（农产品加工及贮藏工程专业论文）在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究.pdf

在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 于两要 考察取白青岛啤酒公司的大麦芽淀粉酶活性与糖化产物，发现不同品种的麦 芽其淀粉酶系组成、糖化产物组成均不同。为研究淀粉酶系对糖化产物的影响， 首先考察q 一淀粉酶、1 3 一淀粉酶对淀粉的酶解作用，及两种淀粉酶在对淀粉的 降解过程中的关系，发现q 一淀粉酶与1 3 一淀粉酶比例在适当范围内的增减对淀 粉酶解过程可以起到相互弥补作用。进一步考察a 一淀粉酶、1 3 一淀粉酶、极限 糊精酶淀粉酶系对淀粉的降解作用，发现对于一定比例的q 一淀粉酶、1 3 一淀粉 酶组合，添加极限糊精酶能显著增加可发酵性糖生成。 研究大麦中蛋白酶、巯基蛋白酶在发芽过程中的分泌规律，以及发芽过程中 添加金属离子时蛋白酶、巯基蛋白酶的分泌规律。同时，对大麦发芽以及麦芽焙 焦过程中极限糊精酶分泌规律进行研究，结合自由态极限糊精酶从结合态释放的 两种假设，对离体状态下极限糊精酶酶学性质进行研究。发现发芽过程中蛋白酶 产生周期较长；而巯基蛋白酶产生和变化较大。极限糊精酶在发芽4 6 天以结合 态极限糊精酶为主；后期自由态极限糊精酶增加，发芽至9 天时，自由态极限糊 精酶占总的极限糊精酶的7 0 之多。发芽5 天的绿麦芽经焙焦处理后得到的成品 麦芽与5 天发芽的绿麦芽相比，自由态在总极限糊精酶中所占比率从发芽5 天的 绿麦芽的3 2 8 降低到焙焦麦芽的2 0 9 ；而结合态在总极限糊精酶中所占比率 从发芽5 天的绿麦芽的6 7 2 增加到焙焦麦芽的7 8 9 。自由态的极限糊精酶耐 热性不如结合态的极限糊精酶。提取极限糊精酶时在缓冲液中加还原剂l c y s 引起的自由态极限糊精酶活性增加，是由于l - c y s 激活了麦芽中的巯基蛋白酶， 巯基蛋白酶通过蛋白修饰将结合态的极限糊精酶释放，引起自由态极限糊精酶的 增多，证明了利用巯基蛋白酶调控实现提高极限糊精酶活性的可能性。 为了获得高纯度、高比活的极限糊精酶抑制因子产品，我们以麦芽粉为原料， 用醋酸钠缓冲液浸提液进行分离纯化。利用c m 纤维离子交换柱层析和凝胶过滤 层析对极限糊精酶抑制因子进行分离提纯，用极限糊精酶经极限糊精酶抑制因子 作用后所测出的极限糊精酶活力的减少的量，表示极限糊精酶抑制因子的活力 值。最终纯化倍数和活力回收率分别为6 9 7 和5 7 9 。 关键词：糖化，极限糊精酶，极限糊精酶抑制因子，分离纯化，酶调控 i v s t u d yo n fm p r o vin glii l litd e x trin a s ea c tivit y int h es a c c h arif yin gc o u rs e a b s t r a c t i n v e s t i g a t i n gt h ea m o u n t so ff r e e ，b o u n d ，a n dt o t a ll i m i td e x t r i n a s ei nm a l t e d b a r l e yf r o mq i n g d a ob e e rl i m i t e dc o m p a n yw e r es t u d i e d i ti sf o u n dt h a td i f f e r e n t m a l t sh a v ed i f f e r e n tk i n d so fa m y l a s e sa n da l s oh a v ed i f f e r e n ts a c c h a r i f y i n gp r o d u c t s c o m p o n e n t s e x p e r i m e n t a ld e s i g nf o rt w oe n z y m e ( a l p h a a m y l a s e ，b e t a - a m y l a s e ) s t a r c hm a s h e sc o n c l u d e st h a tf o rg i v e nl e v e lo ff e r m e n t a b l es u g a r , d e c r e a s i n gt h e a c t i v i t yo fo n ea m y l a s ee n z y m ec o u l db ec o m p e n s a t e df o rb yi n c r e a s i n gt h ea c t i v i t y o ft h eo t h e r e x p e r i m e n t a ld e s i g nf o rt h r e ee n z y m e ( a l p h a - a m y l a s e ，b e t a - a m y l a s e ， l i m i td e x t r i n a s e ) s t a r c hm a s h e sc o n c l u d e st h a ta d d i t i o no fl i m i td e x t r i n a s et ot h e m a s h e sr e s u l t e di nas u b s t a n t i a li n c r e a s ei nl e v e l so ff e r m e n t a b l es u g a r s a m o u n t so fp r o t e i n a s e ，s u l f h y d r y l p r o t e i n a s ei nm a l t e db a r l e ya n dm a l t e d b a r l e ya d d i n gm e t a li o n sw e r es t u d i e d t h es e c r e t i o nr u l eo fl i m i td e x t r i n a s ed u r i n g t h eg e r m i n a t i n ga n dk i l n i n gc o u r s ew e r es t u d i e d ，c o m b i n gw i t ht w oh y p o t h e s e sf o r t h er e l e a s eo ff r e el i m i td e x t r i n a s ef r o mab o u n df o r m ，w ec a r r i e do u tr e s e a r c ho nt h e t h ee n z y m a t i c p r o p e r t i e so fl i m i td e x t r i n a s ei nv i t r o w ec o n c l u d et h a tt h ep r o d u c i n g a n dr e d u c i n g c y c l eo fp r o t e i n a s ei s s h o r ta n d s u l f h y d r y lp r o t e i n a s e h a sg o o d p r o d u c i n ga n dr e d u c i n gr a t e d u r i n ge a r l ys t a g eo fg e r m i n a t i n gf r e el i m i td e x t r i n a s ei s i nt h em a j o r i t y , a n dd u r i n gl a t e rs t a g eo fg e r m i n a t i n gb o u n dl i m i td e x t r i n a s ei si nt h e m a jo r i t y , e v e ni n c r e a s e st o7 0 o f t o t a ll i m i td e x t r i n a s ef o r9 d f r e el i m i td e x t r i n a s e s p r o p o r t i o ni nt o t a ll i m i td e x t r i n a s ea f t e rk i l n i n gd e c r e a s et o2 0 9 w h i l ei nm a l t e d b a r l e yf o r5 d3 2 8 ；b o u n dl i m i td e x t r i n a s e sp r o p o r t i o ni nt o t a ll i m i td e x t r i n a s ea f t e r k i l n i n gi n c r e a s et o7 8 9 w h i l ei nm a l t e db a r l e yf o r5 d6 7 2 h e a tr e s i s t a n c eo fb o u n dl i m i td e x t r i n a s ei ss t r o n g e rt h a nf r e el i m i td e x t r i n a s e s l i m i td e x t r i n a s ei sn o tas u l f h y d r y le n z y m e l - c y ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h e a c t i v i t yo fl i m i td e x t r i n a s ei ne x t r a c t s ，b e c a u s el - c y sa c t i v a t e ds u l f h y d r y le n z y m e ， a n dt h eb o u n dl i m i td e x t r i n a s er e l e a s ei sm e d i a t e db ys u l t h y d r y l t h e s er e s u l t s s t r o n g l ys u g g e s tt h a tt h ep o s s i b i l i t yo fp r o t e o l y t i ce n z y m e sr e g u l a t i o nt oi m p r o v e v i l i m i td e x t r i n a s ea c t i v i t yi nt h es a c c h a r i f y i n gc o u r s e t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n i q u e so fl i m i td e x t r i n a s ei n h i b i t o rf r o ma c r u d eb a r l e ye x t r a c tw i t hs o d i u ma c e t a t eb u f f e rw e r ee x p l o r e di nt h ep r e s e n tw o r kt o o b t a i nh i g hp u r el i m i td e x t r i n a s ei n h i b i t o r t h eo p t i m i z e dp u r i f i c a t i o np r o c e s s i n c l u d e st h ef o l l o w i n gs t e p s ：8 0 。ch e a tt r e a t m e n to ft h eg r i s te x t r a c t ，c m 5 2c e l l u l o s e i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h ea c t i v i t yo fl i m i t d e x t r i n a s ei n h i b i t o rw a sm e a s u r e db yl i m i td e x t r i n a s ea c t i v i t yr e d u c t i o ni n h i b i t e db y l i m i td e x t r i n a s ei n h i b i t o r t h ep u r i f i c a t i o nf a c t o ra n da c t i v i t yr e c o v e r yo fl i m i t d e x t r i n a s ei n h i b i t o rw a s6 9 7a n d5 7 9 ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：s a c c h a r i f y i n g ；l i m i td e x t r i n a s e ；l i m i td e x t r i n a s ei n h i b i t o r ； p u ri f i c a t i o n | e n z y m e sr e g u i a t i o n v i i 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( ) 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期： 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签字： 签字日期；年月日签字日期： 学位论文作者毕业后去向； 工作单位： 通讯地址； v 电话： 邮编： 叫月乍年 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 1 前言 在啤酒酿造过程中，麦芽糖化是啤酒生产过程中一个重要的阶段。利用麦芽 中q 一淀粉酶、b 一淀粉酶和极限糊精酶组成酶系的协同作用，可大幅度提高淀 粉水解速率，减少支链糊精残存量，提高淀粉的糖化率。将麦芽及其辅料中的淀 粉，逐步酶解为可溶性的低分子物质以及可发酵性糖( 主要是麦芽糖、葡萄糖以 及部分麦芽三糖) 【1 1 。这些可发酵性糖最终被啤酒酵母发酵为酒精。 1 1 啤酒大麦中主要淀粉水解酶类研究概述 1 1 1 q 一淀粉酶 1 1 1 1 a 一淀粉酶的作用机理 a 一淀粉酶( q a m y l a s e ，e c 3 2 1 i ) 的全称为- i ，4 - 0 一葡聚糖水解酶，也 被称为内切淀粉酶，是淀粉水解的起始酶，可随机降解直链淀粉和支链淀粉分子 内部的q 一1 ，4 一糖苷键，对q l ，4 糖苷键连接的大于3 个葡萄糖单位的葡聚糖 均能水解；它作用于直链淀粉的产物是麦芽糖、葡萄糖和少量麦芽三糖，作用于 支链淀粉的产物是q 一极限糊精、麦芽糖和葡萄糖。作用淀粉时以随机的方式从 分子内部切开q l ，4 一糖菅键生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基碳 原子构型为q 一构型，故称q 一淀粉酶，q 一淀粉酶不能切开支链淀粉分支点的 c i 一1 ，6 糖苷键，也不能切开a - l ，6 糖苷键附近的c i - i ，4 糖苷键，水解产物中除 了葡萄糖和还原糖外，还有残留q - l ，6 糖苷键的极限糊精和含四个以上葡萄糖 残基的低聚糖。a 一淀粉酶较耐热而不耐酸，在p h 3 6 以下钝化。 1 1 1 2q 一淀粉酶测定方法【2 】 所有淀粉酶测定方法共同之处是将测定标本与一种淀粉溶液保温反应。现行 的测定方法大致可以分成四种： ( 1 ) 比浊法 将淀粉配成吸光度为1 0 的溶液，被a 一淀粉酶作用后，其浊度降低与酶活 性相关。此法包括透射比浊与散射比浊，可以用动力学法或固定时间法进行测定。 其特点为：底物不稳定，难以标准化，精确性亦较差。 ( 2 ) 染料释放法 结合染料的多糖受到q 一淀粉酶的作用后，结合的染料释放到溶液中，颜色 与酶活性大小相关。此类方法又可分为两类，一类是染料结合到不溶性多糖上， 1 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 这类方法如“蓝色淀粉法”，“红色淀粉法”等，一般都需作空白对照，离心分 离不溶物等操作，所以不能自动化。另外，淀粉来源不同或是与染料结合的工艺 不同，对测定结果的较大影响，难以标准化。另一类是染料与可溶性限定性底物 结合，这一类方法近年来有不断的发展，最近已有比较符合理想要求的方法出现， 尤其用于临床上q 一淀粉酶的检测。但成本较高。 ( 3 ) 碘量法 碘与淀粉能产生亮蓝色化合物，且其吸收峰波长不同于淀粉水解后副产物与 碘形成的有色物，标本与淀粉底物保温后，加入碘液显色，q 一淀粉酶活性大小 与颜色深浅成反比。该方法已有较长历史，目前还在很多实验室使用。目前常用 的碘比色法，是一种固定时间比色法，定时保温后加碘显色，根据测定管与对照 管的吸光度差值计算酶活性。其特点为：不适合自动化分析，底物难以标准化， 淀粉底物的浓度不能使酶饱和，故反应不呈零级反应。 ( 4 ) 荧光法 以荧光素标记直链淀粉，经酶作用后水解成小片段，底物与产物的荧光强度 不同，从而反映出酶活性的大小。此法需要特殊仪器，不实用。 1 1 1 3 旷淀粉酶的来源及用途 q 一淀粉酶广泛存在于植物、动物和微生物中。发芽的谷物如水稻、大麦和 小麦等q 一淀粉酶含量较高，发芽能促进了谷物c l 一淀粉酶的迅速产生。另外在 人和动物的唾液、胰腺中q 一淀粉酶含量也非常高。而微生物发酵法是目前工业 生产上大规模生产q 一淀粉酶的有效途径。在1 9 0 8 年和1 9 1 7 年德国的b o i d i n 和e f - f r o n t 就先后由细菌中生产出a 一淀粉酶，用于纺织品脱浆。能产生a 一 淀粉酶的微生物种类很多，如芽抱杆菌、枯草杆菌、黑曲菌、米曲霉等。 q 一淀粉酶用途十分广泛，是目前市场上产量最大的酶类之一。在淀粉加工 业、面包工业、发酵工业、饲料制造等行业中，q 一淀粉酶是食品、酿造、发酵、 制药及一切以淀粉为原料进行生产加工的酶制剂之一( 还应用于纺织工业的退浆 和石油开采等领域) 。q 一淀粉酶对淀粉的降解作用在于能产生链更短的低聚糖滑 合物，因此被广泛应用于淀粉糖的生产中。 1 1 2b 一淀粉酶 1 1 2 1 一淀粉酶的作用机理 2 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 b 一淀粉酶即( 1 4 ) 一d 一葡聚糖麦芽水解酶( e c 3 2 1 2 ) ，亦称糖化酶或葡 聚糖麦芽糖水解酶或淀粉一1 ，4 一麦芽糖苷酶，一种水解酶，作用是从非还原性末 端开始作用于q - 1 ，4 糖苷键，按两个葡萄糖单位降解直链淀粉，所以它也被称 为外切淀粉酶：它作用于直链淀粉释放的d 一麦芽糖在c 。位上有一个自由h 基， 为1 3 一构型。作用于支链淀粉时，只能水解外围碳链的q 一1 ，4 糖苷键，而不能 超越分支点的q - 1 ，6 糖苷键去水解分支点内侧的q - 1 ，4 糖苷键，因此它对支 链淀粉的水解是不完全的，当作用至q - 1 ，6 糖苷键时停止，生成极限糊精。该 酶作用于底物时，同时发生沃尔登转位反应，使产物由q 一型麦芽糖变为b 一型 麦芽糖。b 一淀粉酶较耐酸而不耐热，在7 0 保温1 5m i n 则丧失活力。 1 1 2 21 3 一淀粉酶测定方法【3 j 目前，测定植物种子1 3 一淀粉酶活性最常用的方法是根据q 1 3 一淀粉酶的酶 学特性采用选择性失活技术，并结合3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 来进行定量测 定淀粉酶降解产物还原糖的含量( 简称d n s 法) 。由于有时植物种子中a b 一淀 粉酶的生化特性差异并不十分明显，使得量一淀粉酶的活性测定受到严重的干扰。 如某些耐高温的b 一淀粉酶对于7 0 c 处理的敏感性较低；在大量q 一淀粉酶存在 时，低p h 处理对q 一淀粉酶也往往无效。另一方面，目前在动物和微生物研究 中已经建立了以对硝基苯酚麦芽五糖和对硝基苯酚麦芽六糖作为人工底物，以微 生物来源的q 一葡萄糖苷酶为辅助酶的b 一淀粉酶活性测定新方法，且开发了相 应的试剂盒。并开始运用于植物种子b 一淀粉酶活性的测定。不过，由于p n p g 5 和p n p g 6 均为人工合成底物，用量较大旦价格昂贵，因此在实际应用中存在着不 小的难度。所以应用较多的仍为d n s 法。 1 1 。2 。3b 一淀粉酶的来源及用途 1 3 一淀粉酶在大麦种子成熟期间合成和积累，在大麦萌发时没有进一步合成。 成熟的大麦籽粒中b 一淀粉酶有两种形式，即自由态和束缚态，后者占到总b 淀 粉酶的7 5 。大麦籽粒中的自由态和束缚态b 一淀粉酶占籽粒总蛋白质含量的 1 。自由态b 一淀粉酶可用水或盐溶液提取，而束缚形式的8 淀粉酶只能用还原 性试剂或木瓜蛋白酶溶液提取。束缚形式的1 3 淀粉酶出现比自由态b 淀粉酶 迟，主要在种子成熟后期形成。束缚形式的b 一淀粉酶在种子萌发过程中受糊粉 层细胞分泌的蛋白酶作用，转变为自由态后才显示活性。p o l l o c k 等发现，在发 3 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 芽期间，自由态1 3 淀粉酶增加，而束缚态1 3 淀粉酶减少，最后消失。 l a u r i e r e 等对成熟大麦籽粒1 3 淀粉酶的免疫定位分析表明，1 3 淀粉酶绝大 部分存在于胚乳中，它们位于不同大小的淀粉粒周围；在胚中，b 淀粉酶只存 在于盾片中；且胚中1 3 淀粉酶很少，不到胚乳的三千分之一。 b 淀粉酶广泛存在于高等植物中如大麦、小麦、大豆、甘薯、高粱等及微 生物中。许多高等植物含有丰富的1 3 淀粉酶，是食品与酿造行业的主要酶源。 大麦、小麦、大豆和甘薯等植物中b 淀粉酶的含量高，提取植物中的b 淀粉酶， 是国外已有工业化生产b 淀粉酶的主要来源之一。日本、美国、丹麦等国家对 植物1 3 淀粉酶的生产已经工业化，尤其是日本以大豆为原料生产1 3 淀粉酶已有 1 0 多年的历史；美国用小麦提取的1 3 淀粉酶制成固定化酶，广泛用于生产高麦 芽糖浆，麦芽糖酪以及啤酒等产品，取得理想效果。豆中主要的淀粉酶是b 淀 粉酶。日本用脱脂大豆废水生产b 淀粉酶应用于生产怡糖和啤酒。 植物1 3 一淀粉酶来源广，其酶活力较高，p h 作用范围广，所以目前在怡糖、 啤酒等工业中几乎都使用由植物中获得的b 淀粉酶。我国对植物b 淀粉酶的研 究主要以大麦芽作为1 3 淀粉酶源，每年需消耗大量粮食来生产1 3 淀粉酶制剂。 1 1 3 极限糊精酶 自1 9 4 3 年由m y r b a c k l 4 首先发现以来，极限糊精酶引起了许多研究人员的关 注。对极限糊精酶的首次报道是在2 0 世纪4 0 年代。k e e n ( 1 9 4 5 年) 报道了高粱 芽的提取物具有降解糊精的活性，后来( 1 9 4 8 年) 假设这种和q 一淀粉酶、1 3 一淀 粉酶有协同作用的酶的主要作用是打破q - 1 ，6 糖苷键。这种假设为后来的文献 所证实。根据国外研究者的描述，极限糊精酶是酿造工业中一个通用语，用于描 述把非发酵性多糖转变为可发酵性糖的那些酶，显然不止一种酶具有这种作用， 但当时还没有统一的说法极限糊精酶究竟指哪一种特定的酶。k n e e n 命名为极限 糊精酶。1 9 5 1 年，首次报道了植物脱支酶( r 一酶) 能够作用于支链淀粉，具有极 限糊精酶的活性，但对糖原不起作用。随后，m a n n e r s 等人也对此做了大量研究， 于1 9 7 0 年发现r 一酶和极限糊精酶实际上是同一种酶。 极限糊精酶( 支链淀粉6 葡聚糖水解酶) ，又称普鲁兰酶( 普鲁兰6 葡聚糖 水解酶) ，或q 糊精6 葡聚糖水解酶( e c 3 2 1 4 1 ) ，属于淀粉水解酶，对q - 1 ， 6 糖苷键有高度特异性，是一类能够专一性催化普鲁兰、支链淀粉和支链淀粉的 4 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 a 极限糊精、支链淀粉p 淀粉酶、糖原的b 极限糊精等分支点中的q - 1 ，6 糖 苷键水解的酶，但对高度分支的糖原不起作用。 1 1 3 1 极限糊精酶的作用机理及其特性 极限糊精酶( 1 i m i td e x t r i n a s e ) 主要有两类：一类是来源于植物【5 】，称为极限 糊精酶或r 酶，另一类来源于微生物，称为普鲁兰酶。 同q 淀粉酶、1 3 淀粉酶等水解酶不同，极限糊精酶的作用对象是q 一1 ，6 糖苷键，而且它要求敏感键( q 1 ，6 糖苷键) 的两侧至少各有一个q 一1 , 4 键连 接的d 葡萄糖残基【6 】o 极限糊精酶对q 1 , 6 糖苷键起专一性作用，但它不能直接 降解淀粉粒，只有当q 淀粉酶对淀粉粒作用后才起作用【7 j 。 极限糊精酶在淀粉降解中具有发挥着重要的作用【8 1 。通常，生物体内淀粉降 有两种途径：水解和磷酸解。而且，这两种途径都需要极限糊精酶参与，才能彻 底完成。在淀粉的水解途径中，需要q 淀粉酶、1 3 淀粉酶和极限糊精酶等的协 同作用。一般认为，q 淀粉酶是淀粉水解的起始酶，可随机降解直链淀粉和支 链淀粉非末端的q 1 , 4 糖苷键，它作用于直链淀粉的产物是葡萄糖、麦芽糖和麦 芽三糖，作用于支链淀粉的产物中除葡萄糖和麦芽糖外，还有一系列具有q 一1 , 6 糖苷键的低聚糖。b 淀粉酶也作用于q 1 , 4 糖苷键，它作用于直链淀粉的产物 是麦芽糖，而作用于支链淀粉时的水解是不完全的，当作用至q - 1 , 6 糖苷键时则 停止不前，而生成极限糊精。因此，q 淀粉酶、b 淀粉酶以及二者协同作用均 不能将淀粉彻底水解，这需要极限糊精酶的进一步作用。在极限糊精酶将支链淀 粉转变为直链形式后，可再被q 一淀粉酶、1 3 淀粉酶水解。在淀粉的磷酸解途径 中，同样需要极限糊精酶的作用才能将淀粉彻底降解。因此，极限糊精酶在淀粉 彻底降解过程中有非常重要的作用，是一种重要的淀粉降解酶。 s g o h o l m 和m a c r i 研究了焙焦和糖化条件下极限糊精酶的热稳定性。结果表 明，在焙焦过程中失活的酶只占总量的2 0 ，在糖化过程中当温度高于6 5 c 时 极限糊精酶开始失活，而且不同的大麦来源，其极限糊精酶对温度的敏感性不同 【9 ，1 0 ，1 1 o 大麦中极限糊精酶的活性水平很低，但在发芽过程中，极限糊精酶的活性明 显增强，这一作用可被低浓度的赤霉酸( 1 0 5 ) 增强，在此过程中，d 一淀粉酶活性 也明显提高，而且速度比极限糊精酶更快【1 2 】。h a r d i e ( 1 9 7 5 年) 的研究表明赤霉酸 5 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 诱导了极限糊精醉和q 淀粉酶的合成，这种合成作用可能发生在糊粉层，他用 同位素标记法获得了证据。多数研究者也都认为极限糊精酶与q - 淀粉酶都是发 芽后重新合成的。在未发芽的谷物中可检侧到的低水平的极限糊精酶，可能是子 粒发芽过程中合成的酶的残余 1 3 1 ，这可能是作物在长期的自然选择过程中形成 的一种自我保护机制，可防止籽粒在收获前发芽。 大麦中极限糊精酶有三种存在方式：潜伏态、束缚态、自由态1 1 4 , 1 5 】。其中， 潜伏态的酶为与可溶性抑制物结合的酶，不需加入还原剂就可被提取出来，但其 激活要借助于还原剂的作用；自由态的酶为未与抑制物结合的那部分酶，不经任 何处理就有活性；束缚态的酶在提取缓冲液中加入还原剂才能被提取。潜伏态与 束缚态统称为结合态。 研究表明，大麦发芽过程中，极限糊精酶的合成速率远低于其它的水解酶( 如 q 淀粉酶) ，而且不同的大麦来源，酶的合成速率不同。一般认为，随着发芽进 程，极限糊精酶的含量和活性均升高。已有的报道表明，极限糊精酶达到最高活 性所需的发芽时间不同，可能是因为采用的发芽条件和大麦来源不同【l6 1 。根据 l o n g s t a f f 和b r y c e 的研究结果，大麦发芽5 天只有少量束缚态的极限糊精酶，几 乎检测不到自由态的酶。 1 1 3 2 极限糊精酶测定方法 自从发现极限糊精酶以来，对其活性的测定方法已有过很多研究。 早期一些研究者以过量的q 一淀粉酶和1 3 一淀粉酶水解淀粉形成的极限糊精 或普鲁兰为底物，测定生成的还原性糖来表示该酶的活性：还有人利用1 4 c 标记 或者通过测定普鲁兰粘度来确定酶活性。用还原糖法测定时，需将酶进行部分提 纯以去除内源的还原性糖；另外以极限糊精作为底物时，酶作用后的最终产物是 线性麦芽多糖，它可以被未纯化的提取物中的q 一淀粉酶和q 一葡糖苷酶进一步降 解。 普鲁兰是一种由c t 麦芽三糖通过l ，6 糖苷键连接而成的线状多聚体，极限 糊精酶作用于普鲁兰的最终产物是麦芽三糖，不是q 淀粉酶的良好底物。这样， 用普鲁兰作为底物虽可以降低试验误差，但提取物中的q 葡糖苷酶也可以水解 麦芽三糖，造成测定值偏高。l e e 和p y l e r 采用两步反应法部分地解决了这一问 题，即利用酵母q d 葡糖苷酶将极限糊精酶作用后产生的麦芽三糖完全水解， 6 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 之后测定生成的葡萄糖的量来表示酶活性【1 7 1 。该方法存在的主要问题是：极限 糊精酶水解普鲁兰的原初产物是线性寡糖而不是麦芽三糖，酵母q d 葡糖苷酶 尽管能迅速水解麦芽三糖，但对于极限糊精酶水解形成的较高聚合度的寡糖，如 6 q 麦芽三糖基麦芽三糖，则不能完全水解。1 9 8 9 年s e r r e 等报道了利用染色普 鲁兰法测定该酶活性的方法【1 8 】，这种染色产物不能被q 葡糖苷酶降解，因此其 误差较小，且这一方法的灵敏度要比还原糖法高3 - - 4 倍，可用来测定植物粗提 取液中的极限糊精酶，但用于测定大麦和麦芽中的极限糊精酶，其灵敏度不如火 箭电泳法。火箭电泳法在测定极限糊精酶含量较低的提取物时，灵敏感又显得不 足。 s i s s o n 等采用改进的纯化大麦极限糊精酶的方法，制各了极限糊精酶的单一 特异性多克隆抗体，利用改进的酶联免疫方法( e l i s a ) 坝i j 定纯化后的酶活性。这 种方法特异性和灵敏度均较高，能迅速识别活化状态的酶。极限糊精酶在未发芽 的种子中主要以无活性的形式存在【1 9 】，与1 3 淀粉酶一样，可以通过加入特定蛋 白酶或者还原剂如半胱氨酸和二硫代苏糖醇使酶活化。 1 9 9 2 年m a c c l e a r y 在加入还原剂d t t 的条件下，利用2 种不同的普鲁兰为 底物，一种为可溶性的染色底物r e d 普鲁兰，另一种为不可溶的染色的交联底 物，即a z u r i n e c l 普鲁兰，分别测定了大麦麦芽中的极限糊精酶活性，结果以 后者为底物测得的酶活性比用前者为底物高1 5 倍【2 0 】。该法通过对p u l l u l a n 多聚 糖进行染色和交联产生的在水中水合但又不溶于水的物质，能被极限糊精酶和普 鲁兰酶水解而不能被q 一淀粉酶和p 淀粉酶以及a 葡糖苷酶水解。通过极限糊精 酶( 或者普鲁兰酶) 的水解能够产生水溶性的染色片段，其释放速率( 5 9 0 n m 下 吸光值增加) 与酶活性直接相关。由于这种方法操作简单，误差较小，且可用来 测定未纯化的粗提取液中的酶活性，因此被广泛接受，并由爱尔兰m e g a z y m e 公 司开发出相应的专用测定试剂盒。 1 1 3 3 极限糊精酶的应用 极限糊精酶作为独特的降解1 ，6 糖苷键的酶类，在食品、洗涤剂、纺织 等将淀粉转化成糖溶液的过程中被广泛应用。极限糊精酶在淀粉加工业中意义重 大。经极限糊精酶脱支处理的淀粉，在流变学特性、成膜性等方面有突出的特点， 形成的膜具有很好的强度和隔氧性，适用于食品的包装，同时生产中反应条件温 7 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 和，不造成环境污染。在以淀粉为原料生产各种糖浆时，极限糊精酶与其它淀粉 酶复合使用可提高糖化率，具有很大的商业价值。另外，极限糊精酶也可作为研 究碳水化合物结构的重要工具，在洗涤剂、纺织业中也具有重要价值。极限糊精 酶对酿造也非常重要。在酿造中，极限糊精酶与其它淀粉酶一起可将淀粉彻底降 解为酵母可发酵的小分子糖类，提高了麦汁发酵度，对生产低糖啤酒意义重大。 1 1 3 4 极限糊精酶抑制因子 在麦芽中，未完全分解的淀粉大约有1 5 - 2 0 ，即使在麦芽汁和制成的啤 酒中也含有相当数量的分支糊精【2 1 1 。因此，推测可能存在抑制极限糊精酶发挥 其最大活性的因子。人们从成熟的大麦中发现了一种类似蛋白质的抑制因子，它 们与极限糊精酶形成复合物，如将这种复合物之间的连接打破，则可以使自由态 极限糊精酶释放出来。 大麦中确实含有极限糊精酶的抑制物。l j m a c r i 在1 9 9 3 年，证明了极限 糊精酶抑制物实质是蛋白质，并且这种抑制物是内源蛋白抑制物。在发芽中抑制 蛋白逐步降解，但其较高水平足以抑制大部分的麦芽极限糊精酶口2 3 1 。 极限糊精酶抑制因子存在于大麦籽粒的胚和胚乳中。在成熟籽粒中含量较 高，在其他作物中抑制因子活性相对较低。大麦中抑制因子的数量因品种和种植 条件而异。在籽粒成熟过程中，抑制因子合成晚于极限糊精酶，随着抑制因子浓 度增加，与之相结合的束缚态酶也随之增加。因此，在籽粒成熟过程中，当自由 态酶合成速率慢于抑制因子的合成速率时，自由态极限糊精酶的数量开始下降。 2 4 - 2 7 】。然而，关于极限糊精酶和抑制因子的亚细胞定位，尚未见有研究，因此在 成熟籽粒中它们如何形成复合物的确切机制还不清楚。 随着发芽开始，其含量迅速下降，当极限糊精酶活性迅速升高时，它几乎完 全消失。梁秀梅、李芬等将五种基因型的大麦发芽三种形式的极限糊精酶和总酶 活性变化幅度进行对比，结果发现其自由态、潜伏态和束缚态酶变化幅度差异较 大，而总的酶活性在发芽过程中的变化差异不大【2 8 】。 抑制因子的作用一方面降低极限糊精酶的活性，导致啤酒中未经过发酵的寡 糖增加，对制啤品质产生负面影响，但另一方面，抑制因子的存在使酶的热稳定 性增加。研究发现，极限糊精酶的失活温度为6 5 。c ，而焙焦时极限糊精酶只有 2 0 失活。主要原因就是极限糊精酶抑制因子与极限糊精酶结合，形成复合物之 8 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 后增强了极限糊精酶的热稳定性，使得在蒸馏过程中极限糊精酶的活性一直保持 到发酵阶段，以利于提高酒精产量，这对制啤是有利的。 1 1 3 5 自由态极限糊精酶从结合态极限糊精酶释放的两种假设 早期在研究极限糊精酶的活性测定技术时，发现加入还原性物质可提高该酶 的活性，其原因可能为：其一是极限糊精酶在萌芽过程中合成，但它与籽粒中的 不可溶性物质结合形成无活性的形式，而还原剂如l 半胱氨酸盐酸盐可去除复 合物中的二硫键，从而使“束缚态”极限糊精精酶得以释放；其二是还原剂如l - 半胱氨酸盐酸盐通过去除二硫键或阻止二硫键的形成活化大麦中的巯基蛋白酶， 然后通过活化的蛋白酶的修饰作用释放或者激活无活性的极限糊精酶【2 9 】。 1 1 4 啤酒大麦中三种淀粉酶的协同作用 大麦麦芽中含有的3 类重要淀粉水解酶q 一淀粉酶，b 一淀粉酶以及极限糊 精酶【3 0 1 ，在制啤酒的糖化过程中协同作用，水解淀粉为可发酵的糖类，然后再 经酵母的发酵作用，制成啤酒。 啤酒大麦麦芽中的淀粉包括约3 0 的直链淀粉和7 0 的支链淀粉。在淀粉水 解过程中，q 一淀粉酶首先随机水解淀粉内部的q - 1 ，4 一糖苷键，产生一系列的 线状和分枝状糊精，如麦芽糖、麦芽三糖和q 一糊精，因此被称为内切淀粉酶。 b 一淀粉酶是从淀粉的非还原性末端开始水解，按两个葡萄糖单位方式来水解a 一1 ，4 糖苷键，降解直链淀粉，而作用于支链淀粉时，它仅能水解q 一1 ，6 一糖苷 键外围碳链的q 一1 ，4 糖苷键，不能越过a - 1 ，6 一糖苷键水解分支点内侧的q 一1 ， 4 糖苷键，从而生成麦芽糖和b 一糊精，它是一种外切酶。这样，a 一淀粉酶和b 一 淀粉酶水解后的酶解溶液中，含有相当多的分枝糊精片段，即成为极限糊精，而 极限糊精酶的作用便是高度特异地水解极限糊精( q 一糊精和b 一糊精) 中的 q - 1 ，6 糖苷键，使其成为线状糊精，从而可被q 一淀粉酶和0 一淀粉酶进一步 水解【3 l ，3 2 1 。 另外，在淀粉的磷酸降解途径中，直链淀粉可以被植物磷酸化酶转化为a 一 葡萄糖一1 一磷酸，磷酸化酶对支链淀粉的作用只局限在外围链，降解的最终产物 是4 0 - - - 5 0 的q 一葡萄糖一卜磷酸和磷酸化极限糊精，后者包含约5 - - - 6 个葡萄糖 残基，其进一步降解也同样需要极限糊精酶的参与【3 3 】。 但是，极限糊精酶不能单独降解淀粉粒，只有在a 淀粉酶作用以后才能发挥 9 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 作用1 3 4 1 ，而且它要求q 1 ，6 一糖苷键的两侧至少各有一个q 1 ，4 键连接的d 葡萄糖残基【3 5 l 。 因此，在麦芽及啤酒生产过程中，如果能在淀粉酶解过程中充分利用q 一淀 粉酶、1 3 一淀粉酶和极限淀粉酶组成酶系的协同作用，可大幅度提高淀粉水解速 率，减少支链糊精残存量，提高淀粉的糖化率。在大麦发芽过程及成品麦芽中， q 一淀粉酶和1 3 一淀粉酶的活性相当高，不可能是麦芽淀粉水解的限速酶。但由 于淀粉水解酶系中极限糊精酶活力相对较低，使得支链糊精难以水解，如要获得 高的糖化率，必须延长糖化时间，而在该酶最适温度条件下延长糖化时间，就会 影响酶的热稳定性，使酶失活率增大，间接造成糖化率降低。虽然也可以通过在 麦芽汁中添加极限糊精酶来提高麦芽汁的可发酵性，但这样必然会增加生产成 本。如何提高极限糊精酶活力，这在利用酶法进行淀粉水解生产啤酒过程中具有 极高的工业价值。 1 2 啤酒大麦淀粉酶活性的提高方法 1 2 1 啤酒大麦品种 在大麦发芽过程及成品麦芽中，极限糊精酶是淀粉水解的限速酶。虽然可通 过在麦芽汁中添加极限糊精酶来提高麦芽汁的可发酵性，但这样必然会增加生产 成本。因此，现在采用的方法主要是选用极限糊精酶活性较高的大麦来制备麦芽。 近几年国产啤酒大麦质量水平不断提高，但与进口大麦相比还存在一定差 距，表现在以下几方面【3 6 】：l 、蛋白质含量普遍偏高，且含量变动较大；2 、发芽 率相对较低；3 、国产啤酒大麦麦芽浸出率普遍偏低且不稳定，尤其是个体农户 大麦；4 、1 3 葡聚糖含量偏高；5 、籽粒外观色泽较差；6 、品种混杂，纯度较差。 澳大利亚主体大麦品种f r a n k i n 和g a r d n e r 占大麦面积的9 5 以上，而我国同一 地区有多个大麦品种推广。 1 2 2 使用赤霉素 赤霉素是一种植物生长促进剂，存在于发芽大麦的胚内。发芽时，赤霉素由 胚转移至糊粉层，并在此诱导而产生各种淀粉酶，使胚乳得以接受这些水解酶的 作用而溶解。通过外加赤霉素处理大麦，是为了补充麦芽本身赤霉素的不足，进 一步提高有关酶的活力，加速胚乳溶解，以缩短发芽时间和降低制麦损失【。赤 霉素一般加于最后一次浸麦或发芽开始时，用量控制在大麦重量的0 1 5 p p m 以 1 0 在啤酒糖化过程中提高极限糊精酶活力的研究 下。使用赤霉素一方面可以加速发芽，缩短发芽时间2 天左右，同时减少制麦损 失4 、提高淀粉酶活力、蛋白酶活力。 1 2 3 使用金属离子 在大麦发芽过程中通过浸泡方式添加金属离子来提高制麦酶系中q 淀粉酶 和b 淀粉酶的活力，使麦汁中的离子构成及含量更加合理。添加的金属离子种 类为k + 、n a + 、c u 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + ，分别以k c l 、n a c l 、c u c l 2 、m g c l 2 、z n c l 2 形式添加。金属离子对q 淀粉酶的活力有影响，作用过程均为浓度低时对酶活 有激活作用，浓度高时有抑制作用。金属离子对b 淀粉酶的活力有影响，作用 过程均为浓度低时对酶活有激活作用，浓度高时有抑制作用。 1 2 4 使用酶制剂 酶制剂在啤酒生产中主要应用在以下6 个方面【3 7 4 2 】： ( 1 ) 提高啤酒的辅料比例 啤酒生产中均添加大米、玉米等辅料，可大大降低生产成本。但是由于辅料 所含淀粉酶较少，因此在糖化时通常加入q 一淀粉酶和b 一淀粉酶。 ( 2 ) 弥补低质量麦芽的缺陷 使用质量较差的麦芽，常常出现糖化不完全、过滤困难、麦汁组成不理想、 原料收得率低等现象。添加淀粉酶制剂，可加速麦芽的糖化，解决糖化不完全的 问题。 ( 3 ) 提高啤酒的非生物稳定性 在发酵和贮酒期间，添加蛋白酶制剂如木瓜蛋白酶，可分解引起混浊的蛋白 质，从而提高啤酒的非生物稳定性。采用在糖化过程中每吨麦芽加3 6 的甲醛 8 0 0 m l ，以及在啤酒过滤后加5 1 0 。7 的木瓜蛋白酶，能够使啤酒稳定时间达4 个月以上，而对其他质量指标几乎没有不利影响【4 3 1 。 ( 4 ) 增加啤酒品种，生产高发酵度啤酒 干啤酒口味纯正淡爽，色泽浅，苦味轻，残糖量和热值都很低，比较符合大 众消费口味。干啤主要特色就是发酵度高，一般在7 2 以上，而一般啤酒的发酵 度只有6 0 左右。要获得如此高的发酵度，必须将麦芽中残存的淀粉和糊精降 解，提高麦汁中可发酵性糖的含量。由于大麦中有4 5 - 5 0 ( 干物质) 的支链淀 粉，有较多的q 一1 ，6 键，必须加解支酶才能有效地提高麦汁中可发酵