 0 6 ) 中非常 规6 4 项水质指标检测需要量较大的一种标准样品，目前只能从国外( 欧、美、 日等国) 进口，但是在订购过程中受到诸多因素的限制，难以保证饮用水的水质 检测以及相关研究的顺利进行。随着国家新的饮用水水质标准的出台，人们对水 质要求也相应提高，m c l r 纯品制备问题已经日益受到国内外研究人员的关注， 尤其是发展中国家的重视。国内外专家、学者在m c l r 纯品纯化方面做了大量 工作。 目前，微囊藻毒素纯品的获得，主要通过以下步骤实现：以从自然界中获得 的蓝藻为原料，经过一系列传统工艺的提取和分离过程，再运用现代技术对其纯 化。但是由于不同研究者的关注点不一样，工作环境不同，m c s 提取、分离与 纯化的步骤和方法相对也有出入，因此目前研究领域内还没有形成概括出种公 6 济南大学硕t 学位论文 认的且相对成熟的方法。 ( 1 ) 提取物质的选择 天然蓝藻和实验室自行购买菌种，自行培养铜绿微囊藻是目前提取微囊藻毒 素主要两种原料来源。天然湖泊中可以提供大量原材料，特别是当蓝藻水华爆发， 水面形成浮藻团时，即可获得大量藻类供于实验。但最大的缺点是从天然蓝藻中 所提取的毒素成分比实验培养得到的成分更复杂，杂质较多，需分析的种类较多， 且重复性较差【2 引。对比而言，实验室培养的藻类由于其单一性的特点，重现性较 好，整个提取与纯化过程简单且易操作，所用实验时间也相对较少，但是当实验 室大规模提取纯化微囊藻毒素时，培养的铜绿微囊藻就无法即使的供给实验所 需，可能导致实验的停滞，让操作者处于被动 2 9 1 。 ( 2 ) 萃取溶剂的选择 由于微囊藻毒素各异构体的性质不同，导致不同的溶剂，不同溶剂的比例， 对于微囊藻毒素的提取都会产生很大的影响，研究者必须根据自身条件，周围环 境选取适合实验室所用的萃取溶剂用于提纯m c s ，不同溶剂萃取体系见表1 2 。 表1 2 不同溶剂萃取体系的比较 t a b l e1 2d i f f e r e n ts o l v e n te x t r a c t i o ns y s t e mc o m p a r i s o n 溶剂方法比较 n h 4 h c 0 3 丁醇甲醇水 5 乙酸 正辛醇水 分别用1 0 0 和7 5 的甲醇 不同比例的甲醇 5 乙酸、1 0 0 甲醇 p h = 1 0 时提取效果最好。 提取效果较好，但需要长时间的高速离心。 提取程序简单；但不能去除藻毒素内所含的 大部分的色素。 随着p h 值的降低，提取效果降低。 7 5 的甲醇提取率比1 0 0 的甲醇高5 0 。 5 0 - 8 0 甲醇作为溶剂各有差异。 连续提取比单独提取效果差。 注：l = 亮氨酸；i p 精氨酸 b o t e 等人首先对m c s 的提取和纯化进行了研究，提出并确定了提取纯化多 种m c s 异构体的方法【3 0 l 。其后，国内外研究学者在此基础上开展了大量的筛选 工作口”4 1 。即分别采用了不同的提取体系进行了大量的对照试验，使用最多的就 是有机溶剂，主要的提取体系有： 醇水体系：目前采用最多的是不同浓度的甲醇水体系，从4 0 到8 0 7 微囊藻毒素m c i 。r 纯品的制各t 艺研究 不等，闰海等人采用4 0 的甲醇溶液提取，经过超声破震荡后高速离心得到藻毒 素的粗提液，通过纯化精制最终得到m c s ，实验结果表明，随着提取液浓度的 增加，所提取的m c r r 和m c l r 浓度也有所增加，当甲醇浓度为4 0 时，m c r r 和m c l r 的浓度最大，此后，随着提取液浓度的增加m c s 的浓度逐渐降低【3 2 1 。 卫涛等人采用6 0 的甲醇溶液作为提取剂，采用超声辅助离心后通过0 4 5 9 i n 的 微滤膜得到粗提液，经过后期纯化与制备，得到了很好的纯度较高的m c s ，并 应用与实验室制备【3 4 1 。陈晓国等人采用7 5 的甲醇最为提取剂，室温下在摇床 上震荡l h ，3 0 0 0 r m i n 的转速离心1 0 m i n ，经过液液萃取除去非极性有机杂质， 后减压蒸发除去有机溶剂而得到粗品，经过分离纯化后成功得到m c r r l 3 5 】。2 0 0 0 年，山西农业大学农学院的郝赤和英国纽卡斯尔大学农学院的r m w i l l 【i i l s 、 c r f l j e n d e r r n 三人突破以往使用甲醇水体系作为提取剂的束缚，直接将干燥的铜 绿微囊藻细胞溶于去离子重蒸水中，超声震荡后离心得到粗提液【3 6 1 。在提取剂的 探索中，还有学者通过调节p h 值来控制反应体系的浓度，2 0 0 5 年，史红星等人 使用一定浓度的甲醇在p h 为5 条件下，采用4 0 4 0 0 w 的超声辅助下，磁力搅拌 3 0 m i n ，再通过冷冻处理使微囊藻毒素充分的释放出来，离心取得上清液，得到 微囊藻毒素的粗品【3 。此外还有人使用混合醇水体系，如甲醇正丁醇水体系， 赵以军等人采用2 0 的甲醇、5 的正丁醇、蒸馏水共2 0 0 m l 作为提取剂，磁力 搅拌过夜后通过c 18 固相萃取柱，最终得到m c l r ，m c r r ，m c y r 三种异 构体【3 引。此外，还有采用甲醇乙酰胺水体系的报道口9 1 。1 9 9 9 年，p g j d em a a g d 等人采用正辛醇水体系作为提取剂，在不同p h 条件下提取m c l r 和m c r r 4 0 l 。 酸水体系：在早期的研究中很多的专家学者都采用酸水体系，使用最多 的是乙酸水体系。1 9 8 8 年，m s u z u k i 等人首先提出使用5 的乙酸作为提取剂的 观点，并应用于实验室的研究中，成功得到m c s 的多种异构体【4 。在后续的研究 中，2 0 0 5 年，吴和岩等人采用5 的乙酸水溶液作为提取剂萃取3 0 m i n ，1 0 0 0 r m i n 离心后取上清液，通过固相萃取技术得到藻毒素的粗品【4 2 】。2 0 0 8 年，胡志泉等人 取云南滇池的干燥藻粉加入5 的乙酸溶液萃取3 h ，所得提取液在8 0 0 0r m i n 的转 速在离, t m 0m i n ，取上清液经真空纤维素柱过滤，过滤后的上清液再通过自制的 反相快速色谱柱( s e p p a r kc 1 8 柱) ，1 0 0 甲醇洗脱，将洗脱液4 0 。c 下蒸干，水 溶液即为粗品微囊藻毒素：粗毒素再通过制备型h p l c 进行纯化，最终得到纯度 8 济南大学硕t 学位论文 大于9 5 的m c r r ，并用于常规的毒理学实验。王中禅等人以藻粉提取剂为 1 2 0 的比例，采用5 的乙酸作为提取剂，萃取离心后浓缩，将浓缩液通过大空吸 附树脂填料柱分离纯化后得到纯品洲。 醇酸水体系：文献报道的使用醇酸水体系提取的并不是很多，研究之 初，大部分是采用一锅煮的方法，配制混合的醇酸水溶液，1 9 9 8 年，t s a n o 等 人先采用5 的乙酸提取，然后再用1 0 0 的甲醇提取，比单独使用5 的乙酸和 1 0 0 的甲醇效果好【4 5 1 。在后面的研究中，门玉洁等人采用逐步提取的方法，先 用5 的乙酸溶液萃取3 0 m i n ，离心后取上清液，残渣再用8 0 的甲醇溶解，萃 取3 0 m i n 后离心收集上清液，旋转蒸发除去甲醇与5 的乙酸提取液合并，固相 萃取后得到粗品【钢。 1 2 2 浓缩与预纯化 对于提取出来的藻毒素粗品，其中的微囊藻毒素含量较低，并且杂质相对也 较多，故在纯化之前，需要进行浓缩富集和预纯化。实验室通常用的浓缩富集方 法一般是旋转蒸发和固相萃取两种。通常将旋转蒸发器温度设定在4 0 。c ，将样 品完全旋干，再用与萃取溶剂相同或者与萃取溶液不冲突的溶剂溶解到饱和，然 后采用传统的过滤或者膜技术过滤除去大分子物质，得到的粗品再进行后续分 离。 近年来，固相萃取技术( s p e ) 由于其特有的富集和纯化特点，逐渐被广泛 应用于生物大分子物质的纯化方面。固相萃取柱内一般选用o d sc 1 8 填料作为 固定相，而微囊藻毒素的洗脱液一般选用甲醇【4 7 1 ，也有研究者在一定比例的甲醇 溶液中加入o 1 的三氟乙酸( t f a ) 溶液将微囊藻毒素洗脱【4 8 】。如：卫涛等人 用2 0 、3 0 的甲醇溶液淋洗，氮气吹干固相萃取柱，之后再用4 0 的甲醇溶液 淋洗，最后用7 0 ( 加入0 0 2 - - 氟乙酸) 甲醇溶液洗脱【3 4 】；李耕用2 0 的甲醇 淋洗，氮气吹干后用1 0 0 的甲醇洗脱得到样品【4 9 1 ；郝赤等人采用大量的梯度洗 脱，依次用2 0 、3 0 、3 5 、4 5 和5 0 的甲醇水溶液淋洗，最后用1 0 0 的 甲醇淋洗，收集3 5 和4 5 的淋洗液【3 引。 固相微萃取( s p m e ) 高效液相色谱联用技术是一种预处理和分析纯化检测 于一体的方法，由于它把固相微萃取的分析速度快、溶剂消耗少，以及高效液相 9 微囊藻毒素m c l r 纯品的制备t 艺研究 i i | 色谱的重现性较好和易于自动化操作等优点结合起来，使得近几年对于微囊藻毒 素特性的研究的传统方法逐渐被取代。并且目前随着印记分子固定相以及对有机 溶剂有更高稳定性的聚合物涂层材料等一些性能更好的萃取头涂层材料的出现， 此方法在微囊藻毒素预纯化处理以及后续的检测工作中必能得到很好的发展。 1 2 3 分离与纯化 在微囊藻毒素的制备过程中，m c s 的分离纯化是至关重要的一步，国内外学 者在这一方面也做了大量的研究工作，目前，使用最多的去除杂质的技术是采用 多步纯化技术，涉及色谱技术，制备或半制备型液相色谱6 ，3 5 1 、快速色群3 q 等， 文献也有使用凝胶色谱法、反相色谱法、免疫亲和色谱法、制备或半制备型分子 排阻色谱、离子交换色谱、薄层色谱进行藻毒素提取的报道。制备型高效液相色 谱法能够满足生产高纯度样品的需要，但是仪器和分离柱的价格都比较昂贵，每 次提纯的m c s 的量也较少。薄层色谱法虽然价廉且能达到一定的分离效果，然 而它只适用于微量样品的制备。而凝胶、离子交换层析法等柱色谱法虽然可以满 足大量制备样品的需要，但是单独靠一种柱层析色谱来分离纯化微囊藻毒素很难 实现很好的分离【5 0 】。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，7 0 年代初期发展起来的一种以液体作 为流动相的新色谱技术，它是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的，和经 典的液相色谱没有本质的区别。但是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 并且实现了自动化操作，是一种高压、高速、高效的液相色谱法。 液相色谱由固定相和流动相两部分组成。液相色谱的流动相是各种溶剂；而 固定相一般是吸附剂、离子交换树脂、化学键合固定相( 或在惰性载体表面涂上 一层液膜) 或多孔性凝胶等。由流动相液体推动所要分离的混合物进入色谱柱， 根据混合物中各组分在固定相及流动相中的分配系数、吸附能力、分子尺寸大小 或离子交换作用等的差异进行分离。色谱过程中的保留行为主要取决于样品分子 ( 即溶质) 与溶剂( 即流动相) 以及固定相分子间的相互作用大小等。 液相色谱的应用不受样品挥发度和热稳定性的限制，适合分子量较大、难气 化、不易挥发或对热较敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占 有机物的7 0 至8 0 。 l o 济南大学硕 ：学位论文 利用高效液相色谱分离及纯化微囊藻毒素m c s 是目前普遍采用的手段之 一，在此过程中，需通过不断改变液相色谱的各个条件，探索出分离纯化m c s 的最佳条件。 m c s 分离纯化的色谱条件主要有：检测波长、流动相的组成、色谱柱柱温、 流动相流速、进样量等。微囊藻毒素的紫外吸收波长一般在2 3 8 n m 左右。最常 见的藻毒素异构体m c l r 和m c r r 所具有代表性的最大吸收峰出现在 2 3 8 2 4 0 n m ；含络氨酸( y ) 的藻毒素m c y r 的最大吸收峰则出现在2 3 0 2 4 0 n m ； 含色氨酸( w ) 的藻毒素m c l w 的最大吸收峰出现在2 2 2 2 2 3 n m 且在2 3 8 2 4 0 n m 处有小峰，几种m c s 标准品的紫外吸收光谱图见图1 2 【2 2 1 。 暇 光 麦 图1 2 以甲醇水体系作为流动相通过h p l c - p d a 法对微囊藻毒素异构体进行梯度洗脱分离 后，紫外扫描，主要保留时间为：m c l r ，2 0 ；m c r r ，1 4 ；m c l w ，3 8 ；m c y r ，1 9 。 f i g 1 2t h eu l t r a v i o l e ts c a n n i n gc h a r to f m i c r o e y s t i n si s o m e r sw i t hm e t h a n o l - w a t e rs y s t e ma s m o b i l ep h a s eh p l c p d a m e t h o d ，m a i n l yf o rr e t e n t i o nt i m e ：m c l r ，2 0 ；m c - r r ，1 4 ； m c l w ，3 8 ；m c y r ，1 9 。 关于色谱流动相的选择，目前文献中液相色谱分析微囊藻毒素流动相体系主 要运用三氟乙酸水甲醇溶液、三氟乙酸水乙腈溶液、磷酸缓冲液甲醇等几种。 ( 1 ) 三氟乙酸水乙腈溶液体系 众所周知，作为h p l c 的流动相，乙腈溶液一般都能够代替甲醇溶液使用， 微囊藻毒素m c l r 纯品的制各t 艺研究 且乙腈溶液的分离效果比甲醇溶液相对较好。但是，乙腈价格昂贵，毒性较大， 容易对实验操作人员的身体健康造成危害。当用0 0 5 - - - 氟乙酸：乙腈的水溶液 = 5 0 ：5 0 ( v v ) 的流动相，微囊藻毒素l r 的出峰时间大约在3 m i n 左右，分离 效果不理想。自2 0 0 8 年下半年以来，全球乙腈供应量短缺的现状更加明显，表 明，乙腈作为色谱的流动相不是最佳的选择，许多实验室现在都在致力于研究找 到一种更为合适的溶剂作为微囊藻毒素色谱分离的流动相。以甲醇代替乙腈作为 液相色谱分离微囊藻毒素是运用最为普遍，且效果比较理想。e s m el 等人将使 用甲醇和乙腈作为流动相时的保留时间等作了详细的对比，认为甲醇可以代替乙 腈作为m c s 液相色谱的流动相，并能取得较好的分离效果，保留时间也在适合 的范围内【5 。 ( 2 ) 磷酸缓冲液甲醇体系 杨再荣等人对水中痕量m c s 的测定条件进行了优化，液相色谱分析流动相 为甲醇磷酸盐缓冲溶液( 体积比为5 7 ：4 3 ) ，流速l m l m i n ，进样量1 0 9 l ，色 谱柱温4 0 。c ，检测波长2 3 8 咖【5 2 1 。 但是，甲醇磷酸盐缓冲溶液体系由于盐浓度较高，分析后仪器管路清洗如 果不及时，不仅容易出现结晶，还容易使得厌氧微生物生产繁殖，造成管路堵塞， 影响仪器的正常使用。 ( 3 ) 三氟乙酸水甲醇溶液体系 目前运用最多且分析效果较好的一种流动相体系。2 0 0 5 年，张立将等人在 水中微囊藻毒素高液相色谱检测与前处理条件的优化一文中提出以甲醇0 0 5 三氟乙酸( t f a ) 水溶液作为流动相进行梯度洗脱，对于m c r r 和m c l r 有 较好的分离效果，且保留时间适中，同时又可以尽可能地避免杂质干扰，其水样 检出限可达0 0 2 g l 【5 3 1 。 赵永刚等人提出了以固相萃取高效液相色谱法测定水中微囊藻毒素的方法 【5 4 1 。在此文献中提出，水样经过减压过滤后，在c 1 8 反相固相萃取柱富集浓缩， 用2 0 ( 体积分数) 甲醇溶液作为淋洗液，用纯甲醇作为洗脱液将微囊藻毒素从 固相萃取柱上洗脱下来，氮吹浓缩后，用0 0 5m o l l 磷酸盐缓冲液作流动相，与 甲醇以体积比为4 0 ：6 0 进行淋洗，用此方法对两种微囊藻毒素m c l r 、m c r r 的线性范围为o 2 5