（农产品加工及贮藏工程专业论文）大蒜ACEI活性肽制备技术的研究.pdf

_ 、j | _ 1 t，lt*ljj重譬，l口ifl，m_。；rd”#；7， ￥ i i i if li ii iil l j lpi iii ii y 1810 0 2 5 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：徐霞 日期：加僻年辱月矽日 r；ip i。笋f 大蒜a c e i 活性肽制备技术的研究 s t u d yo np r e p a r a t i o no f a n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m e i n h i b i t o r yp e p t i d e sd e r i v e df r o mg a r l i c 姓 2 0 0 3 年12 月 f _ i l 一 江 苏大 学 硕 士 学 位论 文 摘要 高血压是最常见的心血管疾病之一，它日益困扰着高血压患者的身心健康， 因此对降血压药物的研究也越来越多。血管紧张素转化酶抑制剂( a c e i ) 具有 降血压的作用，本文以大蒜残渣为原料，通过蛋白酶酶解制备出天然的a c e i 活 性肽，为了提高其活性，进行了超滤纯化。 为了满足体外检测功能因子a c e i 肽对a c e 抑制作用的需要，本文进行了 从新鲜猪肺中提取血管紧张素转化酶( a c e ) 的研究。采用反相高效液相色谱 ( i 冲h p l c ) 和胶束电动毛细管电泳色谱( m e c c ) 分别对猪肺提取物进行活性 检测，测得其比活力为3 7 u 1 0 m l 。建立了胶束电动毛细管电泳检测a c e i 活性 的方法，其检测条件为：分离电压2 8 k v ；采取压力进样，进样压力0 5 p s i ：上 样时间5 s ；柱温2 5 ；电极缓冲液：5 0 m m o l l ( 含l s d s ) 硼酸盐缓冲液， p h 8 3 ；检测波长2 2 8 n m 。 本文以水解液的抑制率为试验控制指标，从9 种商业蛋白酶中筛选出一种最 佳蛋白酶，并得出其最优作用条件为：反应温度5 0 、加酶量4 、底物浓度 8 、p h 8 。在该作用条件下，其水解液对a c e 的抑制率为8 5 9 8 。 选用m i l l i p o r e 公司的超滤设备对水解上清液进行超滤，选取截留分子量为 1 0 k 的超滤膜。以样品温度和操作压力对1 0 k 超滤膜通量的影响为根据，得出1 0 k 超滤膜的最优操作条件为：样品温度4 0 5 0 、操作压力0 0 9 m p a 左右。超滤 后的a c e i 活性肽的i c 5 0 值为2 1 5m g m l 。 大蒜残渣a c e i 活性肽具有很好的热稳定性，但在酸性条件下不稳定，需在 p h 值为8 3 的条件下，冷藏保存。此外该a c e i 活性肽能抵抗肠胃蛋白酶的作用， 说明其经口服后很可能仍具有降血压作用。 关键词：大蒜残渣，a c e i 活性肽，胶束电动毛细管电泳法，抑制率，超滤 江苏大 学 硕 士 学位论 文 a bs t r a c t h y p e r t e n s i o ni so n eo f t h em o s tu s u a l l ya r t e r i a ld i s e a s e si no u rl i f e ，w h i c hf a z e s m a n yh y p e r t e n s i o np a t i e n t s ，s ot h e r ea l em o r ea n dm o r es t u d i e s o nh y p e r t e n s i o n m e d i c i n e s a n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r y ( a c e i ) h a st h ee f f e c to f d e p r e s s i n gt h eh y p e r t e n s i o n t h en a t u r a lh y p e r t e n s i o ni n h i b i t o r y ( a c e i ) p e p t i d e s w e r ep r o d u c e db yp r o t e i ne n z y m ef r o mg a r l i cr e s i d u e s i no r d e rt oi n c r e a s et h e a c t i v i t yo f a c e ip e p t i d e s ，t h ea c e ip e p t i d e sw e r ep u r i f i e db yu l t r af i l t r a t i o n a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) w a se x t r a c t e df r o mf r e s hl u n go fp i g ， w h i c hw a st h em a t e r i a lf o rd e t e c t i n gt h ea c t i v i t yo fa c e ip e p t i d e si nv i t r o t h e s p e c i f i ca c t i v i t y o fa c ew a sd e t e r m i n e da s3 7 u 10 m lb yr e s e r v ep h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p - h p l c ) a n dm i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y ( m e c c ) r e s p e c t i v e l y s ot h em e t h o do fd e t e c t i n gt h ea c t i v i t yo f a c e ip e p t i d e sb ym e c cw a se s t a b l i s h e da n dt h eo p t i m a ld e t e c t i n gc o n d i t i o n sw e r e f o l l o w i n g s ：s e p a r a t e - v o l t a g e ，2 8 k v ；i n j e c t p r e s s u r e ，o 5 p s i ；i n j e c t t i m e ，5 s ；t e m p e r a t u r e ， 2 5 c ；e l e c t r o d eb u f f e r ：5 0 m m o l l ( 1 s d s ) b o r a t eb u f f e rs o l u t i o n ，p h8 3 ；d e t e c t i n g w a v e l e n g t h ，2 2 8 n m o n ep r o t e i ne n z y m ew a sc h o s e na st h eb e s te n z y m ef r o mn i n ek i n d so fp r o t e i n e n z y m e sb ys e l e c t i n gt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh y d r o l y t ea se x p e r i m e n t a li n d e x a tt h e s a m et i m e ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o na l s oc a m eo u t ：t e m p e r a t u r e ，5 0 c ；q u a n t i t yo f e n z y m e ，4 ；c o n c e n t r a t i o no fg a r l i cr e s i d u e s ，8 ；p h ，8 d u r i n gt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ， t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh y d r o l y t ew a s8 5 9 8 t h eh y d r o l y t ew a sf i l t r a t e db yu l t r af i l t r a t i o n ，u s i n g10 km e m b r a n eo fm i l l i p o r e c o m p a n y t h eo p t i m a lo p e r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e c i d e db ys e l e c t i n gt e m p e r a t u r eo f h y d r o l y t ea n do p e r a t i o np r e s s u r e 硒e x p e r i m e n t a li n d e xa sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e ，4 0 - - 5 0 c ；o p e r a t i o np r e s s u r e ，0 0 9 m p a t h ei c s oo fu l t r a f i l t r a t ea c e ip e p t i d e sw a s 2 1 5 m g m l t h ea c e ip e p t i d e sf r o mg a r l i cr e s i d u e sh a dg o o ds t a b i l i t yi nh o te n v i r o n m e n t b u t t h e yc o u l dn o tk e e pt h e i ra c t i v i t yd u r i n ga c i dc o n d i t i o n s t h e i ra c t i v i t yc o u l db e k e p td u r i n gd e e p f r e e z ea n dt h e i rp hs h o u l db e8 3 f u r t h e r m o r e ，t h ea c e ip e p t i d e s c o u l d p r e v e n tf r o mt h ee f f e c to fp e p s i n ，s oi tm a y b ep o s s i b l et h a tp e p t i d e sa l s oh a dt h e e f f e c to fd e p r e s s i n gt h eh y p e r t e n s i o na f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o n k e yw o r d s ：g a r l i cr e s i d u e s ，a c e i p e p t i d e s ，m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y , r a t eo fi n h i b i t o r y , u l t r af i l t r a t i o n n 一 一 ， i i 江苏 大 学 硕 士 学位论 文 目录 第一章绪论m 1 1 1 高血压概述l 1 1 1 高血压的定义1 1 1 2 高血压的分类1 1 1 3 高血压的发病机理”2 1 1 4 高血压的治疗一2 1 2 血管紧张素转化酶与高血压3 1 2 1血管紧张素转化酶的概述3 1 2 2 血管紧张素转化酶在血压调节中的作用3 1 3生物活性肽的研究现状4 1 3 1肽的吸收机制5 1 3 2 生物活性肽的来源及其种类5 1 4a c e i 活性肽6 1 4 1 a c e i 活性肽的研究现状6 1 4 2a c e i 活性肽的作用机制9 1 4 3a c e i 活性肽的生产方法9 1 4 4a c e i 活性肽的分离与提纯1 0 1 4 5a c e i 活性肽的特点1 0 1 4 6a c e i 活性肽的研究开发前景l o 1 5 大蒜的开发利用现状1 1 1 5 1 大蒜1l 1 5 2 蒜渣”1 2 1 6 立题依据及其意义一1 2 1 6 1立题依据1 2 1 6 2 研究意义13 1 6 3 研究内容13 本章参考文献1 4 第二章血管紧张素转化酶的制备及其活性检测1 6 2 1 引言16 2 2 血管紧张素转化酶( a c e ) 的制备1 7 2 2 1材料与仪器17 2 2 2a c e 的提取试验l7 江 苏大 学 硕 士 学位论 文 2 3a c e 体外活性检测方法的建立1 8 2 3 1检测原理l8 2 3 2 材料与仪器l8 2 3 3 检测方法1 9 2 3 4a c e 的比活性计算”1 9 2 4 结果与讨论2 0 2 4 1马尿酸和三肽h h l 的特征吸收波长2 0 2 4 2m e c c 条件的确立2 0 2 4 3 马尿酸浓度与峰面积的关系21 2 4 4m e c c 检测猪肺提取物中a c e 的活性2 2 2 4 5r p h p l c 检测猪肺提取物中a c e 的活性2 3 2 4 6 两种检测方法的比较2 4 2 4 7a c e 检测方法的可行性评价2 4 2 5 本章小结2 5 本章参考文献2 6 第三章酶法制备大蒜a c e i 活性肽的试验研究2 7 3 1 前言2 7 3 2 试验材料与仪器2 7 3 2 1材料2 7 3 2 2 仪器2 8 3 3试验方法2 8 3 3 1反应条件2 8 3 3 2a c e i 活性的测定“2 9 3 3 3蛋白质含量的测定3 0 3 3 4 水解度的测定3 0 3 4 结果与讨论3 0 3 4 1 大蒜残渣中蛋白成分的分析3 0 3 4 2 单一酶水解物对a c e 的抑制效果3l 3 4 3复合酶水解物对a c e 的抑制效果3l 3 4 4 酶1 作用条件的优化及水解参数的建立3 2 3 5 本章小结3 6 本章参考文献3 7 第四章大蒜a c e i 活性肽的超滤分离3 8 4 1 引言3 8 4 2 材料与方法一3 9 江 苏大 学 硕 士 学位论文 4 2 1 试验材料3 9 4 2 2 试验仪器3 9 4 2 3 试验方法3 9 4 3 试验结果与讨论4 1 4 3 1 膜的选择4 1 4 3 2 超滤条件的优化4 2 4 3 3 a c e i 活性肽的i c s o 的测定4 4 4 4 本章小结4 4 本章参考文献4 5 第五章大蒜a c e i 活性肽功能特性的研究4 6 5 1 引言4 6 5 2 材料与方法”4 6 5 2 1试验材料4 6 5 2 2 试验仪器4 6 5 2 3 试验方法4 6 5 3 结果与讨论4 7 5 3 1 加热温度对大蒜残渣a c e i 活性肽活性的影响4 7 5 3 2 p h 对超滤液活性和影响4 8 5 3 3 大蒜残渣a c e i 活性肽对肠胃蛋白酶耐性的研究4 9 5 4 本章小结5 0 本章参考文献”5l 第六章全文工作总结及展望5 2 6 1全文主要结论i ”5 2 6 2 存在的问题”5 3 j 致谢一”“”“”5 4 在读期间发表的论文”5 5 i 气一 江苏 大学硕 士 学位论 文 1 1 高血压概述 1 1 1 高血压的定义【l 】 第一章绪论帚一早珀t 匕 高血压( h y p e r t e n s i o n ) 是一种临床常见的以体循环压力升高为主的综合症。 它是最常见疾病之一，不仅患病率高，而且可引起严重的心、脑、肾并发症，是 脑卒中及9 0 冠心病的主要危险因素。 心血管疾病的病死率及危险性随着血压水平的升高而逐渐增加，但临床上很 难在正常和高血压之间划一明确界线。1 9 9 9 年，世界卫生组织和国际高血压学 会( w h o i s h ) 参考美国第6 次全国联合委员会( j n c v i ) 定义和分类，规定 高血压的低限为1 8 6 1 2 k p a ( 1 4 0 9 0 m m h g ) 。将高血压定义为：未接受抗高血压 药物者其收缩压( s b p ) 1 8 6 k p a ( 1 4 0 m m h g ) ，和( 或) 舒张压( d b p ) _ 1 2 k p a ( 9 0 m m h g ) 。 1 1 2 高血压的分类 ( 1 ) 按病人的血压水平分类：我国1 9 9 9 年高血压诊断标准及分类，基本上 采用1 9 9 9 w h o i s h 高血压治疗指南的分类标准，具体见表1 1 。 表1 1高血压诊断标准及分类1 2 i 耋型堕笪堡! 巴竺坚曼!堑鲞垦! 受翌坚曼! 理想血压120 酶4 酶5 酶6 酶3 酶 7 酶8 酶2 。由此可以筛选出能制备活性较高的a c e i 活性肽的酶，这也是酶 法制备a c e i 活性肽的关键。 x 褂 螗 霖 051 0 1 5 2 0 2 53 0 水解时间( m i n ) 图3 - 2 不同酶的水解产物对a c e 的抑制效果 3 4 3 复合酶水解物对a c e 的抑制效果 以抑制率为试验控制指标，单一酶水解的试验得出各种酶的优劣顺序，在此 基础上选出前四种能使水解物对a c e 有较好抑制效果的酶，即酶l 、酶9 、酶4 和酶5 ，对其进行两两组合，水解温度和p h 分别为所选酶的最适温度和p h ，其 加幻m 0 江苏大 学 硕 士 学位论 文 它水解条件为：底物浓度为8 、e s 为2 、水解时间3 h 。试验安排及其试验 数据见表3 2 。 表3 2 复合酶的水解产物对a c e 的抑制效果 复合酶的种类 抑制率( ) 酶l + 酶9 酶l + 酶5 酶l + 酶4 酶9 + 酶4 酶9 + 酶5 6 6 8 9 7 3 9 9 7 5 8 7 8 5 4 3 7 8 8 5 从表3 2 中可以看出，复合酶的效果并不比单一酶的效果好，复合酶水解物 与酶1 单一酶水解物相比，抑制率还有所下降。这可能是由于蛋白质中的一些敏 感键首先受到酶的攻击而降解，当加入第二种酶后可能妨碍了a c e 抑制肽的生 成或恰恰破坏了某些a c e 抑制肽所需的序列，从而导致a c e 抑制肽的活性降低。 因此，从成本和抑制效果来考虑，均以酶1 为最佳水解酶。 3 4 4 酶1 作用条件的优化及水解参数的建立 在单一酶和复合酶的试验基础上，最终确定酶l 为最佳水解酶。因此对 其作用条件进行优化，并建立其最优水解参数。 3 4 4 1 单因素试验 ( 1 ) 底物浓度对水解产物的抑制率的影响 水解条件为：p h 8 、t 5 0 、e s = 2 、水解时间为3 小时。底物浓度分别取 2 、4 、6 、8 和1 0 。其试验结果见图3 3 。 ，一、 x v 氍 = ， 培 晕 05l o 底物浓度( ) 图3 - 3 底物浓度对抑制率的影响 们 加 o 江苏大 学硕 士 学 位论文 从图3 3 可以看出，在溶液p h 值、温度、加酶量和反应时间相同的情况下， 底物浓度对水解液的抑制率有一定的影响，当底物浓度为5 6 时，水解液对 a c e 的抑制率最高，因此选定底物浓度为4 、6 、8 为其三个水平。 ( 2 ) 加酶量( e s ) 对水解产物的抑制率的影响 水解条件为：p h 8 、t 5 0 、底物浓度为8 、水解时间为3 小时。加酶量分 别取1 、2 、4 、6 和8 。其试验结果见图3 - 4 。 1 0 0 9 0 浆 8 0 龉 秦7 0 嚣 6 0 5 0 024681 0 加酶量( ) 图3 - 4 加酶置对抑制率的影响 从图3 4 可以看出，在溶液p h 值、温度、底物浓度和反应时间相同的情况 下，加酶量对水解液的抑制率也有影响，但是变化不大。加酶量为5 时，抑制 率最高，因此选定加酶量4 、5 、6 为其三个水平。 3 4 4 2 正交试验 ( 1 ) 正交试验设计 依据酶l 的作用条件，并且在单因素试验的基础上，设定水解时间为3 小时， 选择加酶量、底物浓度、反应温度和p h 值为试验因子，以水解液对a c e 的抑制 率为指标，采用四因素三水平正交表进行正交试验优化，试验方案如表3 3 所示。 表3 - 3 正交试验因素水平设计表l 9 ( 3 ) 4 因素 abc d 承乎 温度( t )酶量( e s ) 底物浓度( e ) p h l 5 064 7 24 0 56 9 36 0 48 8 ( 2 ) 试验数据及分析 1 ) 试验数据 f 交试验的反应条件和试验数据见表3 - 4 。 江苏大 学 硕 士 学位论 文 2 ) 试验结果分析 由表3 4 可看出，在影响a c e 抑制活性的四个因素中，按极差大小其主次 顺序为c a b d ，即底物浓度对抑制率的影响最大，温度和加酶量影响次之， p h 值的影响最小。以抑制率为指标可知，最佳反应条件为：a i b 3 c 3 d 3 ，即反应 温度5 0 c 、酶量4 、底物浓度8 、p h 8 。 表3 - 4 正交试验数据 试因素试验指标 验号 abcd 抑制率( ) l5 0 6478 5 3 25 05698 5 4 5 35 04888 5 9 8 4 4 0 6688 4 6 6 54 05878 5 4 2 64 04498 0 9 7 76 06898 4 1 3 86 05488 2 4 4 9 6 04678 3 4 8 k i 2 5 6 7 32 5 4 0 92 4 8 7l2 5 4 2 k 2 2 51 0 52 5 3 3l2 5 3 5 92 5 0 5 5 k 3 2 5 0 0 52 5 0 4 32 5 5 5 32 5 3 0 8 k i 8 5 5 7 78 4 6 9 78 2 9 0 38 4 7 3 3 k 2 8 3 6 8 38 4 4 3 78 4 5 38 3 5l7 k 3 8 3 3 58 3 4 7 78 5 17 78 4 3 6 r2 2 21 2 22 2 71 2 1 6 3 ) 验证试验 为了验证由正交试验所得的最优反应条件是否最优，本实验在反应温度 5 0 c 、酶量4 、底物浓度8 、p h 8 的条件下，重复了3 组试验，其试验结果 见表3 5 。 表3 5 验证试验数据 由表3 5 可知，3 组验证试验的平均值与正交试验的数据基本相近，达到了 较高的试验指标，因此，可以断定，由j 下交试验确定出的最优工艺条件可以达到 一3 4 江苏大 学 硕 士 学位论文 试验要求，而且其最优组合条件是可行的。 3 4 4 3 抑制率和水解度随时间的变化 反应条件为：反应温度5 0 c 、酶量4 、底物浓度8 、p h 8 。分别在1 0 m i n 、 2 0 m i n 、3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 、6 0 m i n 、9 0 m i n 、1 2 0 m i n 、18 0 m i n 、2 4 0 m i n 和3 0 0 m i n 时取样。测得不同时间的水解物的水解度和对a c e 的抑制率，具体试验结果见 图3 5 和图3 - 6 。 x 瓣 荟 最 2 5 2 0 x1 5 刨 鐾1 0 * 5 o 01 0 02 0 03 0 04 0 0 水解时间( m i n ) 图3 - 5 抑制率随时间的变化 o 4 0 0 水解时i 司( m i n ) 图3 - 6 水解度随时间的变化 由图3 5 可知，水解物对a c e 的抑制率并不是随着时间的延长而增加。当 水解到4 0 m i n 时，抑制率达到最高，而当水解超过4 0 m i n 后，抑制率有所降低， 但下降的幅度不大，只是很平稳的下降。由图3 - 6 可知，水解度是随着时白j 的延 长而逐渐增大的，从水解开始到水解5 0 r a i n 时，水解度迅速增加，随后便缓缓地 加如；加m 0 江 苏 大 学 硕 士 学位论 文 增加。通过图3 5 和图3 - 6 可以看出，抑制率和水解度随时间的变化趋势并不是 一致的。这可能是由于随着时间的延长，酶1 对蒜渣中蛋白的酶解作用的增强， 而使开始具有活性的a c e i 活性肽进一步降解，形成更小的分子、失活片断或游 离氨基酸，从而使水解液的抑制率降低，相反水解度却因此继续增加。 因此可以根据水解度的大小来控制水解时间，使水解产物在达到最大抑制率 的时间后，调整p h 值或升高温度使得酶l 失活，从而使水解产物具有最大的抑 制率。 3 5本章小结 ( 1 ) 选用9 种不同的商业用酶分别对大蒜残渣粉的水溶液进行单一酶解试 验，以水解液的抑制率为指标，结果表明酶1 作用后的水解液抑制率较高且较稳 定。 ( 2 ) 从单一酶解试验中筛选出前四种蛋白酶，两两组合进行复合酶试验， 结果表明复合酶水解液的抑制率并不比单一酶水解液的抑制率高，有时反而有所 下降。因此确定酶l 为生产a c e i 活性肽的最佳蛋白酶。 ( 3 ) 试验以水解液的抑制率为试验控制指标，对底物浓度和加酶量( e s ) 这两个控制因素，分别进行了单因素试验，得出了各因素的影响趋势。 ( 4 ) 试验选取底物浓度、加酶量( e s ) 、水解温度、p h 值四个因素为试验 控制参数，以水解液的抑制率为试验控制指标，进行正交试验和验证试验，得出 酶l 的最优作用条件：反应温度为5 0 c 、酶量4 、底物浓度8 、p h 8 。 ( 4 ) 对水解液的抑制率和水解度随时间的变化进行了试验，结果表明水解 4 0 m i n 时水解液的抑制率最高，因此可以通过控制水解度来生产活性较高的 a c e i 活性肽，为工业化生产打下基础。 ， 江 苏 大 学 硕 士 学 位论文 【1 9 【2 0 【2 1 本章参考文献 c u s h m a n ，d w ：，e ta 1 ，b i o c h e m i s t r y , l9 7 0 ，9 ：2 5 8 3 - 2 5 8 7 熊长青中国医药情报1 9 9 6 ，2 ( 4 ) ：2 4 0 2 4 5 f e r r e i r a ，s h ，e ta 1 ，b r i t j p h a r m a c 0 1 ，1 9 6 5 ，2 4 ：1 6 3 1 6 9 b a k h l e ，y s n a t u r e ，19 6 8 ，2 2 0 ：919 - 9 2 0 n g ，k k f ，a n dv a n e ，j r n a t u r e ( l o n d o n ) ，1 9 7 0 ，2 2 5 ：11 4 2 - l1 4 4 k a t o h ，b i o c h e m i s t r y , 1 9 7 1 ，1 0 ：9 7 2 - 9 8 0 m a r u y a m a s ，a g r i c b i 0 1 c h e m ，1 9 8 9 ，5 3 ( 1 0 ) ：2 7 6 3 2 7 6 7 n a k a m u r a ye ta 1 ，j d a i r ys c i ，1 9 9 5 ，7 8 ：1 2 5 3 - 1 2 5 7 g o s h i m ae ta 1 ，b i o c h e m i c a le tb i o p h y s i c a la c t a , 1 9 7 9 ，5 6 6 ：1 2 8 1 3 7 m a r u y a m ae ta 1 ，a g r i c b i 0 1 c h e m ，1 9 8 2 ，4 6 ( 5 ) ：1 3 9 3 1 3 9 4 m a r u y a m ae ta 1 ，a g r i c b i o i c h e m ，1 9 8 7 ，51 ( 9 ) ：2 5 5 7 2 5 6 1 k o n m u r a ，me ta 1 ，a g r i c b i 0 1 c h e m ，l9 8 9 ，5 3 ( 8 ) ：210 7 2114 m i y o s h i ，se ta 1 ，a g r i c b i 0 1 c h e m ，1 9 9 1 ，5 5 ( 3 ) ：1 3 1 8 1 3 1 9 m i y o s h i ，se ta 1 ，a g r i c b i 0 1 c h e m ，19 91 。5 5 ( 5 ) ：14 0 7 14 0 8 y o k o y a m a , ke ta 1 ，b i o s c ib i o t e c hb i o c h e m ，1 9 9 2 ，5 6 ( 1 0 ) ：1 5 4 1 1 5 4 5 k s u g i y a m ie ta 1 ，n i p p o nn o g e i k a g a k uk a i s h i ，1 9 9 1 ，6 5 ：1 5 4 1 - 1 5 4 5 曹文红，章超桦食品蛋白降血压肽及其酶法制备( 二) 食品科技，2 0 0 2 ，( 5 ) ：1 1 1 3 a l d e r - n i s s e nj d e t e r m i n a t i o no ft h ed e g r e eo fh y d r o l y s i so ff o o dp r o t e i nh y d r o l y s a t e sb y t r i n i t r o b e n z e n e s u l f o n i ca c i d 【j 】j a g r i cf o o dc h e m ，19 7 9 ，2 7 ：12 5 6 - 12 6 2 郭兴风蛋白质水解度的测定中国油脂，2 0 0 0 ，2 5 ( 6 ) ：1 7 6 1 7 7 宁正祥主编食品成分分析手册北京：中国轻工业出版社，1 9 9 8 ：l1 9 1 2 4 a l d e r - n i s s e nj e n z y m a t i ch y d r o l y s i so ff o o dp r o t e i n 【m 】e l s e v i e ra p p l i e ds c i e n c e p u b l i s h e r s l o n d o n 1 9 8 6 ：1 2 1 4 3 7 一 ，u刁习们习q刀引 n口口h陋p隅p：n n n n = i u = 江 苏 大 学 硕 士 学位论 文 第四章大蒜a c e i 活性肽的超滤分离 4 1引言 上一章的研究已经通过酶解的方法，从大蒜残渣中制备出了具有一定活性的 a c e i 活性肽，虽然也可以作为功能性食品，但仍然含有许多大分子杂质，因此必 需对其进行超滤分离纯化，以获得活性更强的a c e i 活性肽。大蒜残渣水解后所得 的水解物是含有蛋白质、肽、游离氨基酸和糖等的混合物，多种成分的存在大大 影响大蒜残渣a c e i 活性肽总体对a c e 的抑制活性，因此须除去混合物中无a c e 抑 制活性和低活性的物质，以提高大蒜残渣a c e i 活性肽的抑制活性。据文献报道， 大多数a c e i 活性肽分子量都在1 5 0 0 d a 以下【i - 3 】，且多是由1 0 个以下氨基酸残基组 成的小肽，因此可用超滤法将水解物的分子量控制在1 5 0 0 d a 以下，同时也可除去 未水解物中的蛋白质分子与低活性的多肽。超滤法根据滤膜孔径的大小实现对样 品按分子量大小和形状进行分离。目前按照截流分子量的大小，超滤可分离3 0 0 - - - , 1 0 0 0 k d a 的可溶性生物大分子物质，常用于样品的分级分离和浓缩、脱盐，当目标 分子与杂质之间分子量相差1 0 倍以上时，方能达到较好的分离效果【4 引。为了防止 超滤时产生吸附降低膜通透量，常选用不易吸附的膜醋酸纤维膜【6 j 。 超滤( u l t r af i l t r a t i o n ，缩写为u f ) 是膜分离技术的一种，它是根据高分子 溶质之间或高分子与小分子溶质之间分子量的差别进行分离的方法【7 j 。在膜分离 过程中有以下优点： ( 1 ) 膜分离过程不发生相变化，因此膜分离技术是一种节能技术； ( 2 ) 膜分离过程是在压力驱动下，在常温下进行的分离过程，特别适合于 对热敏感的物质，如酶、果汁、某些药品等的分离、浓缩、精制等； ( 3 ) 膜分离技术适用分离的范围极广，从微粒级到微生物菌体，甚至离子 级等都有它的用武之地，其关键在于选择不同的膜类型： ( 4 ) 膜分离技术由于只是以压力差作为驱动力，因此，该项技术所采用的 装置简单，操作方便【8 j 。因此，超滤技术越来越多地被用于食品和生物活性物质 的生产中。 超滤是一种压力驱动的膜分离过程。超滤的工作过程见图4 1 所示。带有a 和b 两种溶质颗粒的原水进入设备的流道，流道的一侧为滤膜，膜孔大于b 的 颗粒粒径，但小于a 的粒径。膜的两侧施加了压力差z 1 p ，设备的出水有超滤水 和浓水两种流量。颗粒a 被截留，从浓水中出来，颗粒b 则通过滤膜从超滤水 中流出【9 1 。 江 苏 大 学 硕 士 学 位论文 超澹腰 4 2 材料与方法 4 2 1 试验材料 图4 - 1 妇澹过程示意图 埘( 浓水) 专b 趋溏水 p e l l i c o n 系列改良纤维素膜( m i l l i p o r e 公司) ，膜性能参数如表4 1 所示； 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) ，f l u k a 公司；其余试剂均为国产化学纯。 表4 1 试验用膜性质 4 2 2 试验仪器 c o u l t e rp a c e t m 毛细管电泳仪，b e c k m a n 公司； p e l l i c o n 小型超滤系统，美国m i l l i p o r e 公司： d z f 6 0 0 0 型真空干燥箱，上海益恒实验仪器有限公司； r e 5 2 a 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂； s h b h i 型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司： h h 型恒温水浴锅，江苏金坛市中大仪器厂： 1 0 1 a s 一2 型不锈钢数显电热鼓风干燥箱，上海浦东跃欣科学仪器厂； 予华牌k q l b 型玻璃仪器烘干器，河南巩义市英峪予华仪器厂； l d 5 - 2 a 型离心机，北京医用离心机厂： c f b 高速万能粉碎机，北京市长风仪器仪表公司： 7 9 3 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂。 4 2 3 试验方法 4 2 3 1 a c e i 活性肽的生产工艺流程 大蒜残渣中a c e i 活性肽的初步生产工艺流程图如图4 2 所示。 江 苏大 学 硕 士 学位 论文 图4 - 2a c e i 活性肽初步生产工艺流程 4 2 3 2 超滤的操作 超滤装置示意图如图4 3 所示，具体的操作步骤如下： 司调运泵 图4 - 3 超滤装置示意图 ( 1 ) 首先必需对超滤膜进行冲洗。在清洗罐中加入1 0 l4 0 5 0 c 的蒸馏水， 将泵的流速调到6 0 l r a i n ，冲洗一到两分钟。 ( 2 ) 然后将物料放入清洗罐中，按照要求调节变速泵的流速。 ( 3 ) 使用完超滤膜之后，先要进行清洗。选择o 1 - - 0 5 n 的n a o h 溶液作为 清洗剂，将泵的流速调到6 0l r a i n ，循环清洗3 0 r a i n 。然后在重复( 1 ) 的冲洗 步骤。 ( 4 ) 最后进行消毒步骤。采用浓度为