（农产品加工及贮藏工程专业论文）芽孢类细菌超高压处理技术研究——以草莓汁加工为例.pdf

台肥工业大学博士学位论文 摘要 草莓、西瓜、猕猴桃等果汁具有热敏性，加热处理会产生异味。采用超高压杀菌技术可 有效保持热敏性果汁的营养价值和天然风味。在超高压杀菌申，最难杀灭的是芽孢类细菌。 本文以“丰香”草莓( 产于安徽省长丰县) 为对象，对未经杀菌处理草莓汁的细菌进行鉴别； 通过超高压处理试验，考查压力对芽孢菌的孢子萌发诱导、营养体致死效应、代谢酶类以及 修复生长的影响；利用神经网络模型对超高压加工草莓汁的货架期进行预测，结果表明： 1 依据国家食品卫生标准，对未经处理的草莓汁进行微生物学检验，查明 草莓汁中微生物种类丰富，包括细菌、霉菌和酵母菌，细菌总数、大肠菌群和霉菌酵 母菌均超出国家食品卫生标准； 草莓汁携带的细菌主要有1 7 种( 分别属于9 科、“属) ：尿放线抨菌a c t i n o b a c i l l u s u r e a e 、少动鞘氨醇单胞菌s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i s 、溶血巴斯德氏菌p a s t e u r e l l a h a e m o l y t i c a 、荧光假单胞菌p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 、恶臭假单胞菌p s e u d o m o n a s p u t i d a 、成 团泛菌p a n t o e aa g g l o m e r a n s 、阴沟肠杆菌e n t e r o b a c t e rc l o a c a e 、阿氏肠杆菌e n t e r o b a c t e r a s b u r i a e 、弗氏柠檬酸杆菌c i t r o b a c t e r f r e u n d i i 、布氏柠橡酸杆菌c i t r o b a c t e rb r a a k i i 、放射土 壤杆茹a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r 、根癌土壤杆菌a g r o b a e t e r i u mt u m e f a c i e n s 、鲁氏不动杆菌 p r e s u m p t i v ea c i n e t o b a c t e rl w o f f l 、沙门氏菌s a l m o n e l l as p e c 妇、耳葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u s a u r i c u l a r i s 、科氏葡萄球菌s t a p t o c o c c u sc o h n i i 和蜡样芽孢杆菌b a c i l l u sc e r e u s ； 蜡样芽孢杆菌是草莓汁的优势芽孢菌，对压力具有强对抗性，难以杀灭，且能导致食 物中毒，因此，设定该菌为草莓汁的杀菌指示菌。 2 采用梯度施压、温度协同处理蜡样芽孢杆菌，发现： 2 0 0 - - 3 0 0m p a 的超高压处理具有促进蜡样芽孢杆菌孢子萌发的作用，采用中等温度 协同，可诱导芽孢基本齐一萌发； 蜡样芽孢杆菌营养体的致死率( y ) 与压力( x 1 ) 、温度( x 2 ) 、时间( x 3 ) 存在下列 、，t 1 合肥工业大学博士学位论文 关系 y = 6 2 8 + 2 7 2 五+ 7 3 x 2 + 3 。2 x 3 + l 。o # + 2 6 + l 。o - 2 o x i x 2 - 1 o x l x 3 - 0 7 x 2 x 3 超高压具有诱导芽孢萌发和杀灭营养体的双重作用。先利用较低的压力促进芽孢萌 发，继而采用较高的压力杀死营养体，可高效杀灭芽孢菌。 3 通过受压蜡样芽孢杆菌的损伤检测与修复生长研究揭示 超高压处理对蜡样芽孢杆菌的碳源物质利用能力产生了影响，如在不同强度的压力处 理后，该菌增加了对多种小分子糖类的需求 超高压处理使蜡样芽孢杆菌的a t p 酶和s o d 酶活性下降 经超高压处理，蜡样芽孢杆菌的药物敏感性也发生了变化# 超高压处理后，残存的蜡样芽孢杆菌可修复生长。其生长规律为：延滞期与压力之间 存在二次曲线关系( r 2 ：0 9 8 5 7 ) ：最大生长速率与压力关系符合l o g i s t i c 模型( r 2 = o 0 9 7 9 1 ) 。 4 运用神经网络软件，以指示菌的数量为限量指标，建立了超高压加工草莓汁货架期的 预测模型。模型达到显著水平，决定系数0 9 9 9 8 ，均方差2 4 1 7 ，相对偏差 1 8 ，将d n a 溶于l x s s c 缓冲液中，以e c o f i d n a 为参照，自动恒温水浴，7 5 2 分光光度计2 6 0 h m 检测，a 2 6 0 读取速率为1 次，取a 2 6 0 中点 值为t m 值。 2 2 结果与讨论 2 2 1 草莓汁的卫生微生物学检验 按照食品检验程序，分别对5 批采集样品及时进行卫生微生物学检验，结果见表1 。从 表1 可以看出由于季节和采集地点不同，草莓汁的微生物数量存在差异，春夏之交的草莓远 高于春季和冬季的，经过运输环节的高于直接采自种植基地的。总体上看，草莓汁的含菌量 高。一方面，草莓顺地生长，直接接触和感染土壤微生物；另一方面，草莓为喜温湿植物， 一般适宜生长温度1 8 - - 2 5 c ，湿度6 0 ，冬季生产依靠温棚维持，而温湿环境也为微生物 的生长繁衍提供了良好条件。因此，草莓细菌总数、大肠菌群和霉菌酵母菌含量均高。我国 食品卫生标准规定直接食用食品的细菌总数不超过1 0 0c f u g 。可见，在生活中将直接食用 未经处理的草莓鲜果或鲜榨汁是不可取的，应采取必要的消毒除菌措施。 第二章草莓汁的细菌快速鉴别与指示菌设定 1 7 表2 - l 草莓汁的卫生微生物学检验结果 t a b 2 1r e s u l t so f h y g i e n i c a lm i c r o b i o l o g ye x a m i n a t i o nf o rs t r a w b e r r y j u i c e 2 2 2 草莓汁中非芽孢细菌的v i t e k 鉴定 在对草莓汁细菌进行分离的基础上，通过纯培养获得了1 6 株非芽孢细菌，分别记为b t 、 b 2 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 7 、b 8 、b 9 、b l o 、b i i 、b 1 2 、b 1 3 、b 1 4 、b 1 5 、b 1 6 采用v i t e k 3 2 对 这些细菌进行鉴定。表2 、3 列出草莓汁中非芽孢细菌的生化反应特征( 阳性反应记为“+ ”， 阴性反应记为“一”) 及菌名，其中表2 为革兰氏阴性菌，1 4 种；表3 为革兰氏阳性菌，2 种。 鉴定菌名依序分别是：尿放线杆菌a c t i n o b a c i l l u sw e a e 、少动鞘氨醇单胞菌s p h i n g o m o n c a p a u c i m o b i l i s 、溶血巴斯德氏菌p a s t e u r e l l ah a e m o l y t i c a 、荧光假单胞菌p s e u d o m o n a s f l u o r e s e e m 、 恶臭假单胞菌p s e u d o m o n a s p u t i d a ，成团泛菌p a n t a e aa g g l o m e r a n s 、阴沟肠杆菌e n t e r o b a c t e r c l o a c a e 、阿氏肠杆菌e n t e r o b a e t e ra s b u r i a e 、弗氏柠檬酸杆菌c i t r o b a e t e rf r e u n d i i 、布氏柠檬 酸杆菌c i t r o b a c t e rb r a a k i i 、放射土壤杆菌a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r 、根癌土壤杆菌 a g r o b a e t e r i u mt u m e f a c i e n s 、鲁氏不动杆菌p r e s u m p t i v ea e i n e t o b a c t e rl w o f f i 、沙门氏菌 s a l m o n e l l a s p e c i e s 、耳葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u s a u r i c u l a r i s 和科氏葡萄球菌s t a p t o c o c c u sc o h n 甜 根据伯杰氏细菌鉴定手册，这1 6 株细菌，分别属于8 科、1 0 属，且在土壤中均有分布1 1 0 9 1 。 草莓果实贴地生长，这些细菌可能直接来源于土壤。 + + + + 斗 牟 + + + ， 卜 、 卜 、 、_ ， 一 、 ， ， 卜 + + 卜 卜 + + 卜卜 + + + + + + + + ， + + + +。- + + + +卜卜， + + + p + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 卜卜i + + + + ；i i i i +f： ，f i i+n1日 ； + + + l + + i g ，i+j i i ， 卜，十 + + + 十 + + + + + p + + 十 f 广 卜p卜l， 十 十宝曲 + + a + 砷+ l 丑 + 寸 + + n + + 看 + +十+ ； i + i ，+ + 墨一x0蚕1鹭f119善墓是篁n03量on一3ns蜃参量重量ovl枣q工塞量。兽一1d 3s畚39薯d0 【on口hnon冷葛z纣iz是口一兰譬口一2 1 n _ 2 一i _ 2 口 p 口 ” 口 n h _ oz d苫一窨aq事譬c=zo壹哥譬copl 2墨巷。琶g口暑 眯豁假醐ino墨诅爵导t埔瓣qn礤 杈髫掣秘书鞋扑k爿h譬如 兰 第二章草莓汁的细菌快速鉴别与指示菌设定1 9 续表2 - 2 n o 鉴定菌名i d e n t i f i e dm i c r o o r g a n i s m s 尿放线杆菌a c t i n o b a c i l l u su r e o e 少动鞘氨醇单胞菌s p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s 溶血巴斯德氏菌p a s t e u r e l l ah a e m o l y t i e a 荧光假单胞菌p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 恶臭假单胞菌p s e u d o m o n a s p u t i d a 弗氏柠檬酸杆菌c i t r o b a e t e r f r e u n d i i 布氏柠檬酸杆菌c i t r o b a e t e rb r a a k i i 鲁氏不动杆菌p r e s u m p t i v e a c i n e t o b a c t e r l w o 痹 注：1 d p 3 ，三氯新；2 o f g , 葡萄糖氧化；3 g c ，阴性生长控制；4 a c e ，乙酰氨；5 e s c ，七叶苷；6 p l i ， 植树尿蓝母；7 u r e , 尿素；8 c i t , 柠檬酸盐；9 m a l ，丙二氨酸；1 0 t d a ，苯丙氨酸；1 1 p x b ，多粘菌 素b ；1 2 l a c ，乳糖；1 3 m e t , 麦芽糖；1 4 m a n ，甘露糖；1 5 x y l ，木糖；1 6 r a f , 棉子糖；1 7 s o r , 山梨 醇；1 8 s u c ，蔗糖；1 9 i n o ，肌醇；2 0 a d o ，侧金盏花醇；2 1 c o u ，香豆素；2 2 h 2 s 硫化氢；2 3 o n p , p 半 乳糖苷酶；2 4 r h a ，鼠李糖；2 5 a r a ，阿拉伯糖；2 6 g l u ，葡萄糖；2 7 a r g , 精氨酸；2 8 l y s ，赖氨 酸；2 9 o r n ，鸟氨酸；3 0 o x i ，氧化酶；3 1 t l a ，l o 乳糖 西 & m m 良 良 晰 鲰 踟 鲫 卧 胁 邸 阱 + + 瓣*j卜xio鳝挺霹mn一辩“蜡士，一qn一船键z1苫pq繇潮j曾n口咀瓣煨墓1sn一娶璐1fld葛一斑匾区。牟d瓮一撂晕氧匿崔v一骆蟋嫩盘工-_镰磐糍u3岛一链球茸出ool锻爆*j西_一罄露。矗一磬麟扭z、1r寸一一器辞u1一一锯帮糖档幅备口，!一黼蚶删辐aozcl一割1葶目卫事酲馨ki毒蓦嚼脚配1i一甾蓍冀釜。一一鹾靛掣墨 斑玺孵uz，6枷4廿苹uq一鹫幂。弋皿。吨厶毒留爨。一鲁r9一器睾嘬摹口u719n避懈翳如扑u h毫举常钿球工don一签褪七un一避皿强d一一埘 曼f毒888dj鲁豸粗钎籽掘噬碡 gsig嚣18g葛薯opi婶随心鲥 + + 0 + + + + + + 口1 日 )(i_配，1unj=一=jni，ifl厶酲卜厶$_m盈卜uflo一篮z苫ur1)(叫凸oz酲up田s口配uzu叫o寸皿。一uzu工dou o n a n n h n 口n h 寸n n n n n 式o n m _ _ 【 2 h n h ： n _ 【 g = o _ 【 a - 口 n t n h _ l o z p3l，一分譬i扫计ul一山。占口篇善c。pi 2p事时仨d_冀c-“母芦 碟早彳设鞘h-o g溜再壬女黼瓣c-n懈 似嵇辽扑书鞋扑k爿h鐾啦 第二章草莓汁的细菌快速鉴别与指示菌设定 2 l 2 2 3 草莓中芽孢菌的鉴定与确认 在纯培养的基础上，经过初检。获得了4 株革兰氏阳性芽孢菌，分别记为y l 、y 2 、y 3 、 y 4 ，采用以下4 种检测手段进行观察与鉴定。 2 2 3 1 菌体与芽孢形态1 1 0 l 图2 3 分别为y 1 、y 2 、y 3 、y 4 的染色显微照片，菌体均为杆状，星链状排列或散列，每 个菌体均有一个明显的芽孢，芽孢成椭圆形，位于菌体中央或稍偏于一端，不突出菌体，菌 体不膨大。 图2 - 3y l 、y 2 、y 3 、y 4 的菌株及芽孢形态观察( x 1 0 0 0 ) f i g 2 3 i m a g e so f s t r a i n a n d i t ss p o r e o f y z 、y 2 、y 3 a n d y 4 ( 1 0 0 0 ) 2 2 3 2 芽孢菌的v i t e k 鉴定结果 在确立4 菌株y l 、y 2 、y 3 、y 4 为芽孢菌后，采用b a c 检测卡，通过v i t e k 微生物自 动鉴定仪作菌种鉴定，生化反应及结果见表2 4 。表2 4 显示，4 菌株均为蜡样芽孢杆菌，可 信度分别为9 9 、9 8 、8 9 和9 2 。以标准b a c i l l u sc e r e u sc m c c ( 1 3 ) 6 3 3 0 1 ( 记为s ) 为参 照，y l 与标准相同，y 2 仅在k c n 药敏性上不同，y 3 差异最多，在蔗糖、淀粉、七叶苷水解， k c n 药敏四个指标上有差异；y 4 在蔗糖、淀粉水解上存在差异。可见四株蜡样芽孢杆菌在 个别生理生化指标上存在差异。可能的原因是各菌株来自不同批次的草莓汁。 + + + 声 m ；拳；霉 腰蝰楹雅謦蚕h一ic一缸吉甲o噼6街世蛾z瓮一榴蠲撼噤迥d，d篙一髓挥医9iv&一器掰fzvv卜r口n一懈神嚣#do一斑钴fz将系塞葛一幂基1毒摹007辱一驻皋z91目一蜜璐捃似善、l，一n餐磬帮龌密t2_ndno媳镟禚目茁o6i一罄留j岛i懿麟赡目皇一链账件工，h乏口i姆3军盘盈”_i一姆嫘p舀=一忸u忸机oni懈耀*一hi锯件冀d_【h一鞭瞄 扭z蔓oi一锯*，i卜嚣舞皿1掰医矗一辩赤升一ql枯鑫onll9姆薄掘3jo吐辨蹿攻口工l毫割酵目蝌叠n卜c颦糍u3瞳犁蟮掣墨j田z，一一捌 墅8皇罄u蔷韫靶最豫枯蛰蔷ni芒a。镎毒8艋士艘酶世蛰。五器 嚣童躅韫靶耀牧妻蛰摹m 苦甚西楹毒幕豫妻餐求na (10nn口一邑uu苫ov嚣皇毫s岣韫蜒艘敞妻蛰 是曾矗io哥毫芒。pi郇祖链鲋 + ；+；卜+ ；十+ ，+ ；+ + + i + + + + ，i + + + 十 + ，+ + + + i i + + + + ，+ 十 f i卜 + ，+ 。+ 十 0 + 善。s鬯zl爱vvz 010蚕。景重】i爱。vz0s1d管宣hnn一窖rivs鼍nvif，1j1)(善1vo呈h f11。啦普gzl。n留z n o n 夺“ n 卜一 心n n n 寸n n n n n o a 一 一 f 一 口_ 【 n 一 寸一 n 一 一一 一_ l o a 卜 。 呐 寸 n 一 一 oz 廿q!n一言aq事要ui u雪可。譬爸opi 2ap钾耄娃哂寸n言 眯摄硝洲u出譬溜照豫廿嫦斟寸n懈 杈秘掣扑鞋扑k爿-上鐾如 一一 第二章草莓汁的细菌快速鉴别与指示菌设定2 3 2 2 3 3m y p 培养观察 为进一步确认4 菌株，采用甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基( m y p ) 培养，图2 - 4 依序 为y l 、y 2 、y 3 、y 4 和s 的培养结果。观察图片，4 株均与标准菌株有相似特征，菌落为均红 色，提示菌株不发酵甘露醇；菌落均绕有晕圈，表示菌株有卵磷脂酶产生，可分解卵磷脂。 这些都是蜡样芽孢杆菌杆菌的典型特征，可证实v i t e k 鉴定结果。 图2 - 4 y l 、y 2 、y 3 、y 4 和s 菌株的m y p 培养菌落观察 f i g 2 - 4i m a g e so f c o l o n i e si nm y p m e d i u mo f s t r a i n sy i ，巧，巧，均a n ds 2 4舍肥工业大学搏士学位论文 2 2 3 4 芽孢菌的分子鉴别 对试验获得的4 株芽孢菌进行g + cm 0 1 测定，测定结果见表2 - 5 。表2 - 5 显示标准菌 株的g + c m o l 为5 4 2 ，y ，、y 2 、y 3 、y 4 分别5 3 0 、5 5 4 、5 4 2 、5 6 6 。由于 遗传物质的高度稳定性，核酸特征及核苷酸序列是微生物分子鉴别方法的可靠方法。一个种 的g + cm o l 乡6 的差异不大于3 4 孵1 0 8 , 1 1 0 。本试验的4 菌株与标准菌差异范围2 4 ，4 菌株之间极差为3 6 ，可佐证该4 株细菌与标准蜡样芽孢杆菌为同一菌种。 表2 - 5 草莓汁中芽孢菌的g + ct 0 0 1 s 0 定 t a b 2 5 g + c m o l e x a m i n a t i o n o f b a c i l l u s i ns t r a w b e r r y j u i c e 蜡样芽孢杆菌 菌株y ly 2 c m c c 0 3 _ ) 6 3 3 0 1 t m ( ) 9 1 59 1 09 2 09 1 59 2 5 g + c ( t 0 0 1 ) 5 4 25 3 0 5 5 4 5 4 25 6 6 2 2 4 蜡样芽孢杆菌可设定为草莓汁的指示菌 食品中的微生物种类繁多，在加工过程中，如何快速、准确判别食品的杀菌效果和安全 呢? 指示菌就是针对这一问题而设立的指标。选择指示菌的标准主要有：严重致病性，强抗 逆性，或优势腐败菌。就食品杀菌加工过程而言，一般应优先考虑难以杀死的微生物作为指 示菌并主要根据指示苗来进行杀菌手段的选择、杀菌工艺的设计以及杀菌效果的检验，因 为难以杀灭的指示菌处理了，其它菌则可能完全被杀死了。 根据2 2 2 和2 2 3 的结果，从草莓汁中分离的细菌有1 6 种非芽孢菌和1 种芽孢菌，芽孢 菌即为蜡样芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 。根据这一结果，蜡样芽孢杆菌可设定为草莓汁杀菌 的指示菌。主要依据有：第一、蜡样芽孢杆菌可产生芽孢，在果汁超高压加工过程中，该菌 对静水压具有强抗性。有关压力对芽孢菌与非芽孢菌的杀灭作用已在第一章作了介绍。第二， 蜡样芽孢杆菌可致食物中毒，中毒类型主要有：一类以恶心、呕吐症状为主；另一类以腹痛、 腹泻症状为主。该菌在自然界中广泛分布，由该菌引起的中毒事件不断发生，有时可导致规 模暴发旧】。第三、蜡样芽孢杆菌是草莓汁中的优势芽孢菌。限于样品数量和检测误差，可能 存在其他种类未检出的芽孢菌，但试验所分离的几株芽孢菌均为蜡样芽孢杆菌，数量占优势。 第二章草莓汁的细菌快速鉴别与指示菌设定2 5 显然，由于草莓浆果皮薄易损，难以除菌，其生长、采摘和贮藏运输过程中携带的有害 菌( 包括指示菌蜡样芽孢杆菌) ，伴随草莓汁的生产过程，终将进入产品，给果汁带来安全隐 患。因此，加强草莓汁超高压杀菌技术研究，特别是指示菌的控制和杀灭方法研究，可有力 保障果汁的食用安全。 2 3 小结 本章以国家食品卫生标准为依据，开展了草莓鲜榨汁的卫生微生物学检验，运用现代微 生物鉴定仪器对草莓汁的细菌进行鉴别，并重点对革莓的芽孢菌进行鉴定与确认，结果表明： 1 ) 草莓汁微生物种类丰富，包括细菌、霉菌和酵母菌。从数量上看，无论使用采自生 产基地，还是市场购买的原料，草莓汁的细菌总数、大肠菌群和霉菌酵母菌均超出国家食品 卫生标准。因此，不宜直接食用未作任何杀菌处理的草莓鲜果或果汁 2 ) 鉴别出草莓汁的主要细菌有9 科1 1 属1 7 种，其中革兰氏阴性菌1 4 种，革兰氏阳性 菌3 种( 包括芽孢菌1 种) 。菌名分别为：尿放线杆菌4 e t i n o b a c i l l u su r e a e 、少动鞘氨醇单胞 菌s p h i n g o m o n a sp a u e i m o b i l i s 、溶血巴斯德氏菌p a s t e u r e l l ah a e m o l y t i c a 、荧光假单胞菌 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s 、恶臭假单胞菌p s e u d o m o n a sp u t i d a 、成团泛菌p a n t o e a a g g l o m e r a n s 、阴沟肠杆菌e n t e r o b a e t e rc l o a c a e 、阿氏肠杆菌e n t e r o b a e t e ra s b u r i a e 、弗氏柠 檬酸杆菌c i t r o b a c t e r # e u n d i i 、布氏柠檬酸杆菌c i t r o b a c t e rb r a a k t i 、放射土壤杆菌 a g r o b a c t e r i u mr a d i o b a c t e r 、根癌土壤杆菌a g r o b a c t e r i u mt w n e f a e i e n s 、鲁氏不动杆菌 p r e s u m p t i v ea c i n e t o b a c t e r 伽够、沙门氏菌s a l m o n e l l as p e e i e s 、耳葡萄球菌s t a p h y l o e o e c u s a u r i c u l a r i s 、科氏葡萄球菌s t a p t o c o e c u sc o h n i i 和蜡样芽孢杆菌b a c i l l u sc e r e u s 等。沙门氏菌 为严重的肠道致病菌，是食品卫生必检项目之一，其余的也均为致病菌，或条件致病菌【“2 ”。 鉴定结果为草莓杀菌抑菌技术的开发提供了基础数据。 3 ) 对从草莓汁中获得的芽孢菌进行形态、生理生化、以及生物分子水平等多层面鉴别， 根据芽孢观察、v i t e k 鉴定、m y p 培养菌落观察以及g + cm o l 指标，可以确认从草莓 汁中获得的芽孢菌均为蜡样芽孢杆菌。 4 ) 蜡样芽孢杆菌是试验鉴定出的优势芽孢菌，不仅抗逆性强，难杀灭，而且能导致食 物中毒，因此，可设定该菌为草莓汁杀菌的指示菌。 合肥工业大学博士学位论文 第三章超高压对蜡样芽孢杆菌的孢子萌发诱导与 营养体致死效应 草莓汁的指示菌蜡样芽孢杆菌难以杀灭的根本原因在于其具有芽孢结构，孢子可抵 抗高强度的压力。芽孢一旦萌发生长为营养体后，则与非芽孢菌的菌体类似，抗压强度急剧 降低。根据这一特点，若利用一定的刺激手段使芽孢菌的孢子由休眠状态萌发为营养体，再 施加压力杀灭则相对较易。问题的关键在于找到一种确保食品安全的芽孢萌发刺激手段。 本章以蜡样芽孢杆菌为对象，研究压力和温度对芽孢萌发的诱导效应，并对营养体进行 超高压杀灭处理。旨在为高效杀灭蜡样芽孢杆菌奠定基础。 3 1 材料与方法 3 1 1 试验材料 蜡样芽孢杆菌c m c c ( b ) 6 3 3 0 1 ，由安徽出入境检验检疫局生物技术中心提供。 3 1 2 试验设备与试剂 超高压装置为本所自行设计研制。容量1 l ，压力范围为0 - - 6 0 0 m p a ，工作温度o 6 0 ， 传压介质为植物油；数显恒温水浴锅h h - 4 ，常州国华电器有限公司；水浴恒温振荡器，扛 苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；7 5 2 紫外光栅分光光度计( 同第二章) ：菌落计数琼脂片( 美 国m m m 公司生产) 。 3 1 3 试验方法 3 1 3 1 蜡样芽孢杆菌孢子悬液的制备【1 2 s l 按以下操作进行：( 1 ) 取少许蜡样芽孢杆菌接入含1 0 m l 营养肉汤培养基试管。置3 7 水浴振荡2 0 0r m i n 培养，1 8h ( 第1 代) ；( 2 ) 用接种环取第1 代培养的菌悬液，划线接种 于营养琼脂培养基平板上，置3 7 培养1 8h ( 第2 代) ；( 3 ) 挑取第2 代培养物中典型菌 落，接种于营养肉汤培养基。置3 7 水浴振荡2 0 0r m i n 培养，1 8 h ( 第3 代) ；( 4 ) 吸取5r n l 第3 代培养物接种于大培养皿中的营养琼脂培养基，摇动使菌液布满培养基的表面。吸出多 第三章超高压对蜡样芽孢杆菌的孢子萌发诱导与营养体致死效应2 7 余培养物，3 7 培养5d ；( 5 ) 用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定、染色后显微镜检( 油 镜) ，观察芽孢形成率是否达到9 5 以上，否则，应继续培养；( 6 ) 加l om l 无菌蒸馏水于 大培养皿中，以l 棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5 m l 无菌蒸 馏水重复洗菌一遍。( 7 ) 将第两批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的三角烧瓶中。振摇5m i n ， 打碎菌块使成均匀的芽孢悬液；( 8 ) 将盛装菌悬液的三角烧瓶置4 5 水浴中2 4 h ，使菌白溶 断链分散成单个芽孢；( 9 ) 用无菌纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块；( 1 0 ) 将过滤后 的芽孢悬液置无菌离心管内，以3 0 0 0r m i n 速度离心3 0m i n ，弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽 孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3 遍；将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水 中，并加入适量小玻璃珠；( 1 1 ) 将芽孢液放于8 0 c 水浴中1 0 m i n ，以杀灭残余的细菌繁殖 体：( 1 2 ) 待冷至室温后，保存于4 冰箱中备用。有效期为半年 3 1 3 2 蜡样芽孢杆菌孢子萌发率的快速测定 采用分光光度计测定法，其原理是利用发芽时芽孢快速吸收水分，胞体膨胀，外衣及皮 质破裂、降解等反应，导致悬液吸光值改变的现象，吸光值的变化与芽孢萌发率呈一定关系。 试验以芽孢悬液在6 0 0a m 波段的吸光值间接计算发芽率，萌发率= ( 对照组a 6 0 0 - - 试验组 a m ) + 对照组a 6 0 0 【1 2 9 , 】。此法可快速测定芽孢萌发率，也是一种常规的芽孢发芽测定方法。 3 1 3 3 超高压激活蜡样芽孢杆菌孢子试验 根据相关文献p 暑1 以及预试验结果，超高压处理对芽孢菌的孢子萌发具有促进作用，但压 力应设定在较低的范围内，且处理2 0 m i n 后延长保压时间对萌发率的提高不明显。为此，试 验时压力取值范围为1 0 0 - - 5 0 0m p a ，时间取值2 0m i n 。并按以下操作进行：分别吸取5m l 蜡 样芽孢杆菌孢子悬液装入无菌塑料袋真空包装，为防止渗出，再迸行二次真空包装，分别在 1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0m p a 的压力下处理2 0m i n ；以未经处理的悬液作为对照；处理后 样品于3 7 恒温摇床2 0 0r m i n 振荡培养1h 。采用分光光度法进行a 6 0 0 测定；按3 1 3 2 的方法 计算萌发率。 3 1 3 4 热力激活蜡样芽孢杆菌孢子试验 温度是激活芽孢的常规手段，一般采用1 0 0 及其以下温度处理。热力激活蜡样芽孢杆 菌孢子试验按以下操作进行：吸取5m l 蜡样芽孢杆菌孢子悬液倒入试管中，在恒温水浴锅中 分别以3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 和1 0 0 温度处理2 0m i r a 以室温下未经过处理的悬 液作为对照：处理后在3 7 条件下，2 0 0r m i n 振荡培养lh ；采用分光光度法进行测定，凋 2 8合肥工业大学博士学位论文 出x = 6 0 0 砌时的a 值；按3 1 3 2 的方法计算萌发率。并根据试验结果，以温度协同压力 处理提高芽孢的萌发率。 3 1 3 5 热力协同超高压激活蜡样芽孢杆菌孢子试验 选择超高压处理萌发率最高的两个处理，结合温度激活试验结果，同时考虑到在热敏性 果汁中的实际应用，热力协同压力激活试验按以下操作进行：分别吸取5m l 蜡样芽孢杆菌孢 子悬液装入无菌塑料袋真空包装，为防止渗出，再进行二次真空包装，将压力釜升温至6 0 ， 分别施自d 2 0 0 、3 0 0i v i p a 的压力处理2 0m i n ；以未经处理的悬液作为对照；处理后将样品于3 7 恒温摇床2 0 0r m i n 振荡培养1h 。采用分光光度法进行a 测定；按3 1 3 2 的方法计算萌发 率。 3 1 3 6 超高压致死蜡样芽孢杆菌的响应曲面法分析 将蜡样芽孢杆菌3 7 下营养琼脂培养1 8h 至对数期，将菌体洗脱至无菌生理盐水中，试 验时菌液浓度调整为1 5 x1 0 8c f u m l 。 响应曲面法是数学方法和统计学方法结合的产物，可对多个变量引起的响应进行建模和 分析，从而达到优化响应的目的，实验次数少，分析精度高，近年来被普遍用于生物学过程 优化分析【1 3 1 。1 ”j 。 试验设计采用b o x - b e h n k e n 响应曲面法，以压力、温度、保压时间3 个因子为自变量， 分别以x l 、x 2 ，x 3 表示，并根据现有试验条件、研究经验和研究报道，其取值范围确定 为1 0 0 - - 5 0 0 t v l p a 、2 0 6 0 和1 0 一2 0 r a i n 。按方程粕( x 广) ( 0 ) x 对自变量进行编码 ( 】【i 为自变量的编码值，x i 为自变量的真实值，) ( o 试验中心点处的真实值，x 为自变量变 化的步长) ，并以自变量的编码值+ 1 、0 、一1 分别代表自变量的高、中、低水平。试验因 素水平及编码见表3 - l ，以超高压处理后蜡样芽孢杆菌的致死率r y - ( 1 一1 0 9 m l o g n o ) x1 0 0 ，其中f 为处理后存活菌数，为初始菌数】为响应值，假设由最小二乘法拟合的二次多 项式方程为： l ，= b o + 与玉+ 岛五+ 马五+ 且。砰+ 岛2 冀+ 马3 碍+ 骂：玉五+ 骂3 五五+ 岛3 五五 ( 1 ) 其中：y 代表蜡样芽孢杆菌的致死率，b o 为常数项，b i 。b 2 ，b 3 分别为线性系数，b m b 1 3 ，b 2 3 为交互项系数，b i i ，b 2 2 ，b 为二次项系数。 第三章超高压对蜡样芽孢杆菌的孢子萌发诱导与营养体致死效应 2 9 注：x l - = ( x i - - 3 0 0 ) 2 0 0 ；x 产( x 2 - - 4 0 ) 2 0 ；x 3 = ( x 3 - z 5 ) 5 3 1 3 7 微生物计数 根据中华人民共和国食品微生物检验标准( g b 4 7 8 9 - - 2 0 0 3 ) ，采用菌落计数琼脂片( 美国 m m m 公司生产) ，3 7 培养4 8h ，进行菌数计数。 3 2 结果与讨论 3 2 i 超高压处理对蜡样芽孢杆菌孢子萌发的激活作用 3 2 1 1 超高压处理对蜡样芽孢杆菌孢予萌发率的影响 超高压处理对蜡样芽孢杆菌萌发率的影响见图3 1 。图中曲线说明，常温下实施1 0 0 5 0 0 m p a 的压力处理，萌发率变化里先升后降趋势。特别是在2 0 0 - - 4 0 0m p a 压力区间萌发率较高， 其中2 0 0 、3 0 0 、4 0 0m p a 处理后孢子萌发率分别为6 1 、6 7 、5 0 。由此可见，超高压对孢 子萌发具有激活作用，并以2 0 0 - - 3 0 0m p a 的处理对萌发率的提高幅度最大。 芽孢是细菌的一个特殊的休眠结构。由芽孢萌发成为营养体，要经历活化、出芽和生长3 个基本阶段，其中活化阶段非常关键，其本质是打破芽孢的体眠。一些物理、化学、生物等 因子均有促进芽孢活化的作用。2 0 0 - - 3 0 0m p a 的超高压处理能提高蜡样芽孢杆菌孢子的萌发 率，可能原因是这一压力范围的处理起到促进活化的作用。启动活化的机制可能是压力引起 芽孢衣中蛋白质的三维空间结构发生了可逆行的变化，或是促进与萌发有关的蛋白酶活动， 导致芽孢衣上大分子蛋白质的降解，活化的结果使芽孢透性增加，进而皮层发生膨胀、溶解 和消失。之后，外界的水分可无阻挡地进入芽孢的核心部分，使核心迅速膨胀。并开始合成 3 0 合肥工业大学博士学位论文 细胞壁、d n a 、r n a 、蛋白质，经出芽、生长，完成营养体的形态建成。在萌发过程中，芽 孢菌的吸光值逐渐下降，对环境的抗性减弱。 器 聋 蹦 嵩 省 麟 崮 州 盛 沛 错 、 幂 压力( m p a ) 图3 i 超高压处理对蜡样芽孢杆菌孢子萌发率的影响 f 螗3 一ie f f e c t so f u l t r a - h i g hp r e s s u r et r e a t m e n to ng e r m i n a t i n gr a t eo f b a c i l l u sc e p e 口s p o r e s 3 2 1 2 热力处理对蜡样芽孢杆菌内生孢子萌发率的影响 经过不同温度处理之后，蜡样芽孢杆菌的孢子萌发率变化较大( 见图3 2 ) 。在3 0 一5 0 区间内芽孢的萌发率呈上升趋势，在6 0 时萌发率达至u 6 4 ，在7 0 时萌发率达到8 4 ，在 8 0 时萌发率仍可达到8 0 ；在8 0 以后萌发率呈迅速下降趋势，到达1 0 0 时芽孢萌发率 降至2 0 左右。 6 0 - - 8 0 温度范围的热力处理可有效刺激芽孢萌发。温度可能也是通过蛋白质和酶的活 性改变，使芽孢衣降解，渗透性增加来促进芽孢萌发的。 热处理的最高萌发率为8 4 ，而压力处理为6 7 ，两者比较，热处理效果好于压力处理。 由此可以看出，超高压处理诱导芽孢萌发效果有进一步提高的潜力。 第三章超高压对蜡撵芽孢杆菌的孢子萌发诱导与营养体致死效应3 l 菇 蒜 斟 高 苇 雕 奇 叫 昱 潍 船 雾 温度( ) 图3 - 2 热力处理对蜡样芽孢杆菌孢子萌发率的影响 f i g3 - 2e f f e c t so f t h e r m a lt r e a t m e n to l lg e r m i n a t i n gr a t eo f b a e i l l u ac e r e u ss p o r e s 3 2 1 ，3 超高压与热力协同处理促进蜡样芽孢抒菌内生孢子的萌发 由3 2 i 1 和3 2 1 2 知，超高压和热力均可刺激蜡样芽孢杆菌孢子萌发，使孢子的萌发率 显著提高。为了强化超高压对芽孢的激活作用，试验将两因素结合，以温度协同压力促进芽 孢萌发。考虑到在果汁中的实际应用，采用协同温度选择6 0 ( 参照文献l o ) ，压力分别选择 2 0 0 、3 0 0m p a ，对芽孢悬液进行2 0m i n 的超高压处理。试验结果表明，萌发率有大幅度提高， 分别为8 7 5 和9 1 3 ，比常压下6 0 激活，分别提高了2 3 5 和2 7 3 。如此高的萌发率。 可以说是基本齐一萌发。采取复合激活方式，压力与温度的协同作用，使芽孢萌发率进一步 提高。为运用超高压杀灭芽孢菌提供了基础。 3 2 2 超高压对蜡样芽孢杆菌营养体的致死效应分析 超高压对微生物的杀灭作用已在本文的1 3 部分作了介绍。超高压处理蜡样芽孢杆菌的营 养体，同样具有致死效应，但压力却难以杀死芽孢。究其原因，还得从两者结构差异进行分 析。 芽孢是芽孢类细菌的特殊结构，由孢外壁、芽孢衣、皮层、核心等构成( 如图1 1 ) 。核心 丝全! ! 三些查堂堡主兰堡堡苎 是芽孢的关键结构，由芽孢壁、芽孢膜、芽孢质和核区组成，萌发后可相应形成细胞壁、细 胞膜、细胞质。孢外壁主要含脂蛋白，芽孢农主要有疏水性角蛋白，皮层主要有肽聚糖等， 结构致密，渗透性差。并具有一定的弹性。这三层结构是芽孢对压力产生强对抗性的主要结 构基础。 但芽孢仅仅是芽孢菌的休眠体，在适当的压力、温度的刺激下可萌发为营养体，芽孢类 细菌的生长繁衍是依赖营养体完成的。 芽孢类细菌的营养体与一般的非芽孢菌的结构并无差异，主要由细胞壁、细胞膜、细胞 质构成。细胞壁主要起支持作用，在渗透性方面无阻碍作用；细胞膜则具有半透性。芽孢菌 营养体的构造决定了其易受到压力的影响。在超高压处理过程中，压力的挤压、剪切以及空 穴作用等，芽孢菌的营养体可能发生收缩、变形，结构严重破坏或损伤，膜蛋白和酶发生变 性，内容物泄露，代谢紊乱等，最终导致死亡 3 2 3 超高压致死蜡样芽孢杆菌营养体的响应曲面分析 超高压对蜡样芽孢杆菌营养体具有致死作用。在超高压处理过程中，杀菌效果主要受到 压力( x 1 ) 、温度( x 2 ) ，保压时间( x 3 ) 3 个因素的影响。试验采用响应曲面法对这些因素 进行研究建立杀菌效果模型。 3 2 。3 。1 超高压致死蜡样芽孢杆菌回归模型的建立 根据b o x - b e h n k e n 响应曲面设计要求，开展了1 7 组蜡样芽孢杆菌超高压处理试验，菌体 致死率的测定值和预测值见表3 2 。利用d e s i g ne x p e r t ( v e r s i o n7 o ) 进行回归分析，得到多 元二次回归模型，见方程2 。 y = 6 2 8 + 2 7 弛+ 7 + 3 如+ 1 _ 0 彳+ 2 鹾+ 1 唠一2 0 x l x ：- 1 吡焉一o 7 x f q ( 2 ) 对模型进行方差分析和显著性检验，结果见表3 - 3 。由表3 3 可以看出：模型f = 5 2 7 9 8 【f oo l ( 9 ，4 ) = 1 4 6 6 】，模型p 0 0 0 0 1 ，表明模型极显著。不同处理会引起不同响应。f 女“ = 1 9 0 0 0 5 ，失拟度不显著。模型决定系数= o 9 9 8 5 ，调 整决定系数a d j u s t e dr 2 = o 9 9 6 6 。表明模型可以解释9 9 6 6 的响应值变化，拟合度高，实验 误差小。因此，建立的模型显著有效，可为蜡样芽孢杆菌压致死亡的分析和预测提供参考。 从系数项的p 值来分析，x l 、x 2 、x 3 、x 2 2 达到极显著水平( p 0 0 1 ) ，x i 【。2 达到显著水平 ( p 0 0 5 ) ，提示压力、温度和时间，及压力与温度的交互作用对致死率产生了显著影响。 第三章超高压对蜡样芽孢杆菌的孢子萌发诱导与营养体致死效应3 3 表3 2 实验设计与响应 t a b 3 - 2 e x p e r i m e n t a ld e s i g n sa n dr e s p o n s e s 因素 响应值y x lx 2x 3 实验值( )预测值( ，砂 3 4合肥工业大学博士学位论文 模型6 4 9 3 3 597 2 1 4 85 2 7 9 8 0 0 0 0 1 x i5 9 1 8 7 2 您 x j x l x 2 x i x ， x 2 x 3 x 1 2 x 2 残差 失拟 误差 总和 4 3 0 7 i 8 3 8 5 1 6 4 0 3 4 2 l ，6 9 4 0 9 2 7 5 9 3 ，8 s 9 5 7 5 6 2 3 9 5 6 5 0 2 ，9 2 5 9 1 8 7 2 4 3 0 7