（农产品加工及贮藏工程专业论文）壳聚糖酶法降解研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文 壳聚糖酶法降解研究 摘要 甲壳低聚糖( c h i t o o l i g o s a e c h a d d e s ，c o s ) 是壳聚糖( c h i t o s a n ，c t s ) 的降解产 物，不仅具有壳聚糖大分子的某些功能性质，而且还具有许多壳聚糖所不具备的 独特的生理活性和功能性质。本文旨在通过研究不同的非专一性酶对壳聚糖的降 解效果，探索酶法降解壳聚糖制备甲壳低聚糖有效方法，并对低聚糖相对分子量 分布范围进行了初步研究。 1 、选用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等5 种 酶，对壳聚糖进行降解试验。通过单因素试验，以还原糖释放量为指标，探讨以 上5 种酶降解壳聚糖的工艺条件。试验结果表明：在试验选取的范围内，5 种酶降 解壳聚糖所需时间依次为5 h 、3 h 、5 h 、4 h 和3 h ；果胶酶、枯草杆菌蛋白酶、纤维 素酶和木瓜蛋白酶酶解壳聚糖最适温度均为5 0 ，胃蛋白酶为5 5 ；果胶酶、纤 维素酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最适加酶量均为5 ，而枯草杆菌蛋白酶为7 ； 各酶降解壳聚糖最适底物浓度均为l ；考虑到降解产物一般在近中性的条件下使 用，为方便降解产物调节适宜的p h ，采用p h 5 0 作为各酶降解壳聚糖的酸碱条件。 通过对各酶降解壳聚糖的酶活力、酶解液中还原糖释放量，以及各酶降解壳聚糖 的粘度下降率3 个指标的综合比较，得出各酶降解壳聚糖的能力大小为：纤维素 酶 木瓜蛋白酶 胃蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 果胶酶。 2 、分别运用正交试验设计法优化纤维素酶和木瓜蛋白酶降解壳聚糖的工艺条 件，得出纤维素酶降解壳聚糖最佳工艺参数为：加酶量5 ，底物浓度1 2 5 ，酶 解时间6h ，酶解温度为5 5 ，p h 5 0 ；木瓜蛋白酶降解壳聚糖最佳工艺参数为： 加酶量7 ，底物浓度1 2 5 ，酶解时间6h ，酶解温度为5 5 。c ，p h 5 0 。将原料 壳聚糖胶体、壳聚糖酶解液分别过s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶色谱柱，发现原料壳聚糖 相对分子量主要分布范围为3 5x1 0 5 1 2 1 0 5 ；纤维素酶酶解壳聚糖，产物相对 分子量主要分布范围为8 4 x1 0 3 2 2 1 0 3 ( 洗脱体积为1 0 4 , - - , 1 3 0m l ) ，小部分 分布在相对分子量3 2 1 0 5 1 7 x1 0 5 的范围内( 洗脱体积为3 4 - - 4 6m l ) ；木瓜 蛋白酶解降解壳聚糖，产物相对分子量分布范围分别为3 2 1 0 5 1 0 1 0 5 ( 洗脱 体积3 4 - - 5 6m l ) 、1 2 1 0 4 2 7 1 0 3 ( 洗脱体积9 8 - - - 1 2 6m l ) 。从分子量分布 来看，纤维素酶和木瓜蛋白酶均未能对壳聚糖彻底降解。 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 3 、应用复合酶解技术，通过调整纤维素酶和木瓜蛋白酶的组合比例，探讨不 同比例的复合酶对壳聚糖的降解效果。结果表明：纤维素酶与木瓜蛋白酶按1 ：2 的 比例降解壳聚糖，还原糖浓度最高。采用二次回归旋转组合试验设计方案，建立 了加酶量( x 1 ) 、酶解温度( x 2 ) 、酶解时间( x 3 ) 与粘度下降率( y 1 ) 和还原糖 释放量( y 2 ) 之间的动态数学模型。试验结果的方差分析显示，方程y l 相关系数 r 2 为9 7 6 3 ，f 值为5 9 5 9 1 9 ，显著性系数为0 0 0 0 1 ，模型的符合度为9 7 6 3 ； 方程y 2 的相关系数r 2 为9 7 6 9 ，f 值为6 1 0 4 1 3 ，显著性系数为0 0 0 0 1 ，说明两 个回归方程是极显著的，能够较为准确的预测酶解实际效果。运用响应面法对工 艺条件进一步优化，得到复合酶降解壳聚糖的最佳工艺条件为：加酶量7 7 0 ，酶 解温度5 0 ，酶解时间5h ，壳聚糖浓度1 2 5 ，p h 5 0 。在此条件下对壳聚糖糖 进行降解，壳聚糖粘度下降率达到9 7 2 1 ，还原糖浓度达到2 4 7m m o l l ，均高于 纤维素酶和木瓜蛋白酶的单一酶解效果。同样将降解产物过s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶 色谱柱。洗脱曲线显示：降解产物相对分子量分布于1 0 x1 0 4 - - 2 7 x1 0 3 和2 3 x 1 0 5 1 1 1 0 5 之问。与原料壳聚糖胶体的洗脱曲线相比，使用复合酶降解壳聚糖 效果显著，大部分产物相对分子量低于1 1 0 4 ，产品溶解性良好。 关键词：壳聚糖；酶解；凝胶色谱法；响应面法 i i 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 s t u d yo nt h ee n z y m a t i cd e g r a d a t i o no fc h i t o s a n a b s t a c t c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ( c o s ) ，t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t so fc h i t o s a n , n o to n l yh a v e s o m ef e a t u r e so fc h i t o s a nm a c r o m o l e c u l e s ，b u ta l s oh a v el o t so fs p e c i a lp h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e sa n df u n c t i o n a lp r o p e a i e s t h i sp a p e ra i m e da tp r o b i n gi n t ot h en o n s p e c i f i c e n z y m a t i ch y d r o l y s i st e c h n o l o g yo fc h i t o s a n ，a n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n o f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s 1 f i v ek i n d so fe n z y m e si n c l u d i n gc e l l u l a s e ，p e c t i n a s e ，p a p a i n ，p e p s i na n ds u b t i l i s i n w e r eu s e df o rt h ed e g r a d a t i o no fc h i t o s a n ，a n dt h ec o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e db y s i n g l e f a c t o ra n a l y s i sb a s e do nt h er e l e a s ed o s eo fr e d u c i n gs u g a r t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p t i m u mt i m eo fc e l l u l o s e ，p a p a i n , p e p s i nw a s4h ，p e c t i n a s ei s3h ，a n d s u b t i l i s i n 2ht oh y d r o l y s i sc h i t o s a n t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e c t i n a s e ，s u b t i l i s i n , c e l l u l a s ea n dp a p a i nw a s5 0 。c ，a n d5 5 cf o rp e p s i nt oh y d r o l y s i sc h i t o s a n ；t h eo p t i m u m c o n t e n to fe n z y m ef o rp e c t i n a s ec e l l u l a s e ，p a p a i na n dp e p s i nw a s5 ，a n d7 f o r s u b t i l i s i n ；i na d d i t i o n t h eo p t i m a ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nf o rt h ed e g r a d a t i o nw a sl i n t h i sp a p e rp h 5 0w a st h eb e s tc h o i c ef o rt h ed e g r a d a t i o no fc h i t o s a nt of a c i l i t a t et h e d e g r a d a t i o np r o d u c t so ft h ea p p r o p r i a t ep ha d j u s t m e n t b yt h ec o m p a r a t i o no fe n z y m e a c t i v i t y , t h er e l e a s ea m o u n to fr e d u c i n gs u g a ri ne n z y m o l y s i sl i q u i da n dt h ed r o o pr a t e o ft h ev i s c o s i t yo ft h e s ed e g r a d a t i o np r o d u c t s ，t h ed e g r a d a t i o na b i l i t y s e q u e n c e w a s ：c e l l u l a s e p a p a i n p e p s i n s u b t i l i s i n p e c t i n a s e 2 t h eo r t h o g o n a lt e s ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so nc e l l u l a s ew e r ea s f o l l o w s ：t h eo p t i m u me n z y m ed o s a g ew a s5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a s1 2 5 ， e n z y m o l y s i st i m ew a s61 1 ，e n z y m o l y s i st e m p e r a t u r ew a s5 5 ( 2 ，p h 5 0 ；a n dt h et h e o p t i m u mc o n d i t i o n so np a p a i nw e r ea sf o l l o w s ：t h eo p t i m u me n z y m ed o s a g ew a s7 ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a s1 2 5 ，e n z y m o l y s i st i m ew a s6h ，e n z y m o l y s i st e m p e r a t u r e w a s5 5 。c ，p h 5 0 t h es e p h a d e xg - 1 0 0w a ss e l e c t e da st h es e p a r a t i o nm e d i u mt o s e p a r e t er a wm a t e r i a l so fc o l l o i d a lc h i t o s a na n dc h i t o s a nh y d r o l y s i sl i q u i dr e s p e c t i v e l y b yg e lc h r o m a t o g r a p h y f o rt h er a wm a t e r i a l s ，t h em a i nd i s t r i b u t i o nr a n g eo fc h i t o s a n m o l e c u l a rw e i g h tw a s3 5 x 1 0 5 - 1 2 x 1 0 5 , a n dt h es t u d yi n d i c a t e dt h a tt h er a n g ew a s i h 福建农林大学硕：仁学位论文壳聚糖酶法降解研究 m a i n l yb e t w e e n8 4 x10 a n d2 2 x10 3a f t e rd e g r a d a t i o nw i t hc e l l u l a s ei nt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s ( t h ee l u t i o nv o l u m ew a s10 4 13 0m l ) , a n ds u b s e c t i o nw a s 3 2 x10 5 1 7 x 1 0 5 ( t h ee l u t i o nv o l u m ew a s3 4 - - 4 6m l ) ；b e s i d e s ，t h em a i nr a n g e sw e r e3 2 x 1 0 5 1 7 10 5 ( t h ee l u t i o nv o l u m ew a s3 4 5 6m e ) a n d1 2 x10 4 - 2 7 xl0 3 ( t h ee l u t i o nv o l u m e w a s9 8 - 12 6m l ) a f t e rd e g r a d a t i o nw i t hp a p a i ni nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s 3 t h ec o m p o s i t ee n z y m a t i ch y d r o l y s i st e c h n o l o g yw a sa p p l i c a t e dt od i s c u s st h e e f f e c t so nt h ed e g r a d a t i o no fc h i t o s a nf o rd i f f e r e n te n z y m e sb ya d j u s t i n gt h er a t i oo f c e l l u l a s ea n dp a p a i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fr e d u c i n gs u g a rw a s h i g h e s tw h e nt h er a t i ow a s1 ：2 m o r e o v e r , b yr o t a t i o nc o m p o s i t ed e s i g no fq u a d r a t i c r e g r e s s i o n ，ad y n a m i cm a t h e m a t i cm o d e lt h a ts h o w e dt h ec o n n e c t i o nb e t w e e nt h e e n z y m ed o s a g e ( ) ( 1 ) ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e ( 澎) ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e ( x 3 ) a n dt h e d r o o pr a t eo fv i s c o s i t y ( y 1 ) ，t h er e l e a s ea m o u n to fr e d u c i n gs u g a r ( y 2 ) t h er e s u l t so f v a r i a n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr zo fe q u a t i o ny jw a s9 7 6 3 ， t h ev a l u eo ffw a s5 9 5 919 ，a n ds i g n i f i c a n tc o e f f i c i e n tw a so 0 0 01 ，t h ec o n f o r m i t yo f t h em o d e lw a s9 7 6 3 ；a tt h es a m et i m e ，t 1 1 ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr 2o fe q u a t i o n y 2w a s9 7 6 9 ，t h ev a l u eo ffw a s6 1 0 413 ，a n ds i g n i f i c a n tc o e f f i c i e n tw a s0 0 0 01 a s t h er e s u l t ，t h e s et w or e g r e s s i o ne q u a t i o n sw e r eh i g h l ys i g n i f i c a n t ，a n dc o u l db eg o o d u s e dt op r e d i c tt h ed e g r a d a t i o nr e s u l t s i na d d i t i o n ，t h em e t h o do fr e s p o n s es u r f a c ew a s u s e dt oo p t i m i z et h ep r o c e s sc o n d i t i o n s ，a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw a sa sf o l l o w s ：t h e c o n t e n to f e n z y n ew a s7 7 0 ，e n z y m o l y s i st e m p e r a t u r ew a s5 5 。c ，t h ec o n c e n t r a t i o no f c h i t o s a nw a s1 2 5 ，e n z y m o l y s i st i m ew a s5h ，p h 5 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h e d e g r a d a t i o no fc h i t o s a n ，t h ed r o o pr a t eo fv i s c o s i t yo fc h i t o s a nw a s9 7 21 ，t h e c o n c e n t r a t i o no f r e d u c i n gs u g a rr e a c h e d2 4 7m m o l l ，a n dt h ee f f e c tw a sb e t t e rt h a nt h e s i n g l ee n z y m e t h es e p h a d e xg - 10 0w a ss e l e c t e da st h es e p a r a t i o nm e d i u mt os e p a r e t e h y d r o l y s i sl i q u i dw i t ht h em e t h o do fg e lc h r o m a t o g r a p h y e l u t i o nc u r v es h o w st h a tt h e d i s t r i b u t i o no fr e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fd e g r a d a t i o np r o d u c t sw a s2 3 10 5 1 1 1 0 5a n d1 0 1 0 4 2 7 1 0 3 c o m p a r e dw i t ht h ee l u t i o nc u r v eo fr a wm a t e r i a l s ，t h e d e g r a d a t i o ne f f e c tw a ss i g n i f i c a n t ，a n d t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fm a j o r i t y p r o d u c t sw e r eu n d e rlxl0 4 k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，e n z y m o l y s i s ，g e lc h r o m a t o g r a p h y , r e s p o n s es u r f a c em e t h o d i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 一殉吏壶魄一7 6 7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文 指导教师亲笔签名 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 日期m 了b - 占 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 第一章引言 甲壳素是广泛存在于甲壳类、昆虫外壳和真菌细胞壁中的天然多糖，其资源量仅 次于纤维素，自然界每年生物合成的甲壳素将近1 0 0 亿吨，是地球上数量最大的含氮 天然有机化合物，是一种取之不尽、用之不竭的再生资源。它主要是由氨基葡萄糖或 少数乙酰氨基葡萄糖残基通过b 1 ，4 糖苷键连接而成的天然线性高聚物，是天然多糖 中唯一的碱性多糖，具有独特的物理化学性质和生理功能【1 】。因此，壳聚糖的开发应 用一直吸引着广大研究人员的浓厚兴趣。 近二十几年来，国际上对甲壳素研究有了较大进展。从最初的污水处理剂转变到 高附加值的具有生物活性的新材料和新产品，尤其是在医学、生物工程、食品、化妆 品、农业等领域已得到广泛应用。壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的产物，它不溶于水等一 些普通的溶剂，极大地限制了壳聚糖的应用。壳聚糖解聚后的产物称为甲壳低聚糖， 它溶解度高，易被吸收利用。甲壳低聚糖不仅保持了壳聚糖大分子所具有的某些功能 性质，而且还具有许多壳聚糖所不具备的独特的生理活性和功能性质，在食品、医药、 化妆品和农业等领域有着极其广泛的应用，己成为国际上新兴的一种功能性低聚糖叫。 1 1 壳聚糖的结构与性质 1 1 1 甲壳素的结构与性质 甲壳素( c h i t i n ) 又名甲壳质、几丁质、壳多糖。甲壳素的化学名称为：p 一( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 脱氧一d 一葡萄糖【3 】，相对分子质量通常在几十万到几百万，结构式 如图1 1 。 图1 1 甲壳素结构式 f i g 1 1s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc h i t i n 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 甲壳素一般以水产品加工中的虾、蟹的壳为原料，经脱钙、除蛋白制取而成，白 色或灰白色、半透明无定形固体，大约在2 7 0 。c 分解【4 1 。不溶于水、稀酸、碱类等一 般溶剂，可溶于浓的盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸，但同时主链发生降解。由于甲壳 素分子量大、溶解性差、氨基乙酰化程度高而使甲壳素的应用范围受到很大的限制。 1 1 2 壳聚糖的结构与性质 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，又名脱乙酰甲壳质、可溶性甲壳素、聚氨基葡萄糖，是由 甲壳素脱乙酰作用，脱去c 2 上的乙酰基而得到。壳聚糖的结构式如图1 2 所示。 图1 2 壳聚糖结构式 f i g 1 - 2s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc h i t o s a n 一般来说，甲壳素脱乙酰在5 5 以上就可以称为壳聚糖。壳聚糖呈白色或灰白色， 略有珍珠光泽，半透明无定型固体，约在1 8 5 分解，不溶于水和稀碱溶液，可溶于 稀有机酸和部分无机酸( 盐酸等) ，但不溶于稀硫酸、稀硝酸、稀磷酸、草酸掣3 1 。 壳聚糖是迄今为止发现的唯一的天然碱性多糖，以分子量和脱乙酰度来表征。被 欧美各国称为除蛋白质、脂肪、糖类、纤维素和矿物质之外的第六大生命要素【5 】，具 有独特的物化性质及生理功能，如增粘性、保湿性、金属螯合性、降血压、降血脂、 降胆固醇、增强机体免疫力等。近年来随着研究的深入，壳聚糖在医药、食品、化妆 品、农业及环保诸方面展现出独特的应用价值【6 ，7 】。但是，由甲壳素脱乙酰制备的壳聚 糖分子量一般都很大，结构紧密，不溶于普通溶剂，只能在某些酸性介质中溶解，极 大地限制了它的应用。 2 福建农林大学硕士学位论文 壳聚糖酶法降解研究 1 2 甲壳低聚糖的性质与应用 1 2 1 甲壳低聚糖的性质 甲壳低聚糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，c o s ) 是由甲壳素( c h i t i n ) 和壳聚糖( c h i t o s a n ) 经水 解后产生的一类低聚合度( 聚合度一般在2 2 0 ) 、可溶于水的氨基糖类化合物，是甲壳素 低聚物( c h i t i n o l i g o s a e c h a r i d e s ) 和壳聚糖低聚物( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ) 总称。其化 学结构是由n 乙酰d 氨基葡萄糖( g l c n a c ) 和d 氨基葡萄糖( g l c n ) 通过p l ，4 - 糖苷 键连接起来的均聚或杂聚低聚糖引。与壳聚糖大分子相比，甲壳低聚糖具有独特、优 越的生理特性。 1 2 1 1 水溶性 壳聚糖是含氮多糖类天然生物活性物质，在其大分子链结构中含有大量的 n h 2 o h 基团。当壳聚糖降解时，其分子量降低，壳聚糖分子内的氢键作用随之减弱， 使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖分子构象发生一定的变 化。链长度的缩短和分子构象的变化使得壳聚糖在水溶液中的无序程度增加，从而使 其水溶性能大为改善。 1 2 1 2 吸湿性和保湿性 由于甲壳低聚糖分子中大量的一n h 2 和- - o h 强极性基团的存在，不仅使甲壳低 聚糖的溶性大为改善，也使其具有良好的吸湿保湿功能。研究表明分子量一定的甲壳 低聚糖具有优于甘油和透明质酸的吸湿保湿功能，且在一定的分子量范围内，随均分 子量的降低，保湿增湿性能逐渐增强【9 1 ，随着低聚糖分子量的增加，吸湿率不断减小。 分子量为1 5 0 0 时具有最大值，即吸湿和保湿能力最大；当分子量上升到3 0 0 0 时，吸 湿和保湿能力基本不变；而当分子量为5 0 0 时，各项指标仅为分子量3 0 0 0 时的一半 1 1 0 。 o 1 2 1 3 抗菌抑菌作用 刘楠等【l o 】测定了分子量5 x 1 0 3 1 0 8 x 1 0 6 的7 种壳聚糖的抑制大肠杆菌的能力， 认为当壳聚糖的分子量在5 1 0 3 9 1 6 x 1 0 4 时，其抑菌能力是随分子量的增加而增加 的；当壳聚糖的分子质量在9 1 6 x 1 0 4 1 0 8 x 1 0 6 时，其抑菌能力是随分子量的增加而 下降的。郑连英等考察了不同分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌抑菌性能， 初步找出了壳聚糖分子量和浓度对抗菌抑菌作用的影响，提出了壳聚糖的抗菌机理。 福建农林大学硕= l 二学位论文 壳聚糖酶法降解研究 研究发现，分子量在3 0x1 0 5 以下时，壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌作用随分子量 减小而逐渐减弱。这些实验说明：壳聚糖的抑菌效果是受到其分子质量影响的，而且 针对的菌种的特性不同，效果也不一样。 1 2 1 4 降低胆固醇作用 甲壳低聚糖具有吸收胆汁酸和促使胆汁酸排出体外的作用，小肠内胆汁酸的减少 促使肝内胆固醇向胆汁酸转化从而降低肝脏中胆固醇的含量；也可与脂肪，脂肪酸、 胆固醇等脂类物质结合，产物具有很强的疏水性，不被胃酸水解，不被消化系统吸收， 而随粪便排出。s u g a n o 1 2 1 报告，甲壳低聚糖分子量在2 0 0 0 以上有降血脂作用，分子 量为5 0 0 0 时具有很强的降胆固醇能力。 1 。2 。2 甲壳低聚糖的应用 1 2 2 1 甲壳低聚糖在食品工业上的应用 甲壳低聚糖具有爽口的甜味，与脱乙酰氨基葡萄糖相比，随着聚合度的增大，其 甜味、吸湿性、溶解度降低，可作为食品添加剂，用于食品结构的改善，提高食品的 保水性及水分活性的调节等。 甲壳低聚糖由于具有增强人体免疫能力、降低胆固醇、抗肿瘤和溃疡等生理活性， 可用于保健食品的生产。日本己出现了多种用甲壳低聚糖制成的保健品，如卡尼期泰 的主要成分是甲壳低聚糖、壳聚糖有机铁和红花油，具有降低血脂的保健功能。 甲壳低聚糖具有抗菌和抑菌的作用，还可将其用于食品保鲜剂，有望成为一种新 型的“绿色”食品防腐剂，而得到推广应用。杨继生等【1 3 】在酱油中添加0 1 的甲壳 低聚糖，在夏季敞开条件下，酱油存放3 0 天无白花变质，且不影响其口感、颜色、 体态、香味与成份。 1 2 2 2 甲壳低聚糖在生物医药方面的应用 甲壳低聚糖在生物医药方面的重要用途之一是利用甲壳低聚糖的抑制肿瘤的作 用来制取抗癌药剂，特别是聚合度6 - - - 8 的甲壳低聚糖可通过活化人体中的淋巴细胞， 抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用【1 4 】。 癌细胞的形成伴随大量的癌毒素的释放。癌毒素会降低人体血清中的铁质，使人 贫血，食欲减退，而甲壳低聚糖在人体肠内形成的小分子基团会很容易被肠道吸收， 从而抑制癌毒素在人体内的释放同时，壳聚糖作为一种良好的聚电解质，z 目- 匕b ，k e 3 好地吸 4 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 附在血管壁细胞的表面，从而可抑制癌细胞的转移。另外甲壳低聚糖可有效地活化人 体淋巴细胞，增强人体抵抗病菌的能力。人体中的淋巴细胞具有分辨正常细胞，杀死 病菌细胞的效能，从而使人具有免疫力【1 5 1 。淋巴细胞的生理活性与周围环境的值有很 大关系，以稍显碱性为最佳。通常癌细胞的周围为酸性，而甲壳低聚糖上的氨基碱性 基团可适当调节体内的值，并通过这种调节作用改变机体处于病态时的生物化学平 衡，加强淋巴细胞的生理活性，从而对癌细胞的繁殖进行抑制。 甲壳低聚糖保持了壳聚糖大分子所具有的其他功能性质，包括降胆固醇，降血压， 防治糖尿病，强化肝脏机能，治疗烧烫伤【1 6 ，1 7 1 ，等等。 1 2 2 3 甲壳低聚糖在化妆品方面的应用 甲壳低聚糖在化妆品方面的应用，主要是利用其优良的保湿增湿性能。甲壳低聚 糖本身具有成膜功能，又具有良好的透气性能，是一种强的吸湿与保湿剂。与传统的 保湿增湿剂相比，甲壳低聚糖的保湿增湿性效果更佳，在洗面奶及各类膏霜中的使用 更显其优越性。护肤化妆品最重要的性能之一是调湿作用，即化妆品的保湿增湿作用， 通常护肤品的有效性就是依据其调湿能力而言的。在护肤化妆品中添加一定量的甲壳 低聚糖，既可以防止化妆品配方中水分的逸失，又可以对表皮水分进行水合，从而起 到保湿增湿作用。而且，甲壳低聚糖良好的透气性又不干扰表皮对废物和毒素的排泄， 不会造成皮肤粉刺。如含有适量甲壳低聚糖的面膜弹性好，对皮肤有明显的滋润剂保 护作用。其他添加甲壳低聚糖的护肤产品也有易被皮肤吸收，促进血液循环的作用。 1 2 2 4 甲壳低聚糖在农业方面的应用 甲壳低聚糖对植物病害有防治作用，其机理是诱导植物产生广谱抗菌性，增强植 物自身的防卫能力，抑制多种病源微生物的生长【1 8 】。研究发现，壳聚糖对大多数真菌 都有一定的抑制作用【1 9 1 ，可作为食品保鲜痢【2 0 1 。低聚壳聚糖还可以作为新型植物生 长调节剂，可以促进植物生长，提高种子发芽率，提高产量和抗病性【2 。 1 3 甲壳低聚糖的生产方法 近年来，由于低聚水溶性壳聚糖具有良好的功能性质与广泛的应用价值，低聚水 溶性壳聚糖的研究已引起各国学者的关注。目前甲壳低聚糖的生产方法主要是通过壳 聚糖降解获得。壳聚糖的降解方法主要有化学降解、物理降解和生物酶降解，以及由 其派生出的一些适合实际生产的复合降解法。 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 1 3 。1 化学降解法 酸降解是使糖苷键水解的一种最普通和最有效的方法。与一般的多糖相比较，甲 壳素和壳聚糖分子中的糖苷键需要采用较强烈的反应条件才能被水解，因此各种酸法 降解随之产生。 1 3 1 1 盐酸降解 酸在多糖的水解过程中起催化作用。盐酸降解法开发应用较早，b a k e r 等2 2 】早在 1 9 5 8 年就将制备的壳聚糖溶于3 3m o l l 的盐酸溶液中，在1 0 0 c 条件下反应3 2h ， 得到了聚合度为l 7 的氨基葡萄糖。p u p l e y 等f 2 3 】对浓盐酸降解甲壳素制备甲壳低聚 糖进行了系统的研究。实验中发现，随着盐酸浓度增大、温度升高，降解速率也越快。 此外，刘晓等 2 4 1 在使用不同浓度盐酸对壳聚糖、氨基葡萄糖单糖的降解试验中发现， 在1 0 0 c 并有氩气保护条件下，盐酸在降解壳聚糖的同时，对所产生的单糖分子结构 具有较强的破坏作用。盐酸水解具有明显的不足之处：产物中单糖较多，壳寡糖含量 相对偏低：反应条件苛刻，工艺繁琐，后处理麻烦：另外此过程需要消耗大量盐酸， 给环境带来巨大压力【2 4 】。 1 3 1 2 其它酸降解方法 硫酸在降解过程伴有o 和n 基上的磺酸化副反应，且p 1 , 4 键断裂无规律，与 乙酸酐混合降解时可获得2 3 聚合度的壳寡糖 2 5 】。 d e f a y e 等【2 6 1 用无水氟化氢降解壳聚糖制得产率较高、聚合度为2 11 的低聚糖。 但甲壳素在无水氟化氢中室温下水解1 0h ，主要产物是二糖到四糖，且有p 1 ，6 糖 苷键的低聚物异构体。 鉴于强酸对壳聚糖的降解过于剧烈，有人提出用乙酸、亚硝酸及磷酸等弱酸对壳 聚糖进行降解，但由于产品分子量分布较宽、降解时间长以及存在其它副反应等而受 到限制。 1 3 1 3 氧化降解法 氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法，特别是在日本，每年 都有这方面的研究成果报道。其中的h 2 0 2 氧化降解因成本低、降解速度相对较快、 产品分子量低且分布窄，无残毒、易实现工业化而倍受关注。其它氧化降解方法有 u v i - 1 2 0 2 、n a c i o h 2 0 2 等。 6 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 h 2 0 2 降解过程是利用h 2 0 2 在水溶液中电离形成的各种游离基h 0 2 、h o 及( o ) ， 其中高活性的h o 和新生态的( o ) 具有极强的氧化性能，它们攻击壳聚糖上那些带有 活泼n i - t 2 + 的p l ，4 一糖苷键，致使其解烈2 7 1 。 覃彩芹等人【2 8 1 在研究中发现，在弱酸体系中，既可使分子结构舒展，增多活性氧 化基团的攻击位点，又不会因壳聚糖分子中的部分n h 2 + 与大量的h + 结合生成r - n h 3 + 缺电子体系，阻碍了氧化降解的发生。同时还发现壳聚糖脱乙酰度越高，越容易降解。 h 2 0 2 降解法存在一个明显的问题是降解过程的后期常常伴有褐变反应，分析认为是 壳聚糖降解过程中发生了羰氨反应，增加后续产品提纯负担【2 8 】。 1 3 1 4 其它氧化降解法 目前也有亚硝酸盐法、过醋酸法制备甲壳低聚糖的报道【2 9 1 ，此类方法降解产物分 子量较高，其相对分子质量在2 1 0 4 - 5 x 1 0 4 范围内。 1 3 2 物理降解法 1 3 2 1 超声波法和微波法 2 0 世纪8 0 年代末期，我国学者王伟掣3 0 1 将甲壳质脱乙酰化后，溶于乙酸溶液中， 在6 0 。c 条件下用超声波处理，发现壳聚糖粘度明显下降，而降解过程中对氨基的含 量没有影响。超声降解法是目前试用较多的物理降解方法之一，但是该法突出的缺点 是得率太低，导致生产成本过高，因此要实现工业化还有待于进一步的研究。 微波辐射法近年来也引起了人们的研究兴趣。李鹏程等3 1 l 将聚合度为3 1 5 0 ， 相对分子量在6 0 0 3 0 ，0 0 0 之间的壳聚糖加入到含有n a c i 或k c i 或c a c l 2 的电 解质稀酸溶液中，以4 8 0 - - - 8 0 0 w 的微波辐射能量，降解反应3 1 2m i n ，冷却至室 温，然后用2m 的n a o h 溶液中和得淡黄色絮状沉淀，并在4 。c 冷藏柜中沉淀3 0m i n ， 抽滤。所得滤饼在6 0 。c 下烘干，粉碎，即得甲壳低聚糖化合物。此方法能够降低能 耗，减少污染，节省时间和原料，但由于微波使升温过快，存在单体容易挥发，反应 不充分等不足。 1 3 2 2y 射线照射下辐射降解 辐射降解是在放射性射线照射下，使壳聚糖分子产生电离或激发的物理效应，进 而导致分子链断裂。李治等【3 2 1 用放射性钻在大气和真空下照射相对分子量为2 7 4 x 1 0 5 的壳聚糖，得到一系列低聚合度壳聚糖。辐射降解成本低，反应易控制，无污染，产 7 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 品品质高，降解后壳聚糖的生物相容性不受影响，但y 射线辐射容易引起一些交联 和岐化反应，需要进行进一步的研究。 1 3 2 3 光降解法 紫外线、可见光和红外线对壳聚糖的辐照也可以降解壳聚糖，当辐照的波长小于 3 6 0a m 时，降解反应较明显，但是降解过程中会生成羰基，使产品有褐变现象。 v i v i a n a 等【3 3 】发现在用紫外光可见光度计测壳聚糖的降解程度时，在紫外光照射下， 壳聚糖的降解程度有所提高，这也说明了紫外光也能促进壳聚糖降解成壳寡糖。 1 3 3 酶降解法 化学方法降解会引入一些化学物质，如浓盐酸、氢氟酸、过氧化氢等，使反应剧 烈，反应操作困难而且对环境的污染巨大：超声波降解虽取得了较好的结果，但要在 很稀的溶液状态下进行；丫射线辐射又容易引起一些交联和岐化反应，酶降解法与其 它降解方法相比，具有无副反应、降解条件温和、降解过程及降解产物相对分子量分 布容易控制、制备的甲壳低聚糖生物活性高，近年来国内外常有相关的报道，已成为 今后研究的主要方向。酶降解法根据使用的酶不同，又分为专一性酶降解，如壳聚糖 酶、溶菌酶和非专一性酶降解，如脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等。 1 3 3 1 专一性酶降解法 壳聚糖酶主要存在于细菌和真菌细胞中，在一定的条件下壳聚糖酶能以内切作用 方式催化降解壳聚糖分子中的氨基葡萄糖昔键，生成聚合度为2 8 的低聚合产物，很 少产生单糖。 y a s h i t a 3 4 1 在研究中发现，壳聚糖酶在降解壳聚糖时，需要有一定的乙酰基协助 催化降解。在乙酰度不高的情况下，随着壳聚糖的乙酰度降低，酶的活性增高，甲壳 低聚糖的收率增大，而且降解时间是控制产物聚合度的关键因素。由此可见，壳聚糖 酶是以壳聚糖为降解底物制备甲壳低聚糖比较有效的方法。 与此同时，一些研究表明不同来源的壳聚糖酶由于氨基酸排列顺序及分子量不 同，其催化作用模式也不同。通过研究降解产物还原端的基团可以发现，一些壳聚糖 酶可以切断壳聚糖的g l c n a e g l c n 和g l c n g l e n 糖苷键，而另外一些壳聚糖酶 只能特异性切断壳聚糖中g l e n g l e n 糖苷键。 虽然近2 0 年来，已经从微牛物体内开发出多种壳聚糖酶，但是还没有实现工业 8 福建农林大学硕士学位论文壳聚糖酶法降解研究 化生产，目前仅限于实验室研究。 1 3 4 非专一性酶降解法 目前已经发现对壳聚糖具有降解作用的非专一性酶有3 0 多种，如多糖酶、蛋白 酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶，半纤维素酶等，其中蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤 维素酶对壳聚糖的降解效果比较显著。 周孙英等【3 5 】在利用纤维素酶、脂肪酶、溶菌酶和胃蛋白酶对壳聚糖的降解效果比 较研究中得出，胃蛋白酶的降解速度最快，纤维素酶次之，溶菌酶最慢。m u z e a r e l l i 等【3 6 】深入研究了木瓜蛋白酶对壳聚糖的降解作用，认为相对分子量在4 x 1 0 5 - - - - 7 x 1 0 5 范围内的壳聚糖很容易被降解为甲壳低聚糖，在室温下木瓜蛋白酶倾向于优先降解较 长的分子链，且只选择作用在两端分别连接g l e n a e 和g l c n 的的p 1 , 4 糖苷键。 p a n t a l e o n e l 3 7 】等人用多种酶对壳聚糖进行降解研究，发现一些聚糖酶对低粘度的壳聚 糖有显著的降解作