（环境科学专业论文）微生物絮凝剂产生菌的筛选及其特性分析.pdf

微生物絮凝剂产生茁的筛选及其特性分析 s c r e e n i n go fab i o f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i n a n di t sf l o c c u l a t i n gc h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t ab a c t e r i a ls t r a i nw a ss c r e e n e do u tf r o mt h es e w a g ef a r mo fh o h h o t t h e o p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n ss h o w e dt h a t t h ec a r b o ns o u r c ew a ss u c r o s e ，t h e n i t r o g e ns o u r c ew a s c a r b a m i d e 1 0 wc nr a t i o ( c n = 2 5 ) w a sb e n e f i c i a lt om i c r o b i a l f l o c c u l a n t p r o d u c t i o n , t h e d e s i r a b l ec u l t i v a t i o nt i m ew a s8 4h o u r s ，c u l t u r a l t e m p e r a t u r ew a s3 0 c ，t h ei n i t i a lp h v a l u ew a s6 0 ，6 0 m lc u l t u r em e d i u mi n1 5 0 m l t o t a lv o l u m eo f t r i a n g u l a rf l a s k ( i nt h ec a s eo f 2 0 0 r m i n ) a c c o r d i n gt ot h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ，t h eo p t i m u mp r o p o r t i o n so fc o m p o n e n to fm e d i u mw a s o b t a i n e d ， w h i c hw e r es u c r o s el o g ，y e a s te x t r a c t1 3 9 ，c a r b a m i d e0 5 9 ，( n h 4 h s 0 40 2 9 ， k h 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，n a c lo 1 9 ，m 9 2 s 0 40 1 9 ，h ：o1 l ，p h ：= 6 0 f l o c c u l a t i o n t e s t sc o n d u c t e db yt h ef e r m e n t i n gs o l u t i o ns h o w e dt h a tt h ec u l t i v a t i o ns o l u t i o nh a da g o o df l o c c u l a t i o ne f f e c to nk a o l i nc l a ys u s p e n s i o n ，a n d t h ef l o c c u l a t i o nr a t er e a c h e s 9 5 i nt h eb e s tc o n d i t i o n t h et e s to fd i s t r i b u t i o no ff l o c c u l a t i n ga c t i v i t ys h o w e dt h a t t h es u p e m a t a n to fc e n t r i f u g a t i o nd i dn o th a v ea n yf l o c c u l a t i n ga c t i v i t y , a l lt h e f l o c c u l a t i n ga c t i v i t ye x i s t e di nt h ed e p o s i to fc e n t r i f u g a t i o n t h eb e s tf l o c c u l a t i n g c o n d i t i o n sh a dg o tf r o me x p e r i m e n t so ft h ee f f e c to fd i f f e r e n tp h ，t h ed o s a g eo f f l o c c u l a n t ，t h ek i n do fi o n ，t h ed o s a g eo fc a c l 2a n de t c t h ea p p l i c a t i o no fd e c o l o r i n g t e s t ss h o w e dt h a tt h eb i o f l o c c u l a n th a dag o o dd e c o l o r i n ge f f e c to nt h ew a s t e w a t e ro f d y i n g i tw a si d e n t i f i e da sk l e b s i e l l as p gb ys e q u e n c i n go f1 6 sr r n a ，a n di ti s t h e t t f i r s tt i m et ob er e p o r t e dt h a tk l e b s i e l l as p gc a np r o d u c eb i o - f l o c c u l a n t k e yw o r d s ：b i o f l o e c u l a n t ，k l e b s i e l l a 印，f l o e c u l a t i o na c t i v i t y ，c u l t u r ec o n d i t i o n s 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得由筮直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名： 肠主 指导教师签名：二圭兰兰 日 期：盈堡z ： 歹日期：垄啤笸：丛? 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留，使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允 许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印，缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文 为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后 使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用 于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表 学位论文作者签名：丝童 日 期：幽：组歹 指导教师签名：纽 日 期：也2 。：丛二 第一章微生物絮凝剂的研究概况 ( 一) 微生物絮凝剂的研究背景 絮凝沉降是给水和废水处理工艺中的一个重要环节，主要用于除去水和废水中的悬浮物 质和胶体物质，处理效果的好坏在很大程度上取决于絮凝剂的性能。 目前广泛应用的絮凝剂按其分子组成，可分为无机絮凝剂和有机絮凝剂；根据分子量的 高低，官能团的性质及官能团所带电荷的性质，絮凝剂又可进一步分为高分子型、低分子型、 阳离子型、阴离子型和非离子型等。具体分类和典型代表如图卜1 所示： 图1 - 1 絮凝剂的分类 f i 9 1 1t h ec l a s s i f i c a t i o no f f l o c c u l a n t 无机高分子絮凝剂由于絮凝活性高，价格低廉而得到广泛应用，尤其在我国，使用更加 普遍。相比之下，合成有机高分子絮凝剂则具有用量少、适应范围广、受盐类及环境条件影 响小、絮凝速度快、处理效果好等优良性能，因而在市场上占有绝对优势。 随着工业和科学技术的发展，无机和有机合成高分子絮凝剂越来越广泛地被应用于各种 水及废水的处理。然而，无机和有机合成高分子絮凝剂的生产和应用在取得长足进步的同时， 其使用过程中的不安全性和给环境造成的二次污染等问题己越来越引起人们的重视。无机低 分子絮凝剂如a 1 ”的投入，与目前日益增多的老年痴呆症的引发有直接关系：铁盐类絮凝剂 一一 一一渊糊 一一 一一一一 躺燃嗽 刚刚瞅枞纛曼 垡竺塑墨堂塑! 兰竺望塑堕垄墨苎塑堡坌堑 不仅具有较强的腐蚀性，限制了所用设备，而且容易残留铁离子，使被处理水带有颜色，影 响水质。“有机合成高分子絮凝剂聚丙烯酰胺是丙烯酰胺多聚体，虽然本身没有任何毒性， 但其难生物降解，易造成二次污染，而且聚合单体丙烯酰胺的残留也是一个令人十分担忧的 问题，它不仅具有强烈的神经毒性，而且是致癌物质，现在许多国家和领域已禁止或限量使 用此类絮凝剂，如美国严格规定其最大投加剂量不得超过1 o g l 。 天然高分子絮凝剂作为一种新的水处理剂，具有无毒、能安全降解的特点，但由于其絮 凝活性较弱，限制了其广泛的开发应用，工业生产和实际应用不多。 因此，开发一种安全无毒、絮凝活性较高、无二次污染的新型絮凝剂，对人类健康及环 境保护都具有很重要的现实意义。 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ，m b f ) 正是这样一类絮凝剂，它是利用生物技术， 从微生物或其分泌物中抽提、精制得到的新型高分子絮凝剂。它具有可降解、高效安全、无 毒，无二次污染等优点，克服了常规的无机絮凝剂和有机絮凝剂对人体有害和产生二次污染 的缺点，因而越来越受到各国水处理工作者的重视。“1 。 ( - - ) 国内外研究现状 微生物絮凝作用首先由l o u i sp a s t e u r 发现的。这里“絮凝作用”是指细胞的聚集现象， 但当时一直未引起重视“1 。 j n a k a m u r a 等在1 9 7 6 年首先从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌中筛选出1 9 株具有絮凝能 力的微生物，其中以酱油曲酶a j 7 0 0 2 产生的絮凝剂效果最好嘲。8 0 年代中期，k u r a n e 、仓根 隆一郎等从旱田土壤中分离筛选到红平红球菌s - 1 ，并将菌株产生的微生物絮凝剂( 主要成分 为粘多糖) 命名为n o c - 1 。它是目前研究得最为深入系统的微生物絮凝剂之一，也是絮凝效果 最好的生物絮凝剂，具有絮凝能力强和絮凝范围广等优点，在产生菌的筛选、分离纯化、发 酵条件的优化、分子结构的剖析及应用条件的摸索等方面都取得了一些成就，同时在降低生 产成本方面亦取得了一定的成果。h t a k a g i 等在1 9 8 5 年研究了拟青霉素属产生的絮凝剂， 并通过乙醇沉淀和凝胶色谱法获得精制絮凝剂p f i o i ，其分子量约3 0 万，主要成分为半乳糖 胺，对大肠杆菌、红血细胞、活性污泥等均有良好的絮凝效果。1 9 9 1 年k t o e d a 等又从土壤 中分离到一株产碱杆菌，它能在含有蔗糖的培养基中分泌絮凝剂a l 2 0 。y b a r 等发现一些海 底蓝细菌能产生数量可观的胞外絮凝剂”1 。 2 差= 童丝生堑鏊强塑| 的班塞趣毽 美国、日本、英国、法国、德国、前苏联、葡萄牙、以色列、韩国等都对微生物絮凝剂 进行了大量的研究，取得了初步的研究成果。目前，国外已有几种牌号的微生物絮凝剂粉末 和活液制品在市场上销售。 我国对于微生物絮凝剂的研究起步较晚，只是在近几年才刚刚涉足。目前，我国学者公 开发表的有关生物絮凝剂的文章大多为综述性报道，而且实验研究大多处在菌种筛选和菌株 培养液对废水处理的实验室小试阶段，而真正投入生产的微生物絮凝剂的相关报道很少。程 树培等人从活性污泥中筛选并研制了微生物絮凝剂i ：，m b f 和c s k l b f ，该絮凝剂对土壤悬浊液、 果汁悬浊液、碳素墨水、涂料废水、脱墨剂废水、豆制品黄浆水有良好的絮凝和脱色效果”1 。 邓述波等从土壤中分离到一株产生絮凝剂的芽抱杆菌a _ 9 ，其对黄浆废水絮凝效果好，且具 有用量少和不需助凝剂等优点。宫小燕等从活性污泥中筛选研制的假单胞菌p s e u d o m o n a s s p g x 4 一l 对高岭土悬浊液有很好的絮凝效果。对高岭土悬浊液絮凝效果好。王镇等从土壤和 污水处理厂的活性污泥中分离出4 株絮凝剂产生菌，3 0 r a i n 内可使果汁悬液澄清嘲。另外张本 兰从活性污泥中分离得到的只a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 菌株产生的絮凝剂对造纸黑液和氯霉素等有 色废水具有良好的絮凝脱色效果。台湾邓德丰从废水中分离到c 一6 2 细菌菌株并产生微生物絮 凝剂，可用于处理猪粪尿废水和红豆加工厂废水等。柴晓利等人研制的氮单抱菌生产的絮凝 剂处理生活污水时效果较好，且对造纸、染料、皮革废水的脱色效果非常明显”1 。黄民生等 在污水处理厂的回流污泥及俞经浦底泥中分离筛选出的3 株絮凝剂产生菌可使土壤悬浊液浊 度去除率达9 9 以上，使碱性染料废水c o d 去除率达7 0 左右，色度去除率达9 2 左右。 ( 三) 微生物絮凝剂的种类及结构特征 微生物絮凝剂的来源可包括以下四类： ( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮凝剂，他们大量存在于土壤活性污泥和沉积物中，如某些细 菌、酵母菌等。 ( 2 ) 利用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母菌细胞壁的葡萄糖、蛋白质等成分均可作为 絮凝剂。 ( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂。微生物分泌到细胞壁外的产物主要是细菌的荚膜 和粘液质，其絮凝剂的有效成分主要有蛋白质，脂类及其复合物，多糖在某种程度上可作为 絮凝剂。 塑兰塑墨鳖型圭竺堕堕堕垄墨苎丝丝坌堑 ( 4 ) 克隆技术所获得的絮凝剂。目前已从酿酒酵母中发现1 4 个絮凝基因，其中f l o i 和 f l 0 5 絮凝基因在1 号染色体上，f l 0 8 絮凝基因在8 号染色体上，这3 个絮凝基因分子克隆己 获成功。 微生物絮凝剂的结构和性质各异，如g h o d o c o c u se r y t h r o p o l f s 产生的絮凝剂n o c - 1 是 多糖蛋白，最大分子量为7 5 万“。絮凝剂d p - 1 5 2 是一种新型的微生物絮凝剂，来自糖的混 合物，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖，其质量比例约为8 ：4 ：2 ：1 ，分子量大约为2 1 0 6 道尔顿n 1 1 。 ( 四) 微生物絮凝剂的絮凝机理 关于微生物絮凝剂的絮凝机理目前普遍接受的是“架桥作用”机理“”。它认为微生物絮 凝剂是一类具有线性结构的高分子化合物，且线性结构中具有能与胶粒表面某些部分起作用 的化学基团。当微生物絮凝剂与胶粒接触时，基团能与胶粒表面产生特殊反应而互相吸附， 而絮凝剂的其余部分则伸展在溶液中，可以与另一个有空位的胶粒吸附，这样微生物絮凝剂 就起到了架桥连接的作用。如果加入m g ”，c a 2 + 等金属阳离子，则可减少悬浮颗粒的负电荷， 增加悬浮颗粒对大分子的吸收量，促进架桥的形成。c 矿不仅能够促进絮凝剂的形成，而且高 浓度的c a 2 可有效保护絮凝剂免受酶的降解作用。 ( 五) 微生物絮凝剂的产生及絮凝条件 微生物絮凝剂的产生受其培养条件的影响，影响因素包括： ( 1 ) 培养基组成，包括碳源、氮源及生命所需的各种无机盐等。不同微生物所需的营养物 质不同，如自养菌利用无机化合物作为碳源，而异养菌则利用有机化合物作为碳源( 蔗糖、淀 粉等) 和氮源( 牛肉膏、蛋白胨等) ，产荚膜细菌需要较高浓度的糖类作为营养物质“”。 ( 2 ) 培养基初始p h ，p h 可影响絮凝剂产生菌的生长及絮凝物的分泌，一般来说，细菌的 最适p h 为中性到弱碱性，而霉菌为酸性。如m b f a 9 培养基的最佳初始p h 为8 9 ，n o c - i 的 为8 5 。 ( 3 ) 培养温度，不同微生物所需适宜温度范围不同，一般认为，最适宜的温度为2 5 3 5 之间。 ( 4 ) 培养时间，不同微生物具有不同的生长周期，因而产生絮凝剂的周期也不一样。 4 差= 童熊生塑茎筮剂曲班塑攮逸 ( 5 ) 通气情况( 水浴摇床的转速) ，直接影响絮凝剂产生菌的生长及絮凝剂的分泌。 微生物絮凝剂的絮凝能力除受上述培养条件的影响外，同样也受污水水质条件的影响， 如p h 、浓度等。因此，在使用微生物絮凝剂处理污水时要做到具体情况具体分析。 ( 六) 微生物絮凝剂的应用 与有机或无机合成高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有絮凝范围广、活性高、安全无 害、不污染环境等特点，因此可以广泛应用于给水和污水处理。m 姗 ( 1 ) 畜产、屠宰废水的处理“”。畜产废水是一类高b o d 、高t o c 和高t n 的有机废水，传 统化学絮凝剂处理较难，而采用微生物絮凝剂处理效果好。研究表明n o c 一1 处理畜产废水 l o m i n 后，t o c 由处理前的1 4 2 0 m g l 降至4 2 5 m g l ，t n 从4 2 5 m g l 降至2 1 5 m g l ，去除率分别 达7 0 和4 0 9 i 。o d 。( 光密度值) 由处理前的1 5 7 变成0 8 6 ，浊度去除率达9 4 5 。“”1 ( 2 ) 膨胀活性污泥的处理。有些工业废水在采用活性污泥法处理时，常因污泥沉降性能变 差而影响处理效果，若添加生物絮凝剂，能有效消除污泥的膨胀，使污泥的容积指数快速下 降，从而提高处理效果。如甘草制药废水生化处理过程中形成的膨胀活性污泥，当添加n o c l 后，污泥的s v i 从2 9 0 降至5 0 。”嘲 ( 3 ) 废水脱色。常规方法很难去除有色废水中的颜色。而采用微生物絮凝剂能取得理想的 脱色效果。研究表明，n o c - 1 可有效去除黑墨水及酵母生产过程中排放的糖蜜废水中的颜色， 能使上清液变为无色透明的液体。啪删 ( 4 ) 废水悬浮颗粒的去除。微生物絮凝剂可用于高岭土、粉煤灰、泥水浆等水样的处理。 如在陶瓷厂废水中添加n o c 1 ，可使坯体废水的o d 值由原来的1 4 降至0 0 4 3 ，釉药废水的 o d 值由1 7 2 降至0 3 5 ，浊度去除率分别为9 6 6 和9 7 9 。啪嘲 ( 5 ) 乳化液油水分离。目前尚未见到无机或有机合成絮凝剂用于处理油脂乳浊液的报道。 而r k u r a n e 的研究表明，向棕榈油乳浊液中加入a 1 a t u s 的絮凝剂粗制品后，能使油滴上浮 到乳浊液的表面形成油层，进而使下层清液的c o d 值明显下降。瞄“1 ( 6 ) 发酵液后处理。从发酵液中收集或除去菌体是发酵工业后处理中必不可少的环节，通 常采用离心或过滤的方法，但该法存在耗能高、成本高等不足之处。相比之下，微生物絮凝 剂对细胞具有优良的沉降性能，且可大大降低能耗和成本。啪“1 ( 7 ) 物质的分离纯化。利用生物絮凝剂的高选择性，可进行物质的分离纯化。如s t e p a n e n k o 5 微生物絮凝剂产生菌的筛选及其特性分析 v g 将b a c i l l u sc e r e u s 成功地用于黄金、白钨矿等贵重稀有金属类化合物的富集提取。哳 ”1 因此可以广泛应用于给水和污水处理。 6 第二章高效微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化 微生物絮凝剂( 船f ) 是具有絮凝活性的微生物代谢产物，主要成分有糖蛋白、多糖、纤维 素，核酸和d n a 等。 传统无机及人工合成的有机高分子絮凝剂易引起老年痴呆症嘲和具有“三致”效应嘲，其 应用越来越受到限制。因微生物絮凝剂具有产生菌易得、高效、无毒、不会造成二次污染和 絮凝范围广泛等优点，日益受到研究者重视”1 。近年来，国外对微生物絮凝剂做了大量的 研究，筛选得到了数十种微生物絮凝剂，s u h 等从土壤中分离并鉴定了能产生优良絮凝物质 的杆状菌株“”。y o k o i 等从杆状菌株培养中获得的谷氨酸( g a m m a - p g a ) 是一种无毒高效的絮 凝剂蚴。其中最具代表性的m b f 是k u r a n e 利用红平红球菌( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) 研 制成功的微生物絮凝剂n o c - 1 ，该絮凝剂对泥浆水、河水、粉煤灰水、膨胀污泥、纸浆废水 等均有极好的絮凝和脱色效果“”，是目前唯一工业化应用的m b f 。 筛选优良、高效、稳定的微生物絮凝剂产生菌，优化培养条件，提高絮凝活性、减少絮 凝剂用量、降低絮凝剂生产成本是将微生物絮凝剂推广应用，实现规模化生产的关键所在。 本章研究的目的在于筛选出高效絮凝剂产生菌，并通过优化培养条件来提高絮凝活性、降低 生产成本。 ( 一) 材料与方法( m a t e ri a i ea n dm e t h o d s ) 1 材料 筛选用牛肉膏蛋白胨培养基；培养基优化试验用通用发酵培养基。 筛选菌种的水样取自呼和浩特市辛辛板污水处理厂。 絮凝对象为4 9 l 的高岭土悬液，印染废水。 2 方法 2 1 微生物絮凝剂产生菌的筛选，其流程见图2 1 。 将污水用无菌水稀释成1 0 一、1 酽、l 旷、1 0 。4 、1 0 、1 0 1 系列菌悬液后，各取0 2 m l 接种 7 堡竺塑墨鳖型主生堕堕堡垄墨基堑丝坌堑 到2 0 m l 牛肉膏蛋白胨液体培养基中( 每个稀释度重复3 次) ，置3 0 c 、2 0 0 r m i n 摇床进行培 养。培养到2 、4 、6 天，分别进行初筛试验m 。 2 1 1 初筛试验 取i m l2 1 中初筛用菌液加入到装有2 0 m l4 9 l 高岭土悬液的2 5 m l 比色管中，同时加入 1 2 5 m l1 的c a c l ，溶液作助凝剂，盖紧玻璃塞后充分摇匀，静置1 分钟，观察有无大块絮花 产生。以未接种液体培养基代替菌液作为空白对照。 2 1 2 复筛试验 将初筛试验中能产生大块絮花的菌液在牛肉膏蛋白胨的平板固体培养基中进行稀释分 离，待菌落完全出现后挑取单菌落进行试管斜面划线培养，待菌苔出现后接种到通用发酵培 养液中进行扩大培养，培养到在初筛中出现良好絮凝效果的天数进行2 1 3 中的絮凝活性测 定。将复筛试验中具有明显絮凝活性的优势菌种以划线分离法进一步纯化后置4 c 冰箱保存。 2 1 3 絮凝活性的测定方法 首先在2 5 m l 比色管中加入2 0 m l4 9 l 的高岭土悬液和1 2 5 m l1 9 6 的c a c l 。溶液，然后加 入0 5 m l 发酵菌液，用l m o l l 的h e l 和n a o h 将p h 调到7 0 。另用未接种液体培养基代替发 酵菌液作为空白对照。将比色管上下快速颠倒1 0 次，慢速颠倒1 0 次，静置1 5 m i n 。用分光 光度比色法测定上清液在5 5 0 n m 处的吸光度，计算絮凝率e 。 e = ( a - b ) a * 1 0 0 公式i - i 其中：a 、b 分别为空白对照和发酵菌液在5 5 0 h m 处的吸光度。 2 2 菌种鉴定 对产絮凝剂菌株进行1 6 sr r n a 测序并在g e n e b a n k 中与已知菌比较。 图2 - 1 筛选流程图 f i g 2 一lf l o wc h a r to f s c r e e n i n g 差三茎矗墼熊生翅蠡掇趔亡生琶盟垣亟霆缝差盘挂位焦 2 3 培养条件优化试验 2 。3 。l 产絮凝剂最佳时间的选择：取1 2 支1 5 0 r a l 三角瓶，内装3 0 m l 灭菌后的液体培养 基，接入纯菌种置于3 0 c 水浴恒温震荡器上震荡培养。每1 2 h 取一次样品，测定发酵液的p h 和对高岭土悬液的絮凝率( 方法同2 1 3 絮凝活性的测定方法) ，同时用光电比浊法测定菌体 浓度，并用细胞干重法做相应的标准曲线鼬“蚰。 2 3 2 初始p h 的选择：将絮凝微生物分别在初始p h 为5 ，6 ，7 ，8 ，9 的通用发酵培养 基中培养，培养到8 4 h 时，按2 i 3 进行絮凝率的测定h 町。 2 3 3 碳源种类的选择：分别用等量碳源的乳糖、蔗糖、甘油、淀粉、果糖、酒精等代 替通用发酵培养基中的葡萄糖进行培养，并与通用发酵培养基的结果对照删。培养到8 4 h 时，按2 1 3 进行絮凝率的测定。 2 3 4 氮源种类的选择：分别用等量氮源的脲、酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵等 单氮源代替通用发酵培养基中的复合氮源( 脲、酵母浸膏、硫酸铵) 进行培养，并与通用发 酵培养基的结果对照。”删培养到8 4 h 时，按2 。1 3 进行絮凝率的测定。 2 3 5 碳氮比的选择：分别以碳源( 蔗糖) 和复合氮源( 脲、酵母浸膏、硫酸铵) 的质 量比( c n ) 为2 5 、5 、1 0 、1 5 、2 0 ，来进行絮凝微生物的培养啪蜘，培养到8 4 h 时，按2 1 3 进行絮凝率的测定。 ( 二) 结果与讨论( r e s u i t sa n dd i s c u s s i o n ) 1 微生物絮凝剂产生菌的筛选及鉴定 曲s ie i l as p s t r s i b 疆审玎1 6 暑r i b o s o 龃l 墨融e e 鸸c o 邮l e t e 暑e 啦e 耻e j l e b s i e l l t 姐卸删- e1 6 sr i b o s o m l 珊酗岛p a r t i a ls e 帆e m j il l e b s i d i s 瑚埔恤口m 毫et 6 sr mi e 蛳s t 摊i nk l e b s 3 i 南聃“i s l l l e b s i e l l 4 功i zi 6 sr i b o s o m l 珊；e 弛- p a r t i “s c i e n c e ，i l e b s i e l hs p 、e1 6 sr i b o s o 睢lm ：e n e ，l 地r t i = ls e q u e l l c e 广_ 1i l e b s i e l l e 印- 5 71 5 sr l b o s o m lm e e n 岛l h r t i a ls e 删 il i l e b s i e l l s 弧e 啊岫i 鱼s t 托i n c 0 1t s sr i b o s o 眦l 聃e e 珊jm r t i l ls e 姐e m e l l t s 2 e l l s 羁联埔，l 融z i h s ， 图2 - 2 以y $ 2 的1 6 sr r n a 同源性为基础的系统发育树 f i g 2 - 2p h y l o g e n e t i c 臼b a s e do l l6 1 4b pf r a g m e mo f1 6 sr r n as e q u e n c e so f y $ 2 9 微生物絮凝剂产生菌的筛选及其特性分析 初筛中获得6 株絮凝微生物，经复筛和传代培养，发现一株高效絮凝剂产生菌y s 2 最佳条件下其絮凝率为9 5 。经1 6 sr r n a 测序并与g e n e b a n k 中已知菌比对，发现其与 k e b s i e l l as p g 的同源性高达9 9 3 。系统发育树如图2 - 2 所示。 2 培养时间对菌体生长及絮凝性能的影响 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o 01 2 2 4 3 6 4 86 07 28 49 6 t i m e ( h ) + f l o c a c t i v i t y ( 呦+ g r o w t h ( g l ) + p h 图2 - 3y s 2 的产絮凝剂的周期曲线 f i g 2 - 3g r o w t h c u r v ea n df l o c c u l a t i n gr a t eo f y s 2 7 6 - 、1 5 4 _ 暑 3 2 兰 1 。 0 从图2 3 可以看出，y s 2 在培养到2 4 h 时，p h 、絮凝率、菌体浓度同时产生一个明显的 拐点，表明此时是菌体内生化反应发生变化的重要时期。菌体生长从此时进入稳定期，p h 至 此达到最低值，然后又开始缓慢上升，絮凝率从此时则进入一个快速增长期，在3 6 h 时达到 稳定值，在8 4 h 时达到最高值。絮凝率在1 2 2 4 h 之间，有一段下降的时期，说明处于菌体 对数生长期，絮凝剂得不到充分合成。絮凝率在进入稳定期后迅速攀升，说明此絮凝剂很可 能是一种次生代谢产物。由于在菌种生长的早期便有一定的絮凝率，说明该絮凝剂不是由于 微生物细胞自溶而产生的胞内物质。菌体生长是产酸的过程，絮凝剂大量形成时又形成了部 分碱性物质，到3 6 h 以后p h 基本保持了稳定趋势。 1 0 一毋一hp州州po西uo 3 初始p h 值对菌体的生长及絮凝性能的影响 弓 扫 + 譬 2 譬 g 矗 p h 1 卜f l o c 8 c t i v i t y ( ) 卜g r o w t h 图2 - 4 初始p h 值对絮凝活性的影响 f i 9 2 - 4e f f e c to f i n i t i a lp h o nf l o c c u l a t i n ga c t i v i t y 由图2 4 可知，p h 为6 0 时的絮凝率及菌体生长量均为最高，大于或小于6 时均呈现下 降趋势，菌体生长量和絮凝率的变化趋势基本一致，说明此菌的最适生长环境为偏酸性环境， 且在偏酸性环境中较有利于产生絮凝剂。 4 不同碳源对絮凝性能的影响 表2 - i 碳源种类的选择 t a b 2 1t h ec h o i c eo f c a r b o ns o u r 葡萄糖 7 5 2 乳糖 7 6 1 蔗糖851 甘油 7 7 1 淀粉836 果糖 6 0 5 酒精0 由表2 - 1 可见，除酒精外，选择乳糖、蔗糖、甘油、淀粉、果糖、葡萄糖等作为碳源， y s 2 均能正常生长且能产生一定的絮凝效果。其中二糖和多糖中产生的絮凝效果比单糖强， 而蔗糖中产生的絮凝效果最强。这可能是由于二糖及多糖本身能产生一定的絮凝剂，或是由 两伯：2弱册 堂兰塑墨鳖型兰生堕塑堕垄墨茎鳖丝坌堑 于二糖及多糖能产生一定的助凝作用。这与以往文献中的絮凝微生物完全不同，卢文玉、高 杰等的研究成果认为微生物在富含单糖、营养较丰富的培养基中培养时，有利于产生絮凝剂 呻5 l 】 5 氯源对絮凝性能的影响 表2 - 2 氮源种类的选择 t a b 2 - 2t h ec h o i c eo f n i t r o g e n $ o u r c ：e 甄源秤奚 絮凝率( ) 菌体浓度( g l ) 脲 8 1 7 3 1 2 复合氮源 7 2 7 2 9 4 硫酸铵0 0 酵母浸膏0 0 牛肉膏0 0 蛋白胨0 0 由表2 - 2 可见，y s 2 对氮源要求较苛刻，只有在脲或复合氮源( 脲、酵母浸膏、硫酸铵) 存在的培养基中才能够生长。且培养基中脲含量高( 只以脲为单氮源) 产生的絮凝率高。由 此可见，脲在菌体生长或絮凝剂合成中起重要作用。 6 碳氮比对絮凝性能的影晌 5 1 0 1 5 6 6 3 5 7 5 2 3 8 2 3 8 3 8 8 5 2 9 9 3 0 4 3 0 9 2 0 5 3 7 7 9 5 2 8 9 由表2 - 3 可知，y s 2 在碳氮比为2 5 时絮凝率最高，菌体生长最好。碳氮比在2 5 1 5 时絮凝率均在8 0 以1 - ，说明碳氮比低有利于对絮凝剂的合成。可能是因为本试验筛选的y s 2 自身不能合成氮素。这与t e z u k ay 的研究成果相似。”。 7 培养基成分的正交试验 为了研究无机氮源与有机氮源、长效氮源与短效氮源以及碳氮源之间的搭配，本试验除 了改变通用发酵培养基中的碳源以及氮源之间的比例外其他成分不变。做正交试验找出最佳 配比，采用四因素三水平正交试验表，因素与水平见表2 4 。 表2 - 4 正交试验因素水平表 ! ! ! ：型! 堡垒塑! 竺! ! ! 塑唑! 窒型塑 水平a 蔗糖( g l ) b 酵母浸膏( g l )c 脲( g l ) d 硫酸铵( g l ) i1 0 0 5 0 50 2 2 2 00 9 1 3 0 5 3 3 01 3 2 1 0 8 表2 - 5y s 2 的正交试验结果 丝兰里! 型堡竺些! 些型塑竺墅堡 ab cd 堕塑! 型坐壁墨望童! 型尘壁! ! 垒!堕墼簦! 芝尘 量竺兰! 竺 1 号 1 0 o一05o 2 2 号 l o 0 一 i 3 0 5 3 号 1 0 1 3 2 1 0 8 4 号 2 0 0 51 3 0 8 5 号2 0 0 92 10 2 6 号2 01 30 5 o 5 7 号3 0 0 52 10 5 8 号3 0 0 9 0 5 0 8 9 号3 01 31 3 0 2 k 1 2 3 52 1 7 42 2 5 9 2 2 3 4 k 2 2 1 3 72 0 6 72 1 9 2 1 6 4 k 3 2 0 9 72 3 4 32 1 3 5 2 1 8 6 k l 7 8 37 2 57 5 3 7 4 5 k 27 1 2 鹤97 37 2 1 k 36 9 97 8 17 1 2 7 2 9 8 1 1 7 2 9 8 1 7 0 1 6 6 3 7 7 3 6 6 2 6 7 5 7 6 11 堡差! ! ：! ：! ：! ：! 从表2 - 5 可以看出，1 ) 9 个处理中1 号试验的絮凝率最高，达到8 1 1 。这可能是由于该 菌在碳氮源含量均较低的情况下才易于产生絮凝物质。3 号试验的絮凝率为8 1 0 9 6 ，絮凝率排 第二，其碳氮比最低，从中再次证明了低碳氮比易于产生絮凝剂的结论：2 ) 由极差( r ) 值分析 可见，影响y s 2 絮凝的因素顺序依次为酵母浸膏( 9 2 ) 、蔗糖( 8 4 ) 、脲( 4 1 ) 、硫酸铵( 2 3 ) ； 微生物絮凝剂产生菌的筛选及其特性分析 最佳营养组合为b 3 a i c i d i 即：蔗糖l o g 、酵母浸膏i 3 9 、脲0 5 9 、硫酸铵0 2 9 。 通过以上试验得出了y s 2 的最佳培养基：蔗糖l o g ，酵母浸膏1 3 9 ，脲0 。5 9 ，硫酸铵0 2 9 磷酸二氢钾2 9 ，磷酸氢二钾5 9 ，氯化钠0 1 9 ，硫酸镁0 1 9 ，蒸馏水1 l ，p h = 6 0 。 8 培养温度对絮凝性能的影响 把y s 2 的培养温度分别设为2 5 、3 0 、3 5 c ，其絮凝率及菌体浓度如图2 5 所示，y s 2 在 温度为3 0 c 时絮凝率及菌体生长量都为最高。说明3 0 c 时最适合y s 2 的生长繁殖，其生理生 化条件也利于絮凝剂的合成。 2 0 2 53 03 54 0 c u l t u r i n gt e m p e r a t u r e ( o c ) - f l o c a c t i v i t y ( ) _ g r o w t h ( g l ) 图2 - 5 不同培养温度对絮凝率的影响 f i g 2 5e f f e c to f c u l t u r i n gt e m p c m t u m o i lf l o c c u l a t i n ga c t i v i t y 9 三角瓶装液量对絮凝性能的影响 因为三角瓶的装液量和摇床转速都能直接影响到培养基的通气量，因此本试验将摇床转 速设定为2 0 0 r m i n ，通过改变装液量来改变通气量。在1 5 0 r a l 三角瓶中分别装入6 、3 0 、6 0 、 9 0 、1 2 0 m l 培养基( 即三角瓶标定容量的1 2 5 、1 5 、2 5 、3 5 、4 5 ) ，接种，培养到8 4 h 后 进行絮凝和菌体浓度的测试试验。 1 4 一呻v鲁隹 5 5 5 5 3 3 2 2 1 1 o o 弓参芎苫毋ddlu 一 _ i 1 2 51 52 53 54 5 v a r i o u so x y g e n s u p p l y g r o w t h ( g l ) 口f l o c a c t i v i t y ( ) 图2 - 6 不同供氧模式对絮凝性能的影响 f i 9 2 - 6e f f e c to f v a r i o u so x y g e n - s u p p l yo nf l o c c u l a l i n ga c t i v i 锣 由图2 - 6 可知，装液量越少，即通气量越大，培养基中的菌体浓度越高，菌体生长得越 好。说明y s 2 是一种好氧菌。而絮凝率则是在装液量为三角瓶的2 5 时最高，过多或不足都 会导致絮凝率的下降。可见该菌的生长及产絮凝剂的最佳通氧量是不一样的。 因此大量生产絮凝剂时应该采取两段式发酵的方法。即菌体生长早期要充分通氧，当达 到稳定期时适当减弱通氧量，以获得大量絮凝活性高的y s 2 菌株。 ( 三) 小节( c o n e i u 8 i o n s ) 从呼和浩特市污水处理厂污水中筛选到1 株高效絮凝剂产生菌y s 2 ，1 6 sr r n a 测序鉴定 其为克雷伯氏菌g ，克雷伯氏菌g 能产生微生物絮凝剂尚属首次报道。通过试验得出了该菌 种的最适宜培养条件：培养基初始p h = 6 0 ，培养温度为3 0 c ，在2 0 0 转m i n 下的三角瓶装 液量为三角瓶标定容量的2 5 ，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为脲。正交试验优化后的培养基 为：蔗糖1 0 9 ，硫酸铵0 2 9 ，脲0 5 9 ，磷酸二氢钾2 9 ，磷酸氢二钾5 9 ，氯化钠0 1 9 ，酵母浸 膏1 3 9 ，硫酸镁0 1 9 ，蒸馏水1 l ，p h = 6 0 。 一一tip每oi 5 5 5 5 4 3 3 2 2 l 1 o o 阳 蓦； 一邑hp_pooo【 第三章高效微生物絮凝剂产生菌的特性分析 目前微生物絮凝剂研究面临的主要问题是新型微生物絮凝剂产生菌的筛选、培养成本的 降低、提高絮凝活性和降低絮凝剂用量。本章中研究的目的在于从y s 2 的絮凝特性的影响因 素方面进行试验，以达到提高絮凝活性和降低絮凝剂用量的目的。 ( 一) 材料与方法( m a t e r i a l se n dm e t h o d s ) 1 材料 絮凝对象和脱色对象分别选用4 9 l 高岭土悬液、鸵鸟牌蓝黑墨水稀释液( 稀释5 倍) 及 印染废水稀释液( 稀释5 倍) 。印染废水取自呼和浩特市羊绒披肩印染厂。 2 方法 2 1 絮凝特性试验 絮凝试验用菌种培养液的培养条件：初始p h = 6 0 ，培养温度为3 0 c ，摇床转速为 2 0 0 r r a i n ，三角瓶的装液量为标定容量的2 5 。 2 1 1 絮凝活性分布 将菌种发酵液离心，取上清液备用；沉淀用同样体积的p h = 7 0 的蒸馏水溶解为溶液。分 别测定上述两项溶液及未离心的菌种发酵液对高岭土悬液的絮凝率( 方法同絮凝活性测定试 验) 嘲。 2 1 2 絮凝剂投加量与絮凝活性的关系 将y s 2 发酵液培养到8 4 h ，分别取0 0 0 ，0 0 5 ，0 1 0 ，0 3 0 ，0 5 0 ，0 7 5 ，1 0 0 m l 加入 到2 5 m l 比色管中，用空白培养基定容至1 0 0 m l 。加入到2 0 m l 的4 9 l 高岭土悬液进行絮凝 试验m “。 2 1 3 高岭土悬液p h 与絮凝活性的关系 用酸度计将高岭土悬液的p h 分别调节为1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 汹“1 。 1 6 差三童毫夔邀生堑嚣强趔亡生萱鳇挂丝熊堑 2 1 4 高岭土浓度与絮凝活性的关系 分别配制1 、2 、3 、4 、5 、6 9 l 的高岭土悬液，然后进行絮凝活性的测定。 2 1 5 不同金属离子作助凝剂对絮凝活性的影响 在2 5 m l 比色管中分别加入0 5 m l 的0 2 、0 1 、0 0 5 、0 1 、0 1 m o l l 的n a c l 、c a c l 。、 a 1 z ( s 0 ) a 、m g s 0 4 、c u s o + 和0 5 m l 的无菌水，保证5 种盐溶液的阳离子的离子强度基本一致。 用上述步骤代替絮凝活性测定试验中投加c a c t 。的步骤，其他步骤同絮凝活性测定试验。( 此 试验用水均为去离子水) “同。 2 1 6 不同c a c l ：浓度的助凝效果比较 配制2 5 的c a c l ：，分别取0 1 、0 2 、0 8 、1 4 、2 o m l 加入到2 5 m l 比色管中。用上述 步骤代替絮凝活性测定试验中添加c a c l 。的步骤，其他步骤同絮凝活性测定试验。( 此试验用 水均为去离子水) 洲。 2 2 脱色效果试验 先通过目测法定性检测有无脱色效果，有脱色效果的通过分光光度比色法进行定量检测。 以脱色前后溶液在最大波长处的光密度值的变化率作为脱色率，