（农产品加工及贮藏工程专业论文）环介导等温扩增技术快速检测蜡样芽孢杆菌研究.pdf

摘要 蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见致病菌之一，食物暴露2 h 以上极易受污染，引起食 物中毒的食品多为乳制品，米饭等蛋白质含量多的食品。目前，国内检测食品中蜡样芽孢杆 菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要3 5 d 。本研究建立了一套用l a m p 技术快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，缩短了检测时问，提高检测方法的灵敏性。 环介导等温扩增技术( l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ，l a m p ) 是日本的 n o t o m i 发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点， 成为可以替代p c r 的新的核酸扩增技术。蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 在环境中广泛存在， 极易污染食品及食品原料，并且耐高温不易被杀死，可以产生导致呕吐和腹泻两种类型的食物 中毒。因此，建立l a m p 快速检测蜡样芽孢杆菌的方法对于控制蜡样芽孢杆菌的食物中毒具有重 要意义。 本研究针对蜡样芽孢杆菌的特异基因h b l d ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ra j 2 3 7 7 8 5 ) 设计引物， 用l a m p i j i 物在线设计引物软件设计引物，对内引物浓度、外引物浓度、m 9 2 + 浓度、甜菜 碱浓度、b s t 酶浓度等反应条件进行了优化，建立l a m p 反应体系。 l a m p 反应体系如下：f 3 与b 3 ( l a m p 反应外引物) 各5 p m o l i t l ；b i p 与f i p ( l a m p 反应 内引物) 4 0p m o l i - t l ：其它反应组分终浓度分别为：1 0m m o f ld n t p ，1 0m m o f lb e t a i n e ， 6 0 m m o l lm g s 0 4 ，2 5 i t lb s t 酶缓冲液( 2 0m m t r i s - h c l ( p h 8 8 ，2 5 0 c ) ，1 0m l v lk c i ，1 0m m ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，2h l mm g s 0 4 ，o 1 t r i t o nx - 1 0 0 ) ，l l x l ( 8 l db s t 大分子聚合酶，l 灿目标d n a ， 纯水补足体积到2 5 i t l 。扩增反应条件为6 2 保存1 h ，8 0 1 22 m i n 使酶灭活。 f t a 卡是用螫合剂和变性剂浸泡过的纤维基质，他可以在接触微生物时将其吸附并裂解细 胞，使d n a 吸附在纤维基质上。f t a 可以高效、快速、低损耗的提取d n a 。本研究将f t a 与 l a m p 方法相结合，检测蜡样芽孢杆菌。 对l a m p 快速检测蜡样芽孢杆菌的方法进行了评价，测定了其检出限，特异性，敏感性，符 合率，并与p c r 检测方法进行了对比。尝试了在反应产物中加入e b ，在紫外灯下快速观测反应 结果的试验。结果表明：l a m p 对抽提的d n a 最低检出浓度为4 4 c f u m l ，p c r 对d n a 最低检 出浓度4 4 c f u m l 。l a m p 对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的活菌浓度最低检出量为5 7 c f u m l ，而p c r 的检出限为5 7 c f - u m l 。l a m p 技术的灵敏度是p c r 的1 0 倍，并且比p c r 方便快捷。l a m p 扩 增最短可在2 0 m i n 内完成，对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测的整个检测过程( 包括d n a 提取1 h 、 l a m p 反应3 0 m i n 和电泳3 0 m i n ) 可在2 h 内完成。初步建立l a m p 检测蜡样芽孢杆菌的快速检 测方法，该方法灵敏度高、特异性好、耗时短，为食品中蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术 平台。 对实际样品进行检测，将l a m p 方法与国标标准g b 4 7 8 9 1 4 9 4 方法进行比较。确定l a m p 方法敏感性为1 0 0 ：特异性为7 2 7 ，符合率为9 4 5 。 关键词：环介导等温扩增；核酸；链置换反应；l a m p 蜡样芽孢杆菌；消毒乳 r a p i dd e t e c t i o no f b a c i l l u sc e r e u su s i n gl o o p - m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n a u t h o r ：q iz h e m a j o r ：p r o c e s s i n ga n ds t o r a g eo fa g r i c u l t u r ep r o d u c t i o n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gw e i a b s t r a c t b a c i l l u sc e r e u si saw i d e s p r e a db a c t e r i a lp a t h o g e nt h a tc a ni n f e c ta n i m i n a l sa n dh u m a nb e i n g s ， f o o dm u c he a s yb ep o l l u t e da f t e re x p o s e dm o r et h a n2 h t h ef o o d sm o s tp r o n et oc o n t a m i n a t i o nb y b a c i l l u sc e r e u sa r em i l lr i c ea n df o o dt oc o n t a i np r o t e i n i nr e c e n ty e a r s ，t h e r eh a v eb e e ni n c r e a s i n g r e p o r t so fb a c i l l u sc e r e u sr e l a t e df o o dp o i s o n i n g i n c r e a s i n gr a t e so fd e t e c t i o nm e t h o d st h a ta r e f a s t e r , m o r es p e c i f i ca n dh i 【g hs e n s i t i v e c u r r e n ts t a n d a r dd e t e c t i o nm e h t o d sr e q u i r el e n g h t yc u l t u r e e n r i c h m e n ts t e p st oi n c r e a s et a r g e tb a c t e r i a ln u m b e r sb e f o r ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o nc a nb e p e r f o r m e d l o o p - m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ( l a m p ) i san o v e ln u c l e i ca c i da m p l i f i c a t i o nm e t h o d d e v e l o p e db ye i k e nc h e m i c a lc o ，l t d ，j a p a n ，a n dh a st h ep o t e n t i a lt or e p l a c ep c rb e c a u s eo fi t s s i m p l i c i t y ，r a p i d i t y ，s p e c i f i c i t y ，a n dc o s t - e f f e c t i v e n e s s t h el a m pa s s a yh a se m e r g e da sap o w e r f u l g e n ea m p l i f i c a t i o nt o o lf o r t h er a p i di d e n t i f i c a t i o no fm i c r o b i a li n f e c t i o n sa n di sb e i n gi n c r e a s i n g l yu s e d b yv a r i o u si n v e s t i g a t o r sf o rr a p i dd e t e c t i o na n dt y p i n g b a c i l l u sc e r e u si sk n o w nt oc a u s et w od i f f e r e n t t y p e so f f o o dp o i s o n i n g ，w h i c ha r ec h a r a c t e r i z e db ye i t h e re m e s i so rd i a r r h e a a tp r e s e n t ，t w od i f f e r e n t p r o t e i nc o m p l e x e s ，e a c hc o n s i s t i n go f t h r e ee x o p r o t e i n s ，a sw e l la sas i n g l ep r o t e i n ( c y t o t o x i nk ) ，a r e d i s c u s s e da sc a u s a t i v ea g e n t s t h es p e c i f i cl a m pp r i m e r so fb a c i l l u sc e r e u sw e r ed e s i g n e do nt h eb a s i so ft h ep u b l i s h e d s e q u e n c eo fs t r a i nh b m ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ra j 2 3 7 7 8 5 ) w i t ht h el a m pp r i m e rd e s i g n s u p p o r ts o f t w a r ep r o g r a m ，u s i n gp r i m e re x p l o r e rs o f t w a r e t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no f p r i m e r ，t h e c o n c e n t r a t i o no f b s t ，t h ec o n c e n t r a t i o no f m 9 2 + ，t h ec o n c e n t r a t i o no f b e t a i n e 。 t h el a m pr e a c t i o nw a sc a r r i e do u ti na2 5 t t lt o t a lr e a c t i o nm i x t u r ev o l u m ew i t hc o n t a i n i n g 4 0p m o le a c ho f i n n e rp r i m e r sf i pa n db i p ，5p m o le a c ho f o u t e rp r i m e r sf 3a n db 3 ，1 0m m o l l e a c hd e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，1 0m m o l lb e t a i n e ，6 0 m m o l lm g s 0 4 ，2 5 t t lb s td n a p o l y m e r a s eb u f f e r ( 2 0m mt r i s - h c l ( p h 8 8 ，2 5 。c ) ，1 0m mk c i ，1 0m m ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，2m mm g s 0 4 ， 0 1 t r i t o nx 一1 0 0 ) ，8uo f b s td n a p o l y m e r a s e ，a n dt h es p e c i f i e da m o u n t so f t a r g e td n a t h e m i x t u r ew a si n c u b a t e da t6 2 。cf o r6 0m i ni nah e a t i n gb l o c ka n dt h e nh e a t e da t8 0 。cf o r2r a i nt o t e r m i n a t et h er e a c t i o n f t af i l t e r sa r eaf i b r o u sm a t r i xi m p r e g n a t e dw i t hc h e l a t o r sa n dd e n a t u r a n t st h a tt r a pa n dl y s e m i c r o o r g a n i s m su p o nc o n t a c t w i t hf i l t e 卜b a s e dt e c h n o l o g y ，t e m p l a t e sf r o mal o wn u m b e r so ft a r g e t c e l l sc a nb ep r e p a r e de f f i c i e n t l ya n dr a p i d l yw i t hm i n i m a lh a n d l i n ga n ds a m p l el o s s a na s s a yu s i n gl o o p - m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ( l a m p ) w a sd e v e l o p e df o r d i r e c t l y ，r a p i d l yd e t e c t i o no fb a c i l l u sc e r e u s t h es p e c i f i cl a m pp r i m e r so fb a c i l l u sc e r e u sw e r e d e s i g n e do nt h eb a s i so f t h ep u b l i s h e ds e q u e n c eo f s t r a i nh b l aa n dt h eg e n ew a sp u r i f i e db yf t af i l e r ， a l s of t a l a m pw a su s e db o t hi nb a c i l l u sc e r e u sa n di np a s t e u r i z e dm i l ko fb a c i l l u sc e r e u s u n d e rt h e o p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，ar a p i dt e c h n i q u ef o rd e t e c t i o no f b a c i l l u sc e r e u sw a si n i t i a l l ye s t a b l i s h e d b yl a m p t h el a m p a s s a yw a sf o u n dt ob e10 - f o l dm o r es e n s i t i v et h a nt h et r a d i t i o n a lp c ra s s a y ， d e t e c t i n g4 4 c f u m lo fb a c i l l u sc e r e u s t h el a m pd c 吐e c t i o nl i m i tw a s5 7 c f u m lo fp a s t e u r i z e dm i l k t h ei m p r o v e df t a - l a m pa s s a ye n a b l e sb a c i l l u sc e r e u st ob ed e t e c t e di nl e s st h a n2h ( c o n t a i nd n a p u r i f i e d ，l a m pa n du vt r a n s i l l u m i n a t o r ) c o n c l u s i o n ：l a m pa m p l i f i c a t i o nu s i n gf t af i l t e r sp r o v i d e s af a s t e ra n dm o r es e n s r i v em e t h o df o rb a c i l l u sc e r e u sd e t e c t i o nt h a nt h es t a n d a r dc u l t i v a t i o na n dp c r m e t h o da n di th a sh i g h e rs p e c i f i c i t y f o rt h er a p i dd e t e c t i o no fb a c i l l u sc e r e u si nf o o db u i l da t e c h n o l o g yp l a t f o r i l l i nt h i ss t u d y ，l a m pw a sm a d e t h er e s u l ti n d i c a t e s ：t h es e n s i t i v i t yo f t h el a m p a s s a yi s1 0 0 ， t h es p e c i f i c i t yi s7 2 7 ，a n dt h ec o i n c i d e n c er a t ei s9 4 5 k e y w o r d s ：b a c i l l u sc e r e u s ；c h a i ne n z y m er e p l a c e m e n t ；l a m p ；l o o p - m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n ；n u c l e i ca c i d ；s t r a n dd i s p l a c e m e n tr e a c t i o n ；p a s t e u r i z e dm i l k 本文所用缩略词及中英文对照 缩略词英文全称中文全称 a - m u g4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l adg l u c o s i d e4 甲基伞形酮ad 葡萄糖苷 b a m b a c t e r i o l o g i c a la n a l y t i c a lm a n u a l细菌分析手册 c b i c o l o n yb l o ti m m u n o a s s a y菌落吸附免疫测定法 c f u c o l o n g f o r m i n g & n b s pu n i t s经培养所得菌簇形成单位英文缩写 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e ee n t e r o b a c t e r i a c e a ee n r i c h m e n tb r o t h肠道菌增菌肉汤 e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验 e m b e o s i n m e t h y l e n eb l u ea g a r伊红美蓝琼脂 f d au s f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o nc e n t e r 美国食品药品监督管理局 f q p c rr e a lt i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r实时荧光定量p c r f t af l i n d e r st e c h n o l o g ya s s o c i a t e s弗林德斯技术联合 i c m s ft h ei n t e m a t i o n a lc o m m i s s i o nf o r国际食品微生物标准化委员会 m i c r o b i o l o g i c a ls p e c i f i c a t i o n sf o rf o o d s i d fi n t e r n a t i o n a ld a i r yf e d e r a t i o n国际乳品联盟 i f pi n f a n tf o r m u l ap o w d e rm i l k婴儿配方奶粉 i p t g i s o p r o p y lp d 一1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基p d 一硫代半乳糖苷 l a m p l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n 环介导等温扩增 l bl u r i a _ b e r t a n i营养肉汤 m p nm o s tp r o b a b l en u m b e r最大可能数 m y p m a n n i t 0 1 e g g - y o l k - p o l y m y x i na g a rb a s e 甘露醇卵黄多粘菌素选择培养基 n a n u t r i e n ta g a r营养琼脂 r a p dr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多态性 p e p p c r r e p e t i t i v ee l e m e n ts e q u e n c e b a s e dp c r 重复序列引物聚合酶链反应 r p l a r e v e r s e dp a s s i v el a t e xa g g l u t i n a t i o n ，反向被动乳胶凝集试验 p b s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n磷酸缓冲盐溶液 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p f u p o l y u r e t h a n ef o a mu n i t嗜菌斑形成单位 r p m r o u n dp e rm i n u t e转每分钟 t a et r i s b o r a t ea c i d e d t ab u f f e r t r i s 醋酸e d l a 缓冲液 t a q t h e r m u sa q u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e嗜热水生菌d n a 聚合酶 r et r i sb a s e e d t ab u f f e rt r i s e d t a 缓冲液 t r i s ir i s h y d r o x y m e t h y l - a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 uu n i t酶活单位 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得煎皇垦壑些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名布锈 签字日期如8 年多月帅 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盎些基堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇垦盛些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：才錾 签字日期：跏芬年彭月肋日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 谰唪 签字日期：。7 驴孝年月汐日 电话： 邮编： 环介导等温扩增技术快速检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌研究 1 1 立题的背景和意义 1 引言 蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 是一种革兰阳性杆菌，能形成芽孢，在周围环境中广为存在， 其中一些菌株极易污染食物而引起食物中毒，特别是在蛋白质和碳水化合物含量丰富的食品中， 如乳类、米饭、奶制品、腐乳、鱼、烧鸡等中。因食品没有明显的腐败现象，除有时稍有发粘、 口感不爽外，感官基本正常，由于不易察觉，误食几率较大。此类蜡样芽孢杆菌主要引起8 种类 型的食物中毒症状，主要表现为呕吐及腹泻症状；此外，它们还能引起伤口及眼睛的感染等其他 一些非肠胃性感染【h2 1 。 蜡样芽孢杆菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，能形成芽孢，在周围环境中广泛存在。通常对 蜡样芽孢杆菌的检测鉴定主要依据其毒素的有无，以及是否具有溶血性等生化特性p j 。蜡样芽孢 杆菌的分类地位为芽孢杆菌属的第1 群，该群有2 2 个种。根据营养型蜡样芽孢杆菌细胞的宽度分 为两类，蜡样芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属“大 细胞菌种 。 我国对蜡样芽孢杆菌目前采用的方法是以国家标准g b 1 4 9 3 8 9 4 及检验检疫系统行业标准 w s t 8 2 1 9 9 6 作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5d 左右，既费时又费力，并造成货物 积压，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较大的经济损失【4 1 ，国内外均建 立了采用p c r 技术对蜡样芽孢杆菌进行快速检测的技术【5 7 1 。 蜡样芽孢杆菌食物中毒，是一种常见的食物中毒。第一起蜡样芽孢杆菌食物中毒的完整报告 在1 9 5 0 年发表于挪威，随后许多国家，特别是北欧和东欧国家也报告有类似的食物中毒爆发。 1 9 7 1 年以来英国也报告过多起蜡样芽孢杆菌食物中毒。我国于1 9 7 3 年南京市卫生防疫站，1 9 7 4 年鞍山市卫生防疫站相继报告蜡样芽孢杆菌食物中毒以来，近几年来又有一些单位报告了本菌引 起的食物中毒。蜡样芽孢杆菌分布比较广泛，在土壤和植物上及许多食物上都能分离到。引起食 物中毒的食品必须含有较大量的细菌，每克或每毫升食品中约需含1 0 7 个以上的蜡样芽孢杆菌。 蜡样芽孢杆菌从1 9 5 5 年开始被认定为食品常检出致病菌，每年疾控中心只有很少关于此类 菌的检测报告。据统计，1 9 8 6 年至1 9 7 2 年有5 2 起蜡样芽孢杆菌爆发的报导，估计这个数只占这 一时期爆发总数的2 。 我国每年由于蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件也很多，如l ，l ： 2 0 0 4 年8 月，沈阳市某发生一起食物中毒，造成1 5 名服务人员发生食物中毒，经证实为一 起蜡样芽孢杆菌引起的食物中掣引。 2 0 0 4 年1 0 月，松潘县7 5 名学生因在镇中小学校回族和汉族食堂就餐发病。根据流行病学调 鉴定为蜡样芽孢杆菌中毒 9 1 。 2 0 0 3 年6 月2 7 日，驻马店市中医院急诊科报告，市驿城区一所中学发生食物中毒，经调查 确认是食用被蜡样芽孢杆菌污染的米饭引趔1 0 l 2 0 0 3 年9 月2 2 日上午，深圳市盐田区某小学学生饮用学生奶导致2 1 人出现腹痛、头晕、恶 心、呕吐等症状，经流行病学、现场卫生学调查、结合临床表现和实验室检查，证实为一起蜡样 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 芽孢杆菌污染学生奶而引起的食物中毒【i i l 。 2 0 0 5 年3 月2 日，北京某区广安中学、北线阁小学、康乐里小学学生中午进食某快餐公司配 送的学生营养餐后，部分掺有剩余牛乳，共有1 3 4 人发病。证实为蜡样芽孢杆菌污染【1 2 】。 1 9 9 8 年6 月1 2 日，某部暴发一起急性腹泻l o 例，经临床分析和病原学检测，证实为蜡样 芽孢杆菌所致【h 1 。 n i c o l aj t u r n e r 等【1 4 l 报导了在脱水的马铃薯片及马铃薯制成的速食食品引起的食源性传染 病，试验证明，在5 0 份样品中只有少量的样品带有蜡样芽孢杆菌，如果在6 0 。c 以上，或者买后 2 h 内吃这些食物，都不会有任何危险，但是放置2 h 以上时，蜡样芽孢杆菌开始繁殖，致病几率 逐渐增加。 蜡样芽孢杆菌食物中毒常因症状较轻而被漏报，而据我国食品污染物和食源性疾病监测网络 统计，2 0 0 3 年蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4 o ，已位列细菌性食物中 毒的第四位。而实际数据很可能远大于各国官方报道，并且有增长的趋势【1 5 】。蜡样芽饱杆菌在临 床上可引起自限性的食物中毒。近年来，国外陆续报道，在机体免疫力低下或消耗性疾病时，其 可作为条件致病菌而导致菌血症、败血症、脑膜炎、肺炎、肝脓肿和软组织感染。尤其在血液病 患者和低体重新生儿中，引发败血症的概率更大，致死率也很耐1 6 】。 有时候由这些蜡样芽孢杆菌所引起的食物中毒会被忽视，因为由这类蜡芽孢杆菌引起的食物 中毒与其他病菌引起的食物中毒症状非常相似，往往引起误诊，如由蜡样芽孢杆菌引起的呕吐性 食物中毒与产肠毒素的葡萄球菌具有相似的症状，而由蜡样芽孢杆菌引起的腹泻型食物中毒与由 产气夹膜梭菌感染具有相似的症状，但通常由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒一般比较温和，且不 会持续2 4 h 1 7 1 目前这些蜡样芽孢杆菌污染问题已是普通饮食及公共餐饮业存在的一个主要的问 题。如s u n y o u n gl e e b s l 检测年糕中的蜡样芽孢杆菌，年糕在1 0 0 c 蒸3 0 m i n 后，芽孢的数量降 至1 o x l o 1c f u g 1 o x l o 五e f u g ，但是如果常温放置2 4 h ，又达到了产毒素的数值( 1 o x l o r 6 c f u g ) 。由于这些的蜡样芽孢杆菌及其孢子广泛存在，不能完全避免，因此需要发展一种快速的 检测方法来实现对这些的蜡样芽孢杆菌进行检测。从而对食品加工过程进行质量控制，提高食品 的安全性。 本试验建立了一种利用l a m p 技术来检测蜡样芽孢杆菌的方法，以溶血素h b l a 基因作为检 测蜡样芽孢杆菌的目的基因，通过设计合适的l a m p 引物，特异地扩增出致病蜡样芽孢杆菌的溶 血素h b l a 基因，从而实现对该类蜡样芽孢杆菌的快速检测。 1 2 蜡样芽孢杆菌简介 蜡样芽孢杆菌在食品上，于2 0 以上的环境中放置，能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由 于本菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。蜡样 芽孢杆菌食物中毒的诊断，很多是根据流行病学线索，中毒食品检出大量的蜡样芽孢杆菌 1 0 6 c f u g 作为食物中毒的判断依据。食品中污染蜡样芽孢在室温内( 1 6 q o ) 即易繁殖产生肠毒素， 故肉类、奶类及剩饭等熟食品只能在低温短期时间存放。剩饭等熟食品只能在低温短期时间存放。 剩饭等熟食品即使在食用前加热煮沸，蜡样芽孢菌的芽孢也不易死亡。 2 环介导等温扩增技术快速检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌研究 1 2 1 蜡样芽孢杆菌生物学特征 1 2 1 1 形态与染色 本菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽孢呈椭圆形，不突出菌体，位于菌体中央 稍偏一端，芽孢较菌体小。 1 2 1 2 培养特性 1 ) 需氧菌，生长温度范围在1 0 c 一4 5 c 之间。最适生长温度为2 8 3 5 。 2 ) 对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色， 不透明，边缘不整齐，直径为4 - - 一6 m m ，菌落边缘往往呈扩散状，表面稍干燥。 3 ) 在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。在菌落周围初呈草绿色溶血， 时间稍长即完全透明。 4 ) 在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。 1 2 1 3 血清学特性 蜡样芽孢杆菌产生一种催吐e t e 和三种肠毒素：h b l ，n h e ，e n t k 。其中h b l 和n h e 是引起 食物中毒的肠毒素，这些不同的蛋白质亚基单位共同作用，其中h b l 既是肠毒素，又是溶血素 基因，这些亚基有破坏细胞膜的作用，所以对细胞和细胞膜产生毒性。 催吐毒素e t e 是环状结构，分子量1 2 千道尔顿，钾离子载体，所以p h 值范围达到2 ll ， 耐热，不易裂解。 n h e 和h b l 基因都是致腹泻基因，n h e 分n h e a 、n h e b 、n h e c 三个基因型，这三个基因编码 组成n h e 的操纵子，通过在大肠杆菌里克隆表达这三种基因，发现，三个基因共同制约生物活性。 h b l 由h b l c 、h b l d 、删蛋白编码，其中l l 、l 2 、b 基因构成溶血素，这种毒素也具有皮 肤坏死和血管渗透性的作用，在兔子实体试验中也具有回肠积水的破坏性后果。蜡样芽孢杆菌有 两种抗原，一种是耐热的，一种是不耐热的。 1 2 1 4 生化性状 表l蜡样芽孢杆菌生理生化特性【1 9 刎 t ，l b i elc h a r a c t e r i s t i co f b a c i l l u sc e r 8 1 1 s + ：9 0 - - 1 0 0 的菌株阳性：一：9 0 一1 0 0 的菌株阴性：d ：反应不同1 0 - - 9 0 的菌株阳性 1 2 2 蜡样芽孢杆菌致病性 蜡样芽孢杆菌引起食物中毒，除了必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病毒素。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 蜡样芽孢杆菌产生的肠毒素有两种 1 、耐热性肠毒素：1 0 0 c 3 0 m i n 不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。 2 、不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种食物中形成。 1 2 3 蜡样芽孢杆菌临床症状 食用被蜡样芽孢杆菌污染的食品后，一般在8 1 6 h 内出现中毒症状，可分为呕吐型和腹泻型， 或两者兼有。呕吐型症状以恶心、呕吐为主，并有头晕、四肢无力等；腹泻型以腹痛、腹泻为主。 中毒症状8 3 6 h 可消失，一般不会导致死亡。 呕吐型中毒多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2 。3 h ， 最短为3 0 m i n ，最长5 巧h ；中毒症状：呕吐，腹痉挛，腹泻则少见，一般经过8 , - - l o h 而治愈。 腹泻型中毒由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6 h 以上，一般为“1 4 h ；中毒症状： 腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程2 4 3 6 h 。 1 2 4 蜡样芽孢杆菌流行病学 1 2 4 1 季节性特点以夏、秋季，尤其是“1 0 月为多见。 1 2 4 2 食品种类包括消毒乳、肉类食品、蔬菜、米粉、米饭等。 1 2 4 3 食物中蜡样芽孢杆菌的来源 肉及制品的带菌率为1 0 , - , 2 6 ，乳及制品带菌率为2 3 一7 7 ，食品中该菌的污染源主要 是泥土、尘埃、空气，其次是昆虫、苍蝇、不洁的用具等。如果食用前不加热或加热不彻底，即 可引起食物中毒。中毒食物多无腐败现象，但大都经过加热处理，馊饭引起食物中毒在我国多见， 而国外则主要是乳制品，这可能是由于不同国家之间的食物构成有差异。 蜡样芽孢杆菌分布广泛，特别是在谷物制品中。主要通过泥土、灰尘、昆虫、不干净的食具 和食品从业人员传播。夏、秋季多发，中毒食品主要为剩米饭、米粉、甜酒酿、剩菜、甜点心及 乳、乳类食品。中毒多因食品在食用前保存温度较高( 2 0 以上) 和放置时间较长。 紧急处理：停止食用可疑污染的食品，多饮水。一般不需要使用抗生素治疗。腹泻较重者可 到医院就诊。 中毒预防：蜡样芽孢杆菌在1 5 ( 2 以下不繁殖，剩饭、剩菜应放在低温保存。该菌污染的食品 一般无腐败变质的异味，不易被发觉。因此，剩饭、剩菜在食用前一定要再加热。注意食品的贮 藏和个人卫生，防止尘土、昆虫及其他不洁物污染食品。蔬菜和不锈钢用具在使用前可以用含氯 的洗涤剂清洗，以达到除菌的效果【2 。 1 3 食源性致病菌的相关检测方法 1 3 1 微生物专用酶快速反应系统的检测技术： 根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物 和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离 的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。 4 环介导等温扩增技术快速检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌研究 1 3 2 利用肠毒素的快速检测方法 1 3 2 1 免疫学方法 检测蜡样芽孢杆菌肠毒素的免疫学方法主要有乳胶凝集试验( i m m u n o - l a t e xa g g l u t i n a t i o n i n h i b i t o r yt e s t ) 、免疫扩散法、反向间接凝血试验( r p h a ) 、反向被动乳胶凝集试验( r e v e r s e dp a s s i v e l a t e xa g g l u t i n a t i o n ，r p l a ) 、放射免疫法( r i a ) 、免疫荧光技术( 用荧光素标记的抗体检测抗原或 抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术) 、酶联免疫测试技术( e l i s a ) 及免疫印迹法 ( i m m u u n o b l o t t i n g ) 。 1 3 2 2 基因探针技术 自1 9 7 5 年s o u t h e r n 首次提出了d n a 探针杂交技术以来，d n a 探针技术在许多方面都已获 得了改进和发展。基因探针技术检测微生物的依据是核算杂交，其工作原理是2 条碱基互补的 d n a 链在适当的条件下可以按碱基配对原则，形成杂交d n a 分子。已知每个生物的各种性质和 特征都是由其所含的遗传基因所决定，因此，从理论上讲，任何一个决定生物体特定生物学特征 的d n a 序列都应该是独特的。通过将微生物的特征基因的一条d n a 链进行标记，即可制成d n a 探针。戴亚斌等用基因芯片技术成功的检测出蜡样芽孢杆菌等细菌。 1 3 2 3 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np c r ) 技术 常用方法有p c r 、限制性片段长度多态性( p c r - - r f l p ) 、多重p c r 、等位基因特异性扩增、 随机引物扩增d n a 多态性分析舭p d ) 分型技术等；荧光标记的高通量o l i g h - - t h o u g h p u t ) 基因型检 测则日益普及，如寡核苷酸连接分析、杂合子直接测序等：而高密度芯片阵列分析和质谱分析( m a s s s p e c t r o m e t r y ) 是基因型检测的最新技术。新的基因突变或多态性可通过构像突变筛查和杂合子的 直接高通量来测序。c h a n gyh 等【2 2 1 和v e s am 等口3 i 分别报导了用p c r 方法检测肠毒素。a r t u r or r 掣2 4 j 用r e p e t i t i v ee x t r a g e n i cp a l i n d r o m i cs e q u e n c e b a s e dp c r 方法对蜡样芽孢杆菌进行了型的 分离。 1 3 2 4 气相色谱和高效液相色谱的分析的应用 主要是依据不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱检查可直接分析 各种体液中的细菌代谢产物、细菌中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肤、多糖等，以确定病原微生 物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多。尽管该法具有简单、 快速、可靠，在数小时内即可得出结果的特点，但由于使用的仪器设备相对比较昂贵，所以不适 应现场的快速检测，特别是食品加工过程中的h a c c p 中的关键控制点的检测；另外其特异性也不 明显。 1 3 2 5 生物传感技术 生物传感科学是一门新兴的交叉学科，它主要是由生物工程和各种技术学科的相互渗透发展 起来的。生物传感器的原理是将待测定底物在特定的酶或细胞存在下转化为产物，产物与底物浓 度成正比，可用电化学准确测定。生物传感器由于将生物活性物质专一识别功