（林木遗传育种专业论文）Ri质粒转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究.pdf

摘要本研究分别用发根农杆菌3 0 1 4 8 ，1 5 8 3 4 和z a l f 三种菌株感染三倍体毛白杨叶外植体，并获得毛状根。建立三倍体毛白杨毛状根离体培养系统在含不同激素的培养基上诱导毛状根再生植株。分别从形态特征差异、p e r 检测、冠瘿碱检测三个方面对三倍体毛白杨转化植株进行了鉴定。表明r i 质粒的t - d n a 已整合进再生植株中。三倍体毛白杨的转基因植株与对照相比，9 l 的植株都发生了叶片皱缩，9 转化植株叶片生长正常，转化植株的叶片均在m s 。具有自发根的特性。对转基因三倍体毛白杨无性系试管茁生根率、根长、根数量、茎高生长及表型变异进行研究，结果表明：转基因三倍体毛白杨植株与对照相比，转基因三倍体毛白杨明显提高了组培苗的生根率，且根系发达；7 8 左右转基因无性系的根数量比对照增多，且侧根发达，形成簇生根，在组培苗生长过程中表现生根能力显著提高。田间栽植幼苗在叶片形态、叶面积、叶柄长度、节间长度、苗高等方面与对照相比具有显著的差异，多数表现为叶片皱缩、叶面长宽比增加、叶面积减少、叶柄长度变短、高生长量减少等特征。筛选出生长正常的如3 0 7 、3 2 8 、3 ，6 3 等无性系，生长变异很小。从发根农杆菌3 0 1 4 8 转化三倍体毛白杨转化植株中，挑选了3 0 个不同的转基因无性系测定了其主要功能叶的叶绿素含量及其光合速率。结果表明：不同转基因无性系问叶绿素含量差别较大，有两个转基因无性系的叶绿素b 含量非常低，其它转基因无性系叶绿素a 、叶绿素b 和叶绿素( a + b ) 含量间呈线性相关：转基因无性系的净光合速率8 5 左右较对照低，并且叶绿素含量与净光合速率没有相关性，转基因无性系的净光合速率与幼苗高生长呈正相关。通过h p l c 法对转化的部分植株叶片的内源激素进行了测定，所有转化植株叶片中i a a 含量均显著高于对照植株，生长表现越矮小的植株叶片中i a a含量超出对照植株越高；转化植株叶片中a b a 含量也超过对照植株，但幅度不如i a a ：对z t 的影响较为复杂，部分转化植株叶片的z t 含量比对照植株高，另一部分则低于对照植株：转化植株叶片中l a a b a 比值比对照植株有不同程度的提高。关键词：发根农杆菌：三倍体毛白杨；生长变异：形态变异；叶绿素；光合速率；内源激索s t u d yo hr ip i a s m i dt a n s f o r m a t i o na n de x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o no ft r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a r ( p o p u l u st o m e n t o s a )a u t h o r ：l i ux i n g i us p e c i a l i t y ：f o r e s tg e n e t i c sa n dt r e eb r e e d i n ga d v i s o r ：z h o uh u a o u n ，y a n gm i n s h e n ga b s t r a c ti nt h i ss t u d y , t h r e ea g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sb a c t e r i a ls t r a i n s3 0 1 4 8 ，1 5 8 3 4a n dz a l fi n f e c t e dt h el e a fe x p l a n t so ft r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a r , t h eh a i r yr o o t sw e r eo b t a i n e df r o ml e a fe x p i a n t s h a i r yr o o ti nv i t r oc u l t u r es y s t e mw a se s t a b l i s h e d ，h a i r yr o o tr e g e n e r a t i o np l a n tw a si n d u c e da tc o n t a i n i n gd i f f e r e n th o r m o n ec u l t u r e t r a n s f o r m e dp l a n to ft r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a rw a sc o n f i r m e db yt h es h a p ec h a r a c t e r i s t i c ，a g r o p i n ea n a l y s i s ，p c ra n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt - d n ao fr ip l a s m i dh a da l r e a d yb e e nc o m b i n e di n t oi nt h er e g e n e r a t i o np l a n t9 1 o ft r a n s g e n i cp l a n to ft h et r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a rl e a fs h o w e dw i n k l es y m p t o mc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r a s t ，t h eo t h e r sg r e wn o r m a l l y t h el e a v e so ft r a n s p l a n th a dt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h es p o n t a n e o u sr o o ti nm s om e d i u m t h er a t eo fr o o t i n g ，l e n g t ho fr o o t s ，n u m b e ro fr o o t s ，h e i g h to fp l a n ta n dp h e n o t y p i cv a r i a t i o no ft r a n s g e n i ct r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a rc l o n ew e r es t u d i e d ，r e s u l t ss h o w e dt h a t ：r a t eo fr o o t i n go ft r a n s g e n i ct r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a rw a si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n dh a de x t e n s i v er o o ts y s t e mc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r a s t ，t h en u m b e ro fr o o to f7 8 t r a n s p l a n tc l o n ew a si n c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r a s ta n dt h el a t e r a lr o o t sf o r m e dac l u s t e ra n dd e v e l o p e dw e l l ，a b i l i t yo fr o o t i n gw a si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ；t h es e e d l i n g so ft r a n s p l a n th a dar e m a r k a b l ed i f f e r e n c ei nl e a fs h a p e ，l e a fa r e a ，p e t i o l el e n g t ha n ds t e ml e n g t hc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r a s t ，m a j o r i t ys h o w e dt h a tl e a fw i t h e r e d ，l o n g w i d ei n c r e a s e d ，l e a fa r e ad e c r e a s e d ，p e t i o l el e n t g t hr e d u c e da n dg r o w t ho fh i 曲d e c r e a s e d t h ec l o n e sw e r es e l e c t e ds u c ha s3 0 7 ，3 2 8 ，3 6 3w h i c hg r e wn o r m a l l ya n dh a dl i t t l ev a r i a t i o ni ng r o w t h a b o u t3 0d i f f e r e n tt r a n s g e n i cc l o n e sw e r es e l e c t e df r o ma r h i z o g e n e s3 0 1 4 8t r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a rt r a n s p l a n ta n dc h l o r o p h y l lc o n t e n ta n dp h o t o s y n t h e s i z er a t eo ff u n c t i o no fl e a v e sw e r em e a s u r e d r e s u l t ss h o w e da sb e l o w ：c o n t e n to fc h l o r o p h y l lh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gd i f f e r e n tt r a n s g e n i cc l o n e ，o n l yt w ot r a n s g e n i cc l o n e sh a dl o wc o n t e n to fc h l o r o p h y l lb ，o t h e rt r a n s g e n i cc l o n e sc o n t e n to fc h l o r o p h y l la ，c h l o r o p h y l bh a dal i n e a rc o r r e l a t i o nw i t hc h l o r o p h y l l ( a + b ) ；p h o t o s y n t h e s i z er a t eo f8 5 t r a n s g e n i cc l o n e sw o r el o w e rt h a nt h ec o n t r a s t ，c o n t e n to fc h l o r o p h y l lo ft r a n s g e n i cc l o n e sh a dn oc o r r e l a t i o nw i t hp h o 【o s y n t h e s i z er a t e，p h o t o s y n t h e s i z er a t eo ft r a n s g e n i cc l o n e sh a dp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hg r o w t ho fh i g h t t h ec o n t e n to fe n d o g e n o u sh o r m o n eo fs o m et r a n s f o r m e dp l a n tl e a v e sw e r em e a s u r e dt h r o u g hm e t h o do fh p l c i a ac o n t e n to ft r a n s g e n i cp l a n ti sh i g h e rt h a nt h ec o n t r a s ts i g n i f i c a n t l y , t h es h o r t e rt h ep l a n tw a s t h eh i g h e rl ac o n t e n tw a s ；a b ac o n t e n to ft r a n s f o r mp l a n tw a sh i g h e rt h a nt h ec o n t r a s tt o o b u tt h ea m o u n ti sn o ts om u c ha si a a t h ee f f e c to fz ti sc o m p a r a t i v e l yc o m p l i c a t e d ，z tc o n t e n to fs o m et r a n s p l a n t sw a sh i 2 9 h e rt h a nt h ec o n t r a s t ，t h eo t h e r si sl o w e r ；t h er a t i oo fi a a a b ao ft r a n s f o r mp l a n tw a si m p r o v e dti nd i f f e r e n td e g r e e k e y w o r d ：a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ；t r i p l o i dc h i n e s ew h i t ep o p l a r ；g r o wv a r i a t i o n ；s h a p ev a r i a t i o n ；c h l o r o p h y l l ；p h o t o s y n t h e s i z er a t e ；e n d o g e n o u sh o r m o n e6 一b aa b aa sb s ane d l ag ahi a ak bk mm ( m o l h )m em i nm sn a a0 dp c rp r i“m i nr ir o ls d sst d n at it l d n at r d n ary e bz rn 6 - b e n z y l a d e n i n el i s to fa b b r e v i a t i o n缩写词表a c e t o s y r i n g o n eb o v i n es e r u f i ta l b u m i nd a ye t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i dg i b b e r e l l i nf i o u rl n d o 3 。a c t e t i ca c i d a l o b a s ep a i rk a n a m y c i nm o lp e rl i t e rm e r c a p t o e t h a o lm i n u t e ( s )m u r a s h i g ea n ds k o o g ( 1 9 6 2 ) m e d i u ma n a p h t h a l e n e a c e c i ca c i d ao p t i cd e n s i t yp o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr o o t i n d u c i n gp l a s m i dr e v o l u t i o n sp e tm i n u t er o o ti n d u c i n gr ir o o t i n gl o c u ss o d i u md o d e c y ls u l f a t es e c o n dd n at r a n s f e r r e df r o mat io fr ip l a s m i dt u r n o u ti n d u c i n gl e f t 、h a n dt r a n s f e r r e dd n ar i g h t h a n dt r a n s f e r r e dd n av i f u l e i l c ey e a s te x t r a c tb e a fm e d i u mz e a t i nn r 苄基腺嘿呤脱落酸乙酰丁香酮牛血清蛋白天己二胺四乙酸赤霉素小时吲哚乙酸千碱基对 那露索摩尔每升0 巯基乙醇分钟m s 培养基a 荣乙酸光密度聚合酶链式反应诱根质粒每分钟转速诱根r i 质粒诱根基因座十二烷基硫酸钠秒转移d n a根癌质粒左边界转移d n a右边界转移d n a致毒性酵母提取物牛肉青培养基玉米素独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭壅些盘茔或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：曲荔葫签字目期：秘年6 月坛e j学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑韭壑些盘兰有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑韭垒些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名翻菁翔导师签名闭归磐签字日期：甲r 矽年易月堰日签字日期：矿穆年月弦日学位论文作者毕业后去向工作单位：通讯地址：电话邮编r i 转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究1 1 发根农杆菌和r i 质粒1引言发根农杆菌“g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 是根瘤菌科( r h i z o l i a c e a ) ，农杆菌属“g r o b a c t e r i u m ) 的一种革兰氏阴性好氧菌，外形星杆状。具鞭毛，能侵染大多数双子叶植物和裸子植物及少数单子叶植物，在侵染部位形成大量生长快、分枝多、失去向地性的不定根，称为毛状根( h a i r yr o o t ) 。r i 质粒具有两个非常主耍的功能区即t - d n a ( 转移区) 和v i f f 致病区) 。t d n a 在植物细胞基因组的整合和表达l l ，2 i 导致毛状根的发生和再生转基因植株并利片j 植物的营养成分合成冠瘿碱作为发根农杆菌生存和繁殖的碳源和氮源。根据已发现的冠瘿碱的种类，将发根农杆菌及其r i 质粒分为4 种类型：农杆碱( a g r o p ( n e ) 型、黄瓜碱( c u c r o n o pn e )型、甘露碱( m a n n o p i n e ) 型和异黄瓜碱( m i k i m o p i n e ) _ 型1 3 i 。农杆碱型r i 质粒的t d n a 有两个边界区域，即t l d n a 和t r d n a 。t l d n a 上存在与根的形态有关的基因同时t l d n a 也影响再生植株的茎、叶的形态和些生理性状1 4 】。t r d n a 上有生长索合成基因t i n s l 和t i n s 2 ，指导i a a 的合成因此转化产生的毛状根。在培养时不需要添加外源生长素，为激素自养型。甘露碱型、黄瓜碱型和异黄瓜碱型r i 质粒为只有单一边界的d n a ，与农杆碱型r i 质粒的t l d n a 有较高的同源性。农杆碱型r i 质粒的t l d n a 在转化细胞中毽台的长度是相当固定的，而农杆碱型r i 质粒的t r d n a 整合的长度有很大变化。此外，在转化的毛状根克隆中可以有多个t d n a 缝合，这些d n a 或者独立存在( 非连锁) ，或者位于同一染色体上( 连锁) 。多t d n a 整合现象可能是多茁转化的结果，也可能是同一细菌向单个植物细胞转入多个t d n a 的结果。r m a b v l r0 r i圄1农杆碱型r i 质粒结构示意图川f i g 1s k e t c hm a po fa g r o p i n et y p er ip l a s m i d河北农业大学硕士学位论文1 2 发根农杆菌诱导毛状根形成的机制发根农杆菌对植物的遗传转化是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具有原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其大体过程如下：在通常状态v r 区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受伤的植物细胞合成的特殊的低分子酚类化合物乙酰丁香酮，它能够刺激农杆菌，使v r 区处于抑制状态的基因被激活，产生一系列限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生t - d n a 链，并引导t - d n a链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物细胞核内，t - d n a随后整合进植物细胞的基因组1 6 1 。1 2 1菌株不同菌株对不同植物或不同组织的侵染能力不同。一般农杆碱型菌株比其它类型的菌株具有更广的寄主范围和更强的侵染力。k i f l e 等发现用发根农杆菌和根癌农杆菌共转化植物外植体可大大提高转化效率。1 2 2外植体迄今为止，由r i 质粒成功转化的植物大多数为双子叶植物，草本植物对r i 质粒的敏感性比小本植物强，寄主受伤后酚类化合物的合成是影响植物对r i 质粒的敏感性的主要因素。外植体的选取十分关键，因为只有处于分裂期的细胞才能实现外源d n a 的整合。a c k r m a n n 等首次报道了应用发根农杆菌转化高等植物之后，相继有成功的报道而且转化植物的种类也不再限于双子叶植物，已扩展至玉米、杨树、苹果等植物 8 9 】，在药用植物方面也不乏报道。1 2 3 化学因子植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对v 一基因的表达有诱导作用【”】，小分子酚类化台物是诱导v i r 区基因表达所必需的。现已发现有关的植物细胞释放的信号分子有9种，均为酚类化合物，目前广泛使用乙酰丁香酮、羟基己酰丁香酮及植物细胞培养液来诱导农杆菌，并在一些转化实验中取得了好的效果l 。儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酸和对羟基苯酚等7 种化合物处理农杆菌也可使v 打基囚高效表达i l 。”j 。在共培时间短，难以诱导v f ，基因表达的情况卜，酚类物质的使用可能会产生好的效果 1 4 1 。乙酰丁香酮的使用还可以减小植物基因型的差异 1 5 l ，此外采用渗透保护剂甜菜碱和脑氨酸也可诱导v i r 基因的表达，其作用可能与加强细菌对渗透压的耐性有关l l “，添加适当的表面活性剂可以促进t - d n a 的转化【”】，但在另一些植物的转化上2r j 转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究乙酰丁香酮的使用无效甚至有害【”1 。1 2 4 物理因子发根农杆菌的增殖和活力对温度十分敏感，其最适生长温度为2 5 3 0 c ，而v i r 基因在2 8 时表达能力最强。因此共培养时保持2 8 ( 2 可提高诱根率，而除菌时保持2 0 ( 2 可抑制农杆菌的过度增殖，保持3 5 3 8 高温可促进除菌。p h 值对v f ，基因的活化影响极大，p h 值改变0 3 即显著影响转化率。含a s 的培养基p h为5 0 5 8 时，p 打基因的诱导能力最强。但农杆菌增殖培养基的p h 为7 2 ，因此，当农杆菌增殖到一定程度后，转入p h5 6 5 8 的植物组织培养基中有利于v i f 基因的表达【1 9 i 。光对诱导毛状根也有影响。火多数植物毛状根的诱导在黑暗条件下进行，而黄遵锡等( 1 9 9 7 ) 发现短叶红豆杉在全天2 4h 光照条件下对毛状根的诱导效果最佳i 。戴均贵f 1 9 9 9 ) 也发现紫苑毛状根在1 2h d 光照条件下的诱导频率比黑暗条件下高拉“。1 3毛状根遗传转化的特性首先用r i 质粒作为基因载体时，从其转化的植物细胞上很容易再生植株，即用野生型发根农杆菌感染植物可直接再生出完整植株。r i 质粒转化的植物发根培养物不仅生长速度快，而且易获得大量的无性繁殖再生植株 2 2 , 2 3 , 2 4 1 。其次，根癌农杆菌t i 质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非转化细胞所构成的嵌合体。然而，由发根农杆菌转化植物产生的毛根来源于同一个植物细胞，因此毛根的每一细胞都是转化的，这便于进行遗传操作。第三，毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择。第四，由发根农杆菌r i 质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化率高，倍性稳定，遗传稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核染色体上插入一个t - d n a 拷贝的株系。毛根具有生长迅速，多分枝，数量大、没有向地性与在其中形成有价值的次生物质等特点。由毛根再生的完整植株虽然具有表型正常的，但是经常表现出节间短、顶端优势比较弱、叶皱等特殊特征口“，这无疑为植物转化体的筛选带来了很大方便。1 4再生植株的鉴定由于再生植株大多数都具有特异的表型，因而检测的第一步可用形态变异作为依据。但并不是所有的转化植株都表现出特异的表型，发根农杆菌r i 质粒的t - d n a 部分整合到宿主植物细胞d n a 中后，在转化的细胞中就能合成特异的冠瘿碱。因此，冠瘿碱的有无可做为转化的指标之一。简单的方法是，利用高压纸电泳法【2 6 , 2 7 , 2 8 , 2 9 1 检测植物中是否含有冠瘿碱，如果含有冠瘿碱，表明确已转入农杆菌的t - d n a 。更为准确的方法是借助分3河北农业大学硕士学位论文子手段，经p c r 扩增3 0 - 3 4 】和s o u t h e r nb l o t t i n g 3 0 j 杂交等分析方法证实转化是否成功。1 5发根农杆菌的应用r i 质粒转化技术有两大应用前景：( 1 ) 通过基因操作获得具有r i 质粒转化后赋予的一些优良特征，如提高植物抗性和转基因特性等。由毛状根再生植株无论在植物抗性还是在其它转基因方面的研究和应用都有广阔的应用前景。通过选择优良的菌株，筛选合适的培养条件，毛状根很容易再生植株，通过筛选鉴定具有经济价值及科研价值的转化体可为理论研究和生产实践带来巨大的动力和效益，特别是在抗旱、抗寒、抗病等抗性研究及粮食作物增产增收等方面会有很大的发展。( 2 ) 用合适的生物反应器来培养毛状根皆可在工业化生产次生代谢物。1 5 1用于获得转基因植物和培育作物新品种r i 质粒r o l 基因转化的植株不仅表现出生根能力明显提高，而且通常还表现出叶片和花的形态、色素形成、节问长短、生活周期及向地性等性状的可遗传的变异，其中许多变异如植株矮化、节间缩短、花形和叶形改变等在同林植物品种改良中有很大的应用价值。1 9 9 4 年p e l l e g r i n e s e h i 等采用发根农杆菌对天竺葵进行r i 质粒转化，结果导致分枝数、叶片量以及芳香物质的含量均提高，从而显著改善了该植物的观赏特性 a s l 。g i o v a n n i n i 等( 1 9 9 9 ) 成功地将3 5 s r o l e 导入了一种菊科植物，得到的转基因植株不仅增加了花量和提早开花而是还改变了叶片的颜色及使植株变成直立生长。日本学者k i y o k a w a 等( 1 9 9 6 ) 利用r o l 基因对秋海棠进行转化，获得了矮生型与超矮生型的转基因植株，表现出叶片浓绿、皱缩，花瓣卷皱，叶量增多，株型矮化等一系列的可利用的形态变异，为培育具有更高观赏价值的新品系提供了选择基础【3j 。1 9 9 7 年黄遵锡等人，用发根农杆菌对短叶红豆杉的转化，并诱导毛状根，其中紫杉醇的产量是愈伤组织的1 3 8 0倍f 1 9 i 。1 9 8 8 年，张荫麟用发根农杆菌1 5 8 3 4 感染丹参叶片获得产生生物碱的转化根【3 6 i ：1 9 9 2 年他又用发根农杆菌感染金乔麦无菌苗，诱导出发根。1 9 9 1 年h 学贤等用发根农杆菌r 1 0 0 0 感染毛白杨，获得完整转化植株 3 7 1 。1 9 9 3 年，费厚满等用发根农杆菌感染绞股兰叶外植体，获得发根并从中提取出皂苷p 拄j ；孙敏等用含r i 质粒的发根农杆菌1 5 8 3 4 感染药用植物萝芙木无菌苗，诱导出发根，并从中提取出利血平和阿马碱，其中利血平含量为原植株的3 3 倍t 圳：徐香玲等用发根农杆菌感染番茄苗的叶片与胚轴，获得发根与再生植株【4 0 1 。1 9 9 4 年刘伟华用发根农杆菌感染桔梗，再生出转化植株【4 i j ；黄菊辉等用发根农杆菌质粒的t - d n a 区对茎芥进行遗传转化获得转化植株1 4 ”。1 9 9 8 年，刘春朝等用基因的r i 质粒的发根农杆菌转化药用植物青蒿，获得转化根，并在转化根中检测到青蒿的重要次生物质一青蒿素1 4 3 1 ；施和平等用发根农杆菌感染黄瓜子叶外植体获得发根【4 4 1 。1 9 9 9 年，王冲之等用发根农杆菌1 5 8 3 4 感染西洋参无菌苗切段获得发根，p c r分析证实r o l c 序列整台入转化植株的染色体组。1 9 8 9 年何玉科利用发根农杆菌转化甘蓝4r i 转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究型油菜等作物获得了含t d n a 的转化根；甘蓝下胚轴切段诱导出含t - d n a 的转化根，1 5 2 促进植物生根用发根农杆菌l b a 9 4 0 2 的遗传转化作用，从并由其再生出小植株【4 ”。近年来，许多研究表明，对木本植物导入r o l 基因或直接采用发根农杆菌处理木本植物的插条等繁殖材料，能够改善生根能力，明显地提高生根率，这可为解决生产上林木繁殖难生根的问题提供条新的途径。s t r o b e l 等( 1 9 8 5 ；1 9 8 8 ) 率先用发根农杆菌分别对扁桃插条和油橄榄苗木进行了接种处理后发现，发根农杆菌不仅能提高插条的生根率，促进根系的生长，有利于对干旱的抵抗，而且还导致叶片数量、径粗、苗高及植株生物量明显提高，在经处理后的油橄榄上还观察到其开花量、结实率、单果重以及含油率等均高于对照【4 ”i 。此后，不少研究者的实验结果也认为发根农杆菌可用作林本无性繁殖的生根剂，其具有诱导插穗不定根形成与提高扦插生根率的显著功效，已在欧洲榛、杂种杨、枣树、杨树、按树等许多扦插难生根的木本植物上得到了证实f 周达锋等，1 9 9 3 ；c h r i s t e y ，2 0 0 1 ) h8 t 4 ”l ，就是在某些裸子植物上也有成功的例子，如m c a f f e 等( 1 9 9 3 ) 用a r h i z o g e n e sa 4 和r 1 0 0 0 处理松属和落叶松属的插条及去根苗后，显著地提高了它们的生根率，而且根的数目和长度均大于对照垆“。t z f i r a 等( 1 9 9 8 ；1 9 9 9 ) 将带其内源启动子的r o l b 、r o l c 基因导入欧洲山杨，并获得了一批生根容易、生长量大的转基因植株，当移栽温室和田间后其年生长节律发生了变化，表现出转基因植株一年四季均保持1 0 0 的生根能力。另外，他们还对这些转化植株茎段进行离体培养，结果发现在无激素培养基上能形成大量的根系其不定根的数量、根表面积及鲜重均显著大于对照，且生根时间比对照火大缩短，从而提高了离体繁殖效率p 。b e l l 等( 1 9 9 9 ) 利用r o l b 基因转化苹果砧木的一些研究表明，转基因植株对生眭素的敏感性显著提高，生根能力改善，如在无激素培养基上所有转基因植株外植体均能生根，生根率达8 3 1 0 0 ，而未转化的对照植株生根率仅1 p 。1 5 3 用于生产外源基因产物近年来，利用毛状根转化技术获得次生代谢产物的研究，主要集中在提高一些价格高、产量低、需求量大的药物成分上。据不完全统计，国内外目前已对2 6 科9 2 种药用植物进行了毛状根诱导的研究，建立了长期的毛状根培养系统和获得了次生代谢产物。通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类f 如吲哚生物碱、莨菪烷生物碱、畦啉生物碱、喹嚷烷生物碱等) 2 ”、甙类( 如人参皂甙、甜菜甙等) 5 5 1 3 2 ，“i 、黄酮类、醌类( 如紫孽宁等) 1 3 4 5 7 ，5 ”、多糖类、蛋白质r 如天花粉蛋白等川) 。1 6 本研究的意义和目的扦插是树木无性繁殖的主要方法。二十世纪七十年代开始，世界范围内的无性系育5河北农业大学硕士学位论文林蓬勃开展一些容易生根的树种，如杨树、柳树、相思等树种由于其自身无性繁殖的优点，率先利用扦插繁殖对其优良的无性系进行了大面积的造林但是，我国有许多树种特别是一些珍贵树种，如我国两北沙漠地区的胡杨、青藏高原地区的银白杨、华北平原名优树种三倍体毛白杨等，由于其自身的生理特点，扦插生根较困难，严重影响了这些优良树种的推广和应用。由于林木常规育种受树木生长周期长的限制，性状的基因背景分析困难，增加了育种工作的难度。基因工程育种具有目的性强、时间短，并可以打破种问杂交不亲和的界限，能够加速林木新品种的培育。因此，林木基因工程育种已成为目前培育林木新品种的主要技术手段之一。在过去的1 0 年里，林木基因工程已经步入了快速发展阶段，己有一批转基因树木进入了田问试验甚至环境释放阶段，实现产业化f 苏晓华等，2 0 0 3 ) 。国内外利用基因工程技术提高植物的扦插生根能力已经进行了较多的研究。其中最主要的是利用发根农杆菌中的r i 质粒来促进植物的生根能力。虽然利用发根农杆菌的r i质粒能够诱导毛根的形成，但是这些转基因植物同时也产生了比较严重的表型变异，如顶端优势削弱、节间缩短、雄性不育、早熟等( 刘伟华等，1 9 9 5 ) 。其中瑞典农业大学在这方面做了很多的工作，也获得了一批具有应用价值的果树( 苹果、梨树) 新品种。这些转基因果树扦插苗在生根长度及毛根的数量方面具有明显的优势，扦插成活率大大提高。本研究的主要目的是r i 质粒转化三倍体毛白杨，以期改善其生根能力，并且筛选出生长变异较小或具有对生产有利的变异类型。由于r i 质粒r o l 基因转化的植株不仅表现出生根能力明显提高，而且通常还表现出叶片和花的形态、色素形成、节问长短、生活周期及向地性等性状的可遗传的变异，通过本研究希望培育出如植株矮化、节间缩短、叶形改变等具有更高观赏价值的杨树新品种，为园林植物品种改良提供了选择基础。6r i 转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究2 发根农杆菌转化三倍体毛白杨自从a c k e r m a n n _ 丁1 9 7 3 年1 6 0 1 第一例成功地用发根农杆菌转化了高等植物以来。植物遗传转化研究十分迅速。在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化仍占主导地位。根癌农杆菌在上个世纪初就引起了科学家们的注意，目前对根癌农杆菌的t i质粒的结构，功能及转化过程有了比较清楚地了解，对t i 质粒经人工改造也己建出了类重要的人工载体。对发根农杆菌的r j 质粒的研究要相对滞后p 1 i ，目前只有百余种植物感染r i 质粒后产生毛状根，其中有些植物已获得了转化植株【6 2 1 。这些主要是药用植物，如人参、木樨、黄芪等1 6 。三倍体毛白杨是一种人工培育的速生树种，具有很强的速生性，符合目前我国木材短缺而速生丰产的要求。但它还有明显的缺点，扦插成活率低。通过发根农杆菌的转化，不仅可获得比较容易扦插生根的杨树类型”，而且由于r d f 基因的转入也会引起植株株形、生长及木材纤维的变化，以期获得对生产更有利的优良变异三倍体白杨无性系。本研究是利用发根农杆菌1 5 8 3 4 ，z a l f , 3 0 1 4 8 对其三倍体白杨进行转化，从而为该植物进一步的细胞遗传操作奠定了基础。2 1材料与方法2 1 1研究材料2 1 1 1植物材料为本实验室三倍体毛白杨无菌组培苗。2 1 1 2发根农杆菌菌株发根农杆菌1 5 8 3 4 ，z a l f , 3 0 1 4 8 菌株由德国林业研究所e w a r d 博士惠赠。2 1 ，1 3培养基植物材料基本培养基：m s 培养基( m u r a s h i g e 和s k o o g 1 9 6 2 ) “i ，其固体培养基用5 5g l 琼脂固化，p h 为5 8 ，高温高压灭菌后备用。细菌培养基：y e b 培养基( s a m b r o o k ，f r i t s c h ，m a n i a t j s 1 9 8 9 ) 6 5 1 。其固体培养基附加琼脂1 2g l 固化，p h 为7 2 ，高温高压灭菌后备用。2 1 ，2 研究方法2 1 2 1发根农杆菌菌种的保存与活化7 0 c 保存在灭菌甘油中，f 离用前于y e b 固体培养基2 8 活化3 次。在超狰工作台上，从y e b 培养平板上挑取单细胞克隆菌落，接种于不含抗生素的液体y e b 培养基中，7河北农业大学硕士学位论文在2 8 。c 条件下的恒温摇床振荡1 6 2 0h ，用于感染。2 ，1 2 2 抗生素抑菌浓度的确定无菌条件下将三倍体毛白杨的叶片用剪刀沿叶缘横向剪三刀，分别接种于附加0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 ，5 0 0 ，7 0 0 ，10 0 0m g l 羧苄青霉素的m s + i b a l 0 的琼脂培养基上，3 周后观察叶片的生根情况，调查抗生素对叶片诱导生根的影响。另外，在无菌条件下将三倍体毛白杨的叶片用剪刀沿叶缘横向剪三刀，用发根农杆菌浸菌后分别接种于附加0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 ，5 0 0 ，7 0 0 ，10 0 0m g l 羧苄青霉素的m s o 的琼脂培养基上，3 周后观察细菌的污染情况，选择出既能控制细菌污染，又能减少抗生素对叶片诱导根生长影响的羧苄青霉素浓度。2 1 2 3 外植体的转化取一月龄三倍体毛白杨无菌苗幼叶，用剪刀沿叶缘横向剪三刀，剪断中脉。将无菌叶片放在苗液中浸泡5 - - l om i n ，用无菌滤纸吸去多余菌液。接种于m so 培养基中培养，共培养4 8h 后。将叶片接在m so4 - 3 0 0m g l 羧苄青霉素的培养基中培养，诱导毛状根的发生( 见图版1 a ) 。上述过程均须在无菌条件下进行。每种菌株浸染叶片8 0 1 0 0 个。2 周后叶片伤口长出毛状根，待毛状根长到2c m 以上时诱导植株再生。2 1 2 4毛状根雨生完整植株将毛状根剪取长3e m 左右的根尖，置于添加有不同配比的苄氨基腺嘌呤( b a ) 或t d z 和a 一萘乙酸( n a a ) 的m s 培养基上，诱导不定芽，每个处理组2 0 个根尖。当不定芽长至1 2c m 时，将其剪下，移至m s o 培养基中生根。2 1 2 5转基因三倍体毛白杨组培苗的形态鉴定将转基囚三倍体毛白杨及对照组培茁的单芽茎段( 长1 - 2c m ) 接种于m s o 培养基( 不添加任何激素类物质) 上，附加青霉素3 0 0m g l ，1 月后观察其叶片形态及茎段产生的根系形态。取转基因三倍体毛白杨及对照组培苗的无菌叶片，用剪刀横剪2 3 刀，深度为剪过中脉。接种于m s o 培养基上，一个月后观察其发根状况。2 1 3转化植株的p c r 检测2 1 3 1植物d n a 的小量提取参照r o g e r 和b e n d i c h ( 1 9 8 5 ) 1 6 叫的c t a b 法分别提取毛状根、叶及对照根、叶中的d n a ，稍改动：1 ) 在所需的2 x c t a b 提取液中加入o 1 的2 - m e ；2 ) 取5 0 - 1 0 0 m g 材料，加液氨磨成粉，将磨好的材料转入1 5 m l 的离心管中，加0 58r i 转化三倍体毛白杨及外源基因表达的研究m l c t a b 提取液，充分混匀，置于6 5 水浴6 0 r a i n ，期间不断摇动。3 ) 冷至窒温，加入等体积的氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻摇至溶液成乳化状，1 0 0 0 0r p m 离心5 m i n ；4 ) 取上清液，重复3 ) 步2 3 次；5 ) 取上清液，加入2 3 体积的异丙醇，2 0 c 放置3 0m i n ；6 ) 1 00 0 0r p m 离心5m i n ，弃上清液，沉淀用7 0 乙醇洗2 - 3 次；7 ) 加入t e 溶液溶解沉淀，加入1 1 0 体积n a a c ( 3 t o o l l ) 和2 倍体积无水乙醇，- 2 0放置2h 以上：8 ) 1 20 0 0r p m 离心5m i n ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗2 - 3 次，室温干燥沉淀；9 1 用5 0 i o o u l 灭菌t e 或双蒸水溶解沉淀即为所需d n a 样品t 未用部分一2 0 c 保存2 1 3 2引物设计根据g e n e b a n k 中r i 质粒的基因序列设计了三对引物，分别检测r o i c ，t o l d ，及t h i s基因。引物序列分别为：r o l d 基因引物r ：5 - c a gc t t c t a a a t g t gg t g g a gg c c 一3 f ：5 一c c t t g cc g a t t gc c a g t a t g g c ，3 t m $ 基因引物r ：5 1 _ c g gt c t a a a t g a a a cc g 0c a a a c g 一3 f ：5 g g ca g at g tc t at c gc t cg c ac t cc 一3r o l c 基因引物r ：5 - a c a a g c c a c t t c t g t t t cc c 3 f ：5 c a gc g a c t g c a ac c ag t tt a 一3 。2 1 3 3p c r 扩增条件反应总体积为2 0 l ，其中1 0 p c r 缓冲液2 芦l ，d n t p ( 2 5m m o l l ) l t l ，前末端引物( 1 0p m o l 似l ) 各毕l ，t a g 酶l u ，模板1 t l