（环境科学专业论文）干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究.pdf

干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 粘性末端的c b e b f 2 5 全长e d n a 片断。同时对载体p 2 3 0 1 一g u s 分别采用b a c f i i s a c i 和x m a i s a c i 双酶切，切下g u s 基因后回收载体骨架。将对应的载体骨架与目的 基因进行连接，即可得到分别携带0 0 r 2 9 和c 6 彪彳基因全长e d n a 的植物表达 载体p 2 3 0 1 0 0 r 2 9 和p 2 3 0 1 一c b c b f 2 5 0 将其先转化大肠杆菌，再转化根癌农杆菌。 此外，我们构建了适合遗传转化单子叶植物的表达载体p d b 一功曲船只目的 基因c b e b f 2 5 由玉米泛素u b i 启动子驱动，h p t 基因作为选择标记基因，可用来 遗传转化单子叶植物。 3 c o r 2 9 和c b c b _ r 2 5 全长e d n a 采用农杆菌转化法转化烟草的研究 本研究采用含有植物表达载体p 2 3 0 1 0 0 r 2 9 和p 2 3 0 1 一c b c b f 2 5 的根癌农杆菌 菌株e h a l 0 5 进行烟草转化的叶盘法操作，经过共培养、诱导不定芽、生根移栽 后分别获得转c o r 2 9 基因的再生苗3 5 株和转c 6 忍f 基因的再生苗2 3 株。对这 些再生苗进行叶片卡那霉素抗性鉴定的结果表明：在转0 0 r 2 9 基因的再生苗中， 有完全抗卡的6 株，部分抗卡的6 株，完全不抗卡的2 3 株；在转劬c 占杞孑基因 的再生苗中，有完全抗卡的5 株，部分抗卡的3 株，完全不抗卡的1 5 株。对叶 片k a n 抗性检测呈完全阳性的再生植株进行蟊的基因( c o r 2 9 或c b o b 搦d 和 n p t i i 基因的p c r 检测，均扩增出了阳性条带。结果初步表明荠菜的脱水素基因 c o r 2 9 和c b f 基因劬c 6 忍手已经整合到烟草基因组之中。 关键词：干旱环境胁迫脱水素c b f 荠菜c o t 2 9c b c b f 2 5 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 a b s t r a c t d r o u g h ti so n eo ft h em a j o ra b i o t i cs t r e s sf a c t o ra f f e c t i n gt h en o r m a lm e t a b o l i s m ， g r o w t h a n dd e v e l o p m e n to fp l a n t s ，w h i c hh a v eas e r i o u si n f l u e n c eo nt h e u r b a n g r e e n i n gc o n s t r u c t i o na n da g r i c u l t u r a ld e v e l o p m e n ti nc h i n a d e h y d r i n sa n d c b f ( c r tb i n d i n gf a c t o r s ) a r eg r o u p so fp r o t e i n sp r o d u c e di nt h ep r o c e s so ft h e d r o u g h t e n v i r o n m e n t a ls t r e s s t h e yp l a yab i gr o l ei na n t i d r o u g h tr e s p e c t i v e l y b u t b yf a ri ti sl a c ko fd a t aa p p l y i n gi nt h ep l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n go fa n t i d r o u g h t a n d i ts t i l ln e e df u r t h e rr e s e a r c h i nt h i sr e s e a r c h ，an o v e ld e h y d r i ng e n ec a l l e dc o r 2 9w a s c l o n e df r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s t h ef u l l l e n t he d n ao fc o r 2 9a n dc b c b f 2 5 g e n ew e r et r a n s f o r m e di n t ot o b a c c ob yt h ea g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ，s oa st op r o v i d er e f e r e n c e sf o rt h ep l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gr e s e a r c h o fa n t i d r o u g h t t h er e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o na n a l y s i so ft h ef u l l - l e n g t he d n ao f d e h y d r i ng e n ec o r 2 9f r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s c o m b i n e db yt h eh o m o l o g y - b a s e dc l o n i n gm e t h o da n dr a c et e c h n o l o g y , a n o v e ld e h y d r i ng e n ed e s i g n a t e da sc o r 2 9 ( g e n b a n k ，a y 5 1 3 7 8 7 ) w a sc l o n e df r o m c a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s t h ef u l l l e n g t he d n a o fc o r 2 9w a si11 0b pl o n gw i t l la7 8 3 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r e ) e n c o d i n gap u t a t i v ep r o t e i no f2 6 1a m i n oa c i d s t h e d e d u c e dp o l y p e p t i d e ( d e s i g n a t e da sc o r 2 9 ) h a dap r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h to f 2 9 3 6k da n da ne s t i m a t e dp io f 4 9 3 s e q u e n c ea n a l y s e ss h o w e dt h a tc o r 2 9s h a r e ds e v e r a lt y p i c a lf e a t u r e sw i t h d e h y d r i n sf a m i l y , i n c l u d i n gah i g hp r o p o r t i o no fh y d r o p h i l i ca m i n oa c i d sw h i c h m a k e si tah i 曲l y h y d r o p h i l i cp o l y p e p t i d e ，t h r e ec o p i e s o fl y s r i c hd o m a i n s ( k - s e g m e n t s ) a n das e r - r i c hd o m a i n ( s - s e g m e n t ) p r i o rt ot h ef i r s tl y s - r i c hd o m a i nt h a t w a sc o m m o nt om a n yd e h y d r i n s s e a r c ho ft h es e q u e n c ed a t a b a s ei ne x p a s y u n i p r o t t h r o u g ht h eb l a s ta l g o r i t h mi m p l i e dt h a tt h ec o r 2 9s e q u e n c eh a dh i 。g hh o m o l o g y w i t ht h a to fd e h y d d n s a n a l y s e so fs t r u c t u r e a n df i m c t i o ni n d i c a t e dc o r 2 9p r o t e i nw o u l dp l a ya i m p o r t a n tr o l eb yi t sa b u n d a n th y d r o p h i l i ca m i n or e s i d u e sa n dk - s e g m e n tw h i c hc a n f o r mt h ea m p h i p a t h i ca h e l i xi np r e v e n t i n gc e l lf r o md e h y d r a t i o ni n j u r er e s u l t e db y d r o u g h t e n v i r o n m e n t a ls t r e s s s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r r e v e a l e dt h a tc o r 2 9 g e n ec o u l db ei n d u c e db yd r o u g h t ， l o w t e m p e r a t u r ea n de x o g e n o u sa b s c i s i ca c i d ( a b a ) t h ef u r t h e ra n a l y s i ss u g g e s t e d 3 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 t h a tt h e r ee x i s ta tl e a s tt w oi n d e p e n d e n ts i g n a ll t a n s d u c t i o np a t h w a y so fc o r 2 9g e n e e x p r e s s i o n ：o n ep a t h w a yw a sa b a - d e p e n d e u tp a t h w a yb u td o e sn o tr e q u i r ep r o t e i n b i o s y n t h e s i s ( i v ) ，a n dt h eo t h e ro n ew a sa b a i n d e p e n d e n tp a t h w a y 2 p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rc o n s t r u c t i o no fc o r 2 9a n dc b c b f 2 5f u l l - l e n g t hc d n a t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a 2 3 0 1w a sa d o p t e da st h eb a c k b o n e t h e f l u sb o xo fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp b i l 2 lw a sc u td o w t tw i t he c o r m h i n d l rd o u b l e d i g e s t i o na n dr e c o v e r e dt o b ei n s e r t e di n t ot h em u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ( m c s ) o f p c a m b i a 2 3 0 1t of o r ma ni n t e r m e d i a t ev e c t o rp 2 3 0 1 - g u s i nt h i sv e c t o r , t h eu s a b l e r e s t r i c t i o ns i t e sa f t e rt h ec a m v3 5 sp r o m o t e ro ft h ei n s e r t e df l u sb o xa r ex b a i ， b a m h ia n dx m a l l s m a i ，w h i l eo n l yo n es a c is i t ec a nb eu s e db e f o r et h en o s t e r m i n a t o r p c rp r i m e r s 谢t 1 1a d e q u a t er e s t r i c t i o ns i t es e q u e n c e sw e r ed e s i g n e da n d t h ef u l l - l e n g t he d n af r a g m e n t so fc o r 2 9a n dc b c b d 5g e n e sw e r ea m p l i f i e df r o m r e v e r s e t r a n s c r i b e dt o t a lc d n a s a f t e rv e r i f i e dw i t hs e q u e n c i n g ，p g e m - te a s y v e c t o r sc o n t a i n i n gt h et a r g e tg e n ef r a g m e n t sw e r ed o u b l ed i g e s t e dc o m p l e t e l ya n dt h e f o l l o w i n gg e n ef r a g m e n t s w e r e r e c o v e r e d ：c b c b f 2 5f u l l - l e n g t h c d n a sw i t h x m a i s a c ic o h e s i v ee n d si nt h e i r5 a n d3 e n d sr e s p e c t i v e l y , a n dt h ec o r 2 9f u l l l e n g t h c d n a sw i t hb a m h i s a c ic o h e s i v e e n d si nt h e i r5 a n d3 e n d sr e s p e c t i v e l y m e a n w h i l et h ep 2 3 0 1 - g u sw a sd o u b l ed i g e s t e dw i t hb a m h f s a c ia n dx m a i s a c i r e s p e c t i v e l y t oc u ta w a yt h ef l u sg e n ef r a g m e n t sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gl i n e a r i z e d v e c t o rf a g m e n t sw e r ea l s or e c o v e r e d t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sp 2 3 0 1 c o r 2 9a n d p 2 3 0 1 - c b c b f 2 5c o n t a i n i n gt h ec o r 2 9a n dc b c b f 2 5f u l l l e n g t he d n ar e s p e c t i v e l y w e r ef i n a l l yo b t a i n e db yl i g a t i n gt h ec o r r e s p o n d i n gv e c t o rf r a g m e n t sa n dt h et a r g e t g e n ef r a g m e n t s 、i t l lc o m p a t i b l ec o h e s i v ee n d s t h e2t a r g e tg e n e sw e r ed r i v e db yt h e c a m v3 5 sp r o m o t e ra n dt e r m i n a t e df o rt r a n s c r i p t i o nb yt h en o st e r m i n a t o r r e s p e c t i v e l y b o t ho f t h ec o n s t r u c t e dp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sc o n t a i na nn p t l im a r k e r g e n eb o xa n daf l u sr e p o r t e rg e n eb o x t h e yw e r ef i r s tt r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i a c o l is t r a i nd h 5 ，a n dt h e ni n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r o j n se h a l0 5 i na d d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp 2 3 0 1 - c b c b f 2 5w a sc o n s t r u c t e d ，i nw h i c ht h e t a r g e tg e n ec b c b f 2 5w a sd r i v e db yt h eu b i q u i t i n - p r o m o t e rw h i c hw a sc l o n e df r o mt h e m a i z ea n dt h eh p tg e n ew a su s e da sm a r k e rg e n e a n di tc o u l db eu s e dt ot r a n s f o r m t h em o n o c o t y l e d o n 3 t h er e s e a r c ho fc o r 2 9a n dc b c b f 2 5f u l m e n g t he d n ai n t ot o b a c c ou s i n g a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 4 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n se h a l 0 5h a r b o r i n gt h ep l a n te x p r e s s i o n v e c t o r p 2 3 0 1 一c o r 2 9a n dp 2 3 0 1 c b c b f 2 5w a su s e dt oc o c u l t u r ew i t l lt o b a c c ol e a fd i s c sf o r t h et r a n s f o r m a t i o nr e s p e c t i v e l y a f t e rs u c c e s s i v ei n d u c t i o no ft h ei n d e f i n e t eb u d sa n d r o o t s ，3 5r e g e n e r a t e dt o b a c c op l a n t st r a n s p l a n t e db yp 2 3 0 1 - c o r 2 9a n d2 3r e g e n e r a t e d t o b a c c op l a n t st r a n s p l a n t e db yp 2 3 0 1 - c b c b f 2 5w e r ef i n a l l yo b t a i n e dr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to ft h ei d e n t i f i c a t i o no ft h e s es e e d l i n g sw i t h0 5 k a r lf o rl e a f i n o c u l a t i o ni n d i c a t e dt h a t ，i nt h ep l a n t st r a n s p l a n t e db yp 2 3 0 1 一c o r 2 9 ，t h e r ew e r e6 r e s i s t a n t ，6p a r t i a l l yr e s i s t a n ta n d2 3n o n r e s i s t a n to n e s ；a n di nt h ep l a n t st r a n s p l a n t e d b yp 2 3 0 1 一c b c b f 2 5 ，t h e r ew e r e5r e s i s t a n t ，3p a r t i a l l yr e s i s t a n ta n d1 5n o n - r e s i s t a n t p c ri d e n t i f i c a t i o nr e s u l t so ft h et a r g e tg e n e ( c o r 2 9o rc b c b f 2 5 ) a n dn p t l ig e n es h o w t h ek a nr e s i s t a n ts e e d l i n g sc o n t a i n e dt h et a r g e tg e n er e s p e c t i v e l y b a s e do nt h er e s u l t s h o w e da b o v e ，w ec a nc o n f i r m e dt h a tt h ed e h y d r i ng e n ec o r 2 9a n dc b fg e n e c b c b f 2 5f r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i sh a sb e e ni n s e r t e di n t ot h eg e n o m i cd n ao f t o b a c c o k e y w o r d s ：d r o u g h t e n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，d e h y d r i n s ，c b f ，c a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i s ， c o r 2 9 ，c b c b f 2 5 5 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 缩写词对照表 6 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 7 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 引言 1 研究背景 植物在生长发育过程中，经常受到干旱、低温、盐渍等各种非生物环境胁迫 的影响，从而引起体内发生一系列的生理生化代谢反应，影响植物正常的代谢和 生长，严重时甚至可引起不可逆伤害，并导致整个植株死亡。 在各种非生物环境胁迫因子中，干旱是导致作物产量下降最主要的环境胁迫 因子。干旱对作物产量的影响在各种非生物的环境胁迫因子中占首位，仅次于生 物胁迫即病虫害所造成的损失。据统计，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积 的3 6 ，占耕地面积的4 3 ( 陈善福，1 9 9 9 ) 。在我国，干旱和半干旱地区约占 国土面积的二分之一，尤其是在我国的西部和北部地区，年降水量少，且季节分 配不均，受到严重的干旱威胁，这也是造成西部经济滞后的一个重要原因之一。 干旱不仅引起作物减产，并且日益恶化生态环境，引起生态危机。目前由于 干旱引起的河流干涸、土地沙化、沙尘暴频发、湖泊湿地萎缩、草地退化、森林 锐减、生物量和生物多样性急剧下降等一系列生态环境问题已经严重威胁到人类 社会的可持续发展，并引起了全社会的关注。 此外，伴随着城市化进程的加剧，城市土地面积也在逐步扩大，对城市绿化 植物的需求也进一步加强，但同时必然带来对城市水资源更大的消耗。目前我国 的不少城市( 尤其是大城市和西北地区降雨少蒸发量大的城市) 为水资源紧缺的 地区，一些具有优良性状，但耗水量相对较大的植物( 包括草坪草) 在城市绿化 中的使用就受到了很大的限制。因此，水资源的匮乏已成为制约我国城市绿化发 展的重要因素之一。 综上所述，干旱是影响植物正常代谢和生长发育的最主要的非生物胁迫因子 之一，对我国的农业发展、生态环境建设和城市绿化建设的造成严重的阻碍。因 此，提高植物的抗旱能力、培育干旱耐受性的植物新品种已经成为当前植物育种 中的一个迫切需求和重要方向。 2 本研究的目的和意义 常规的植物抗早工程研究大多数是局限于杂交、引种、驯化、品种比较观察 和选育等生理角度或者其它传统的农业措施等方面。这种方法在提高植物的抗旱 性方面虽然也取得了一定的进展，但周期长，且效果不明显。迄今为止利用常规 方法还没有培育出真正的抗旱品种( 王忠华，2 0 0 2 ) 。和常规育种相比，采用生 物基因工程技术将抗旱基因定向导入植物，可望在较短的时间内提高植物的抗旱 性能，并且不改变原来品种的优良性状，因此，它在植物抗旱工程研究中上具有 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 广阔的应用前景，对于我国抗旱植物育种工作的开展具有重要的现实意义。 我国拥有丰富的抗旱植物资源，然而，这些资源长期以来并没有受到足够的 重视，更谈不上进行全面、系统的研究和改良。同时，虽然我国植物转基因工作 已经进行了多年，但是具有自主知识产权的有用基因还很少，因此，有必要利用 现有丰富的植物资源开展新基因的研究，克隆出更多拥有自主知识产权、抗逆性 强的基因。近年来，随着分子生物学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，使得 人们能够在分子水平上认识植物对干旱环境胁迫的耐( 抗) 性机理，并利用基因 工程技术培育出抗旱的植物新品种。目前，人们对干旱环境胁迫下的植物分子适 应机理研究取得了长足的进步，在利用抗旱基因提高植物对干旱的耐受性方面也 取得了很大的进展，且有部分工程植物进入大田生产阶段。尽管如此，我们可用 的抗旱基因还是非常有限，对植物耐受干旱的分子机理尚需进一步了解。 在本研究中对干旱环境胁迫下的植物分子适应机理进行了深入的探讨和研 究，并利用分子克隆技术从植物荠菜中克隆出了一个新的脱水素基因( c o t 2 9 ) 。 同时本研究还构建了适合该脱水素基因和c b f 转录因子基因( c b c b 露印进行单、 双子叶遗传转化的植物表达载体，并进行了对烟草的遗传转化研究。 本研究有助于加强我们对干旱环境胁迫下植物分子适应机理的认识，进一步 了解脱水素和c b f 转录因子在植物抗旱中的功能和作用机理，并为利用转基因技 术进行植物耐旱遗传品质的改造提供新的思路和方向。同时，荠菜中脱水素基因 c o t 2 9 的克隆也使得抗旱基因工程研究有更大的可选择基因范围。此外，本研究 对模式研究植物烟草的遗传转化研究也为利用脱水素基因和c b f 转录因子基因 转化其它作物和城市绿化植物奠定基础。这对于促进干旱地区农业的发展和生态 环境的改善有不可估量的推动作用，也将大大的缓解由于城市( 尤其是大城市和 西北部地区的城市) 绿化用水缺乏所带来的压力。 3 本研究的主要内容 干旱环境胁迫下植物的分子适应机理； 脱水素及其基因的表达调控： 荠菜脱水素基因c o t 2 9 全长e d n a 克隆及其特征分析； 荠菜脱水素基因c o r 2 9 在干旱、低温和外源a b a 胁迫下的表达 c o t 2 9 和c b e b z 2 5 的单、双子叶植物表达载体的构建； c o r 2 9 和c 6 凹5 的全长e d n a 转化烟草； 再生植株的分子鉴定。 王呈堑些堕垫! 塑堕塑坌王望壁墨堡墨茎查里里茎一 4 实验技术路线 1 0 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 第一章干旱环境胁迫下植物的分子适应机理及抗旱基因工 程研究进展 近年来，随着分子生物学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，使得人们能 够在基因的结构、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对逆境胁迫的耐受 性机理，并利用从对干旱环境胁迫具耐受性的植物中分离出耐旱相关的目的基 因，培育出干旱耐受性的植物新品种。总体说来，目前对干旱环境胁迫下的植物 分子适应机理的研究主要集中在以下几个方面：干旱胁迫对植物的生理伤害； 植物耐旱的机理；植物在干旱胁迫下诱导表达的基因及蛋白：干旱胁迫信 号的感受和传导；植物干旱胁迫应答基因的表达调控。 1 干旱环境胁迫对植物的伤害 干旱环境胁迫对植物的伤害主要表现在以下几个方面( 陈善福，1 9 9 9 ) ： 植物生长受到抑制：植物生长受抑制是干旱胁迫所产生的最直观的生理效应。早 期的研究认为，干旱造成叶片生长受抑主要是因为膨压降低所致，但是目前越来 越多的实验结果却对此予以否定。如在干旱条件下，玉米幼苗叶片生长区的膨压 基本不变，但其生长速率却显著受抑( m i c h e l e n a ，1 9 8 2 ) 。研究者认为这可能与 细胞壁的硬化( 指不可逆伸展能力，即伸展性) 响应有关。在干旱条件下细胞壁 的硬化有效地限制了植物绿叶面积的扩大，因而也就显著地降低了植株的蒸腾失 水，使植株有可能长时间存活。故n e u m a n n ( 1 9 9 5 ) 认为细胞壁的这种硬化现象 是一种植物对水分亏缺反应的主动适应性前馈机制。对光合作用的伤害：干旱 胁迫对植物光合作用的影响比较复杂，它不仅会使光合速率降低，而且还会抑制 光合作用光反应中原初光能转换、电子传递、光合磷酸化和光合作用暗反应过程， 最终导致光合作用下降。在干旱胁迫条件下，植物叶表面气孔关闭，从而阻止 c o ：进入体内，导致光合作用下降。同时，由于得不到外界c o 。，光所形成的化学 能不能象在正常的c o ：固定条件下被用掉，叶片就会发生光抑制作用，从而造成 叶绿体超微结构持续的损害或不可逆的破坏( 郭连旺等，1 9 9 6 ；m e h d y ，1 9 9 4 ) 。 活性氧对植物的氧化伤害：在通常情况下，植物体内产生的活性氧不足以使植 物受到伤害。因为植物体内有一套行之有效的抗氧化系统。但是，一旦植物遭受 严重的干旱胁迫，活性氧的产生和抗氧化系统之间的平衡体系就被破坏，从而损 伤膜的结构和抑制酶的活性，导致细胞因受氧化胁迫而伤害细胞。膜系统先受活 性氧的袭击，对胁迫敏感的磷脂和脂肪酸先受损，导致生物膜中脂质的过氧化， 使膜上的孔隙变大，通透性增加，离子大量泄漏，引起“叶绿素一蛋白质”复合 干旱环境聃迫下的植物分子适应机理及其应用研究 体结合松弛，叶绿素含量明显降低，严重时会导致植物死亡。膜脂相变：在干 旱胁迫条件下，细胞含水量下降，由于脱水削弱了稳定构型的亲水键和疏水键之 问的相互作用，核酸、蛋白质及一些极性脂的结构发生改变。细胞膜系统很容易 受到脱水伤害，膜功能的丧失与极性脂组分的相变有关，也可能是由于不同水合 特性的膜组分的相互混合造成的。极性脂的相变是可逆的，不是致命因子，可是 不同水合特性的膜组分的相互混合则可能导致膜结构上某些部分上的蛋白质丢 失，甚至导致膜结合蛋白不可逆外流，将带来严重的损害。 2 植物耐旱的机理 干旱环境胁迫对植物的影响主要表现为对植物体内水分状况的改变。因此， 干旱对植物的影响主要也就是水分胁迫的问题。为了适应环境，在长期的进化过 程中，耐旱植物通过一系列的生理、生化代谢途径的改变来调节和适应环境中的 这种干旱胁迫，其中包括水分吸收的维持或增强、渗透压的调节、光合作用的保 护、离子稳态的维持、诱导许多特殊基因表达以及合成具有特殊功能的酶、蛋白 质、糖或其它代谢产物，或者分解一些体内原来存在的蛋白质等。 2 1 渗透调节 渗透调节是指细胞内渗透势的调节，是植物对水分胁迫适应性反应的一个重 要生理反应，其关键是在干旱条件下细胞内溶质的积累和由此导致的细胞水势的 下降。在受到轻度和中度干旱胁迫时，和非干旱耐受性植物不同，抗旱植物体内 会显著地积累大量的代谢物质如糖类( 果糖、蔗糖、海藻糖等) 、氨基酸( 脯氨 酸) 、多胺、季胺、各种离子f 如k + ) 和蛋白质( 如脱水素) 等( 唐先兵，2 0 0 2 ) 。 这些渗透保护性物质存在于从细菌到高等植物、高等动物的所有生物体中。它们 可使植物在干旱条件下加强吸水以维持一定的膨压，有利于植物在干旱条件下的 水分吸收，且防止水分丢失，从而维持细胞内渗透压与外界平衡，保证细胞生长、 气孔开放和光合作用等生理过程的正常进行，而非干旱耐受性植物的积累溶质的 能力较差。因此，渗透保护性物质在细胞适应各种的不利环境时起着非常重要的 作用。目前，人们对脯氨酸、甜菜碱、甘露醇、海藻糖和脱水素等渗透调节性物 质的生物代谢途径研究比较多，并相继克隆了合成这些物质的基因并部分用于改 良植物的抗旱性能。 2 2 结构调节 已经证明干旱胁迫能够改变细胞壁的化学组分和物理特性，这些变化可能与 基因编码的s 腺苷甲硫氨酸合成酶有关。在非胁迫条件下，会在木质化发生区 域有s 一腺苷一l 一甲硫蛋白降解与修复硫氨酸合成酶基因表达的升高。因此，推测 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 干旱胁迫组织中其表达的升高可能也是由于细胞壁木质化作用引起的( m i t t l e ， 1 9 9 4 ；g a r c i a g o m e z ，2 0 0 0 ) 。在持续的干旱胁迫下，细胞的生长停止的同时木 质化过程就开始了。e s p a r t e r o 等发现，作用于真菌提取物的其它酶也会诱导s 一 腺苷一l 一甲硫氨酸合成酶的转录，如细胞壁形成所需的s 一腺苷一l 一胱氨酸水解酶 和甲基转移酶。b a r t e l s 等( 1 9 9 2 ) 发现复苏植物中一种编码d s p - 2 2 蛋白的m r n a 在多种胁迫条件下水平都升高，编码这个蛋白的e d n a 与早期光诱导蛋白( e l i p ) 基因具有显著的同源性。光能够调控基因表达并编码叶绿体内含有的d s p 一2 2 蛋 白，e l i p 可能在光系统中光电子的累积上起作用。在干旱胁迫中，复苏植物的 叶绿体发生形态上的改变，然后d s p 一2 2 蛋白才能与色素结合或者帮助维持在复 苏过程中非常重要的光合作用所需的一些结构。 2 3 蛋白的降解和修复 那些由于旱胁迫诱导的编码与蛋白水解酶具有相似序列蛋白的基因已经被 从豌豆和拟南芥中分离出来。这些酶的功能之一是能够降解被干旱破坏了的蛋 白。拟南芥遭受干旱胁迫的早期会发生编码泛肽伸展蛋白的m r n a 水平的升高。 泛肽伸展蛋白是在蛋白水解过程中产生的活化泛肽的一种融合蛋白，它的产生显 然与蛋白的降解有关。因为泛肽有标记被破坏了的蛋白的功能，在干旱胁迫中， 蛋白质上的氨基酸残基可能被化学过程修饰，如脱酚胺作用、异构化作用、氧化 作用等。因此，这些酶很可能具有蛋白修复的功能，它们在响应干旱时被上调。 藓类植物对脱水响应时可能很大程度上以修复为基础，b l u d g e t t 等( 1 9 9 3 ，1 9 9 7 ) 认为当蛋白转化速率很低时这种修复机制在脱水过程中可能是非常重要的。 2 4 有毒物质的排除 耐旱植物在干旱胁迫下能增强植物中与解毒有关基因的表达，以清除干旱胁 迫下植物体内积累的有毒物质，减轻干旱的危害。植物在干旱胁迫条件下，叶水 势下降、气孔关闭，导致可获得的c 0 ：数量降低，产生大量的有毒物质如超氧化 物自由基等；同时干旱过程中光呼吸被加强，伴随着羟乙酸氧化酶活性升高，h 2 0 ： 也大量产生。超氧化物自由基、h 。0 2 是强氧化剂，它们的大量产生会干扰细胞的 正常活动。为了适应干旱环境的胁迫，植物体内会产生一系列解毒剂来将这些有 害物质分解掉，其中最明显是合成去除氧化代谢中产生的有毒物质的酶类，如谷 胱甘肽还原酶、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶等。 现已证实植物中超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、谷胱光肽一s 一转移酶等的表 达水平在于旱胁迫条件下都有升高。一些植物在干旱条件下半胱氨酸蛋白酶及泛 素转录水平升高，推测这些蛋白可能参与降解干旱胁迫条件下细胞内已经失活的 蛋白( b r y a n ，1 9 9 6 ) 。w i l l i a m a s 等发现拟南芥中一种巯基蛋白酶的含量在干早 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 胁迫下急剧升高，a b a 不敏感的突变体分析表明它的表达不依赖a b a ，只与干旱 胁迫相关。也有人将来自烟草的m n s o d 酶表达于苜蓿，发现能提高苜蓿的抗旱 性。 干旱环境胁追中代谢的另一个特征很可能是蛋白酶的变化，干旱胁迫诱导表 达的蛋白酶类物质可能参与分解与解聚细胞内变性的蛋白质或贮藏蛋白，以获得 合成耐旱相关蛋白所需要的氨基酸原料( k h a u u a - c h o p r a ，1 9 9 9 ) 。 2 5 脱落酸调节 作为植物内源激素之一的脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，简称a b a ) ，它不仅在植 物发育的诸多重要过程( 如胚胎发育、种子休眠与萌发等) 中起着调节作用，同 时也在植物对干旱等环境胁迫的反应中起着共同调节因子的作用。植物在干旱胁 迫下的一种主要生理变化是内源a b a 水平的显著增加( s k r i v e r ，1 9 9 0 ) ，a b a 积 累的作用在于作为抗旱性诱导激发机制的部分，抑制与活跃生长有关的基因，同 时活化与抗旱诱导有关的基因。l e o n a r d i 等( 1 9 9 5 ) 研究了a b a 、脱水和甘露醇 处理后a b a 应答基因的表达。其结果表明，脱水诱导a b a 应答基因表达在时间上 延迟，并被a b a 生物合成抑制剂所抑制，说明内源性的a b a 的生物合成和积累参 与了部分脱水诱导的基因表达，并通过a b a 调节的反馈机制来实现。 植物对水分亏缺的最初反应是通过减少气孔口来调节气孔开度，尽可能地减 少因蒸腾作用造成的水分散失。现在人们已经知道叶片上气孔的关闭是由根系在 干旱胁迫下产生的a b a 通过导管输送到叶片的气孔上实现的，但关于a b a 对气孔 的调节机制尚不十分清楚。近年来对a b a 作用受体位置的研究取得了一些新的进 展。a n d e r s o n 等对鸭趾草属植物的研究表明，保卫细胞内的a b a 并不参与抑制 气孔的运动，a b a 的作用受体位于保卫细胞原生质膜的外侧。但是，s c h w a r t z 等研究认为a b a 能从保卫细胞内调节气孔的开张度。 3 植物在干旱胁迫下诱导表达的基因及蛋白 3 1 植物在干旱环境胁迫下诱导表达的基因 许多植物基因的表达受干旱胁迫的诱导，并特异性地合成或积累许多蛋白， 以适应或抵抗干旱胁迫带来的不利环境状况，避免或减轻缺水带来的危害。 目前人们已经分离出许多受干旱胁迫诱导的基因，如糖代谢调节酶基因、合 成各种渗透调节因子( 糖类、脯氨酸和甜菜碱等) 所需酶基因、水通道蛋白和离 子通道蛋白等转运因子基因、细胞壁结构调节酶基因、蛋白合成、加工和降解所 需蛋白( 酶) 基因、去毒性蛋白基因( 可溶性环氧化物水解酶基因、过氧化氢酶 基因和抗坏血酸过氧化物酶基因等) 、信号转导和基因表达中所需的蛋白激酶基 1 4 干旱环境胁迫下的植物分子适应机理及其应用研究 因、磷脂酶基因和转录因子等调节蛋白基因、光合作用调节蛋白基因( 将c 。光 合途径转化为c a m 途径) 、f a s p ( h e a ts h o c kp r o t e i n ) 基因和渗透素( o s m o t i n ) 基因等。这些基因的功能有些是已知的，有些功能是未知的。这些基因编码的蛋 白进一步调节植物对干旱胁迫的生理生化反应，一方面增加细胞溶质浓度、降低 水势；另一方面，去除有毒物质( 如活性氧) ，以保护细胞膜、叶绿体、线粒体 膜，从而在一定程度上减缓缺水对植物造成的伤害。 3 2 植物在干旱环境胁迫下诱导表达基因的编码蛋白 根据作用不同，可将上面提高的与干旱胁迫相关基因所编码的蛋白分为两大 类，即功能性蛋白( f u n c t i o np r o t e i n s ) 和调节性蛋白( r e g u l a t o r yp r o t e i n s ) ( 见表1 1 ) 。