（微生物与生化药学专业论文）hifnβhsa在毕赤酵母中的诱导表达及其降解蛋白酶的鉴定.pdf

摘要 摘要 毕赤酵母是近十年来发展起来的一种真核表达体系，具有表达量高、培养成本低、 产物可以分泌到胞外、糖基化程度适中等优点。目前，国内外已有5 0 0 多种外源蛋白在 毕赤酵母中得到表达。但是外源蛋白的降解是毕赤酵母表达体系应用过程中的共性问 题，严重影响外源蛋白的积累。 本研究室成功构建了i f n p 与人血清白蛋白融合蛋白( h u m a ni f n l 3 h s af u s i o n p r o t e i n ，h i f n p h s a ) 基因并在毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 ) 中表达，经检测融合蛋 白分子量约为9 0k d a ，具有h s a 的抗原性，用细胞病变抑制法测定摇瓶发酵液上清中 融合蛋白的干扰素活性约为6 4 0i u m l ，并通过对5l 发酵罐发酵过程参数及其过程控 制对基因工程菌毕赤酵母表达l f n b h s a 影响的研究确定一系列的发酵参数。本论文 是在此工作基础上，选取的主要结果如下： 1 通过单因子实验，确定了最佳的与蛋白酶活性相关的营养和环境条件：p h 在 5 0 6 0 ，蛋白胨的最佳添加量为6 。g l u 、a l a 和a r g 三种氨基酸的添加会促进融合蛋 白的表达。其最佳作用浓度为o 1 。最后确定了e d t a 为促进融合蛋白表达的最适蛋 白酶抑制剂，其最佳作用浓度为1 0m m o l l 。根据b o x b e n h n k e n 的中心组合试验设计原 理，采用三因素三水平的响应面分析方法，考察了p h 、g l u 浓度和e d t a 浓度对融合 蛋白表达的影响，结果表明当p h5 5 、添加g l u 浓度为o 1 8 、e d t a 浓度为1 2m m o l l 时，融合蛋白的表达量最高，为2 4 8 7m g l ，相对于对照组提高了6 1 。 2 通过s d s p a g e 确定融合蛋白h i f n 口h s a 在诱导表达过程中确实发生了降解，降 解的主要条带出现在6 5k d a ；通过w e s t e r n b l o t t i n g 杂交实验，证实了6 5k d a 的蛋白条带 与9 0k d a 的目的条带在杂交实验中具有相同的蛋白免疫原性，从而确定这条蛋白带为9 0 k d a 目的条带的降解带。通过h p l c 证实发酵液中蛋白酶对融合蛋白的降解主要发生在 h s a 区域。以明胶为底物的s d s p a g e 活性电泳结果表明，诱导表达阶段的发酵上清液 和细胞内存在几种蛋白酶。以h s a 为底物的s d s p a g e 活性电泳，确定了在发酵液中确 实存在一种蛋白酶对融合蛋白进行水解作用。在此基础上，对与标准蛋白分子量m a r k 进行比较，确定该蛋白酶为蛋白酶b 。 关键词：人p 干扰素；人血清白蛋白；s d s - p a g e ；蛋白酶；降解；响应面分析 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ey e a s tp i c h i ap a s t o r i si sau s e f u le u c a r y o ne x p r e s s i n gs y s t e mw h i c hh a sd e v e l o p e di n 10y e a r s ，t 1 1 i ss y s t e mh a ss e v e r a lg o o dq u a l i t y ，f o re x a m p l e ，h i 曲a m o u t se x p r e s s i o n , c l u t i v a t i n gl o w , p r o d u c tc a l ls e c r e t eo u t s i d e ，p r o p e rg l y c o s y l a t i o n a tp r e s e n t ，a l r e a d yh a v e h a dm o r et h a n5 0 0k i n de x t e r n a lp r o t e i ne x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s p r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o n h a sb e e nap e r p e t u a lp r o b l e mw h e ny e a s t sa r ee m p l o y e dt oe x p r e s sr e c o m b i n a n tp r o t e i n s a l o st h i sp r o b l e mi n f l u e n tt h ea c c u m u l a t i o no fp r o t e i n o nt h eb a s i so f p r e v i o u s l yw o r k ，l a b o r a t o r yc o n s t r u c t e dt h eg e n eo fh u m a ni f n d h s a f u s i o np r o t e i n ，h i f n l 3 - h s ai np i c h i ap a s t o r i sk m 7 1b yt e c h n i q u eo fg e n ee n g i n e e r i n g ，w h i c h e x p r e s st h e9 0k d ap r o t e i n a n dt t h r o u g hh ee f f e c t so ff e r m e n t a t i v ep r o c e s sp a r a m e t e ro nc e l l g r o w t ha n dr d f n d h s ae x p r e s s i o ni n5lf e r m e n t e rw e r es t u d i e d o nt h i sb a s i s t h i s r e s e a r c hi sa b o u tt h ep r o b l e mo ft h ep r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o nd u r i n gt h ee x p r e s sp r o c e s s ，t h e m a i nr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 b yt h ee x p e r i m e n to fm o n o - f a c t o r , t h em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s ：u n d e rt h ep h 5 0 - p h 6 0 t h ee x p r r s s i o no ft h ep r o t e i ni st h eh i g h e s t a n d6 p e p t o n ew a sa d d e dt oc u l t u r em e d i u mi s t h eb e s t ，a tt h es a m et i m e ，a d d i t i o n so fg l u ，a l a ，a r gi n t ot h em e d i u m ，0 1 c o n c e n t r a t i o n h a st h eo p t i m i z a t i o ne x p r e s s i o n a c c o r d i n go ft h ep r i n c i p l eo fb o x b e n h n k e n w i mt h e m e t h o do f r e s p o n s es u r f a c eo ft h et h r e ef a c t o r sa n dt h r e el e v e l s ，t h eb e s ta d d i t i o np r o g r a mi s p h 5 5 、g l u0 18 、e d t a1 2m m o l li nt h em e d i u m 。o b t a i n e dt h ea m o u n to fp r o t e i n i f n p h s ai s2 4 8 7m e t e ，c o m p a r i n g 埘t 1 1t h eb l a n kr e f e r e n cg r o u p ，i n c r e a s i n g6 1 2 t h ea n a l y s i so fs d s p a g ea n dw e s t e r n b l o ts h o w e dt h a t9 0 k d af u s i o np r o t e i na n d 6 5 k d ad e g r a d a t i o nb a n da p p e a r e di nt h ef e r m e n t a t i o n b yt h eg e l a t i n - s d s p a g e ，t h r e e p r t e a s e si n s i d ea n df i v ep r o t e a s e so u t s i d ec e l l a n dw h i c hd e g r d a t e dt h ep r i t e i n 。w i t ht h e m e t h o do fh p l ci n d i c a t e dt h a tt h ed e g r a d a t i o na p p e a r e di nt h eh s a r e g i o no fr e c o m b i n a n t h u m a ni f n d h s af u s i o np r o t e i n a p p l i e db ys d s p a g ea c t i v i t ye l e c t r o p h o r e s i st h ep r o t e a s e w h i c hc a u s e dt h ed e g r a d a t i o no ff u s i o np r o t e i ni f n d h s aw a sp r o t e i n a s eb k e y w o r d s ：i f n l 3 ；h s a ；s d s p a g e ；p r o t e a s e ；d e g r a d a t i o n ；r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( r s a ) i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： ! ! 工：二垒 导师签名： e l期： 第一章绪论 第一章绪论帚一早瑁化 1 1 毕赤酵母基因表达系统 1 1 1 毕赤酵母的生物学特性 毕赤酵母表达体系是近二十几年来发展起来的真核表达体系。巴斯德毕赤酵 母( p i c h i a p a s t o r i s ) 是一种单细胞微生物，是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系 统之一【l 】。毕赤酵母表达系统具有原核生物表达系统和真核生物表达系统双重优 点：易于进行遗传操作和培养，生长快速，表达量高，同时具有真核生物的转录 后调控机制，并能对许多蛋白质产物进行分泌表达，使产物比较容易被分离和提 纯【2 ，3 1 。与酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e se e r e s i v i a e ) 表达系统相比较，毕赤酵母具有分 泌蛋白效率高，表达菌株相对比较稳定，质粒在表达过程中不易丢失，糖基化程 度低，表达蛋白抗原性低等优点，从而弥补了酿酒酵母的不足【4 】。因此，毕赤酵 母系统在国内外已经被高度重视，到2 0 0 5 年为止，已经有5 0 0 多种蛋白在该系 统中进行了表达1 5 j 。 1 1 2 毕赤酵母表达宿主茵 毕赤酵母表达宿主菌是在8 0 年代开发获得，大多数被应用的p i c h i ap a s t o r i s 表达宿主菌都是通过对野生型石油酵母n r r l y 1 1 4 3 0 ( n o r t h e mr e g i o n a l r e s e a r c hl a b o r a t o f i e s ，p e o r i a , l ) 进行突变改造而来。在组氨酸脱氢酶基因( h i s 4 ) 处有一突变，用于转化后筛选重组菌株，其它的一些营养缺陷宿主菌或生物合成 基因也可作为筛选标记。目前常用的毕赤酵母表达菌株见表1 1 6 , 7 1 。 表1 1p i c h i a p a s t o r i s 表达菌株 t a b l e l 1t h ee x p r e s s i o ns t r a i n so f p i c h i a p a s t o r i s 江南大学硕士学位论文 s m d l l 6 8 、s m d l l 6 5 和s m d l l 6 3 菌株为蛋白酶缺陷型菌株i s , 9 】，该类菌株 基因组中缺失编码蛋白酶a ( p e p 4 ) 、编码蛋白酶b ( p r b l ) 的基因，其结果是大大降 低或清除了此类蛋白酶的活性。此类蛋白酶缺陷型菌株特别适用于分泌型表达。 g s l1 5 、k m 7 1 和s m d l1 6 3 菌株都属于组氨酸脱氢酶基因缺陷型菌株( h i s 4 。) ，只 能在含有组氨酸的培养基中生长，这一特性有助于在无组氨酸的葡萄糖基础培养 基( m i n i m a ld e x t r o s em e d i u m ，m d ) _ l 筛选阳性转化子【l o ，1 1 1 。 1 1 3 毕赤酵母表达载体 1 1 3 1 常用表达载体 由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加质粒，所以表达载体通常需要与宿主染 色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中来实现对外源基因的表 达。表达载体几乎都为穿梭质粒，先在大肠杆菌中进行复制，然后被导入酵母宿 主细胞。常用的表达载体有p p i c z a 、p p i c 9 和p p i c 9 k 等的a - f a c t o r 序列【i2 i 。 1 1 3 2 启动予 a o x l 、g a p 和f l d l 是毕赤酵母常用的启动子。醇氧化酶a o x l ，它的甲 醇诱导型很强。g a p 启动子是在毕赤酵母中克隆到3 磷酸甘油醛脱氢酶基因的 启动子，由于该启动子为组成型的，不需要甲醇诱导，其活力与a o x l 启动子不 相上下。f l d l 启动子是编码一个谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶，它是以甲醇为唯 一碳源机制的关键酶。该启动子提供了诱导高水平表达的活性【l 3 1 。 1 1 3 3 选择标记 表达载体上的选择标记可用于阳性转化子和高拷贝转化子的筛选。虽然很多 经典的遗传技术和分子遗传技术已经在p i c h i ap a s t o r i s 中发展起来，但是应用于 酵母的遗传操作的选择标记较少。近年来，包括毕赤酵母a d e l 、a r g 4 和u r a 3 基因等在内的一系列新型生物合成标记陆续被分离和鉴定出来，并且都已经合并 到表达载体中。另外，一系列营养缺陷型组合的宿主菌也已经出现，这些宿主菌 中的一些营养缺陷型基因( 如h i s 4 、s u e 2 、a r 9 4 等缺失) 通常被用来作为阳性转 化子的筛选标记。 2 第一章绪论 表1 2 p i c h i a p a s t o r i s 表达系统中常用的载体和选择标记 t a b l e1 2 e x p r e s s i o nv e t o r sa n d s e l e c t a b l em a r k e rg e n e sf o ru s ew i t ht h ep i c h i ap a s t o r i s e x p r e s s i o ns y s t e m 1 1 4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达 毕赤酵母表达系统已经广泛地应用于各种融合蛋白的生产中。c e r e g h i n oa n d c r e g g 的文章中列出【5 】了大多数已经被重组表达的融合蛋白，并且表达的外源蛋 白种类相当丰富，包括酶、膜蛋白、抗原和抗体、调节蛋白等类型，其体系的优 点致使其在表达真核蛋白方面得到更广泛的应用。我国在这方面的研究虽然起步 较晚，但是应用这个表达体系已经成功的表达了胰岛素、乙肝表面抗原、降钙素、 人血清白蛋白等蛋白。 1 2 长效药物研究进展 1 2 1 长效药物研究背景 生物技术的发展在很大程度上促进了多肽、蛋白药物的研究。截止至2 0 0 4 年2 月，美国f d a 批准了6 4 种重组多肽蛋白类治疗药物上市，7 2 0 多种生物技 术药物正在进行i 期临床试验或接受f d a 审评，其中2 0 0 种以上的药物进 入最后的批准阶段。药物代谢动力学表明，蛋白药物和多肽因子主要是通过降解、 排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。在人体代谢过程中，分子量小 于2 0k d a 的多肽非常容易被肾小球滤过。在其通过肾小管的过程中多肽因子很 容易被肾小管中的蛋白酶部分降解，随后在尿液中排出，导致其半衰期较短和生 物利用度低。为达到治疗效果必须频繁给药来维持一定的血药浓度，从而容易导 致一系列不良反应，给患者带来痛苦。以干扰素为例，目前已有5 7 个国家批准 生产、使用重组干扰素制剂，治疗3 0 多种肿瘤、病毒感染性疾病，并取得了良 好的效果。但在临床使用过程中，干扰素也存在很多缺点。比如，由于干扰素组 织特异性差，在体内半衰期短，治疗过程中通常采用的是全身性、大剂量给药， 这样就导致了严重的毒副作用，并且治疗费用非常高。同时，干扰素中的i f n p ， 肌肉注射的体内半衰期一般在1 0h 左右，需要频繁给药，以到达治疗效果。因 此，研制长效的重组蛋白药物已经愈来愈成为药物研究的热点【l 6 ，1 7 】。 江南大学硕士学位论文 1 2 2 常用长效药物研究技术 目前，用来延长蛋白药物半衰期的方法主要基于以下三种原理：第一，增大 蛋白药物的自身分子量，在通过肾小球时减少滤过率；第二，通过减少异源蛋白 的免疫原性，来降低蛋白在体内的清除率；第三，利用游离型药物和结合型药物 在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药 物的平衡向游离型药物方向移动。基于上述原理，发展出了以下一些常用的延长 药物半衰期的技术。 1 2 2 1 基因融合 基因融合技术的原理是增加多肽和蛋白药物的分子量，或者通过改变受体的 亲和性，达到延长药物蛋白半衰期的目的，通常通过构建融合蛋白来实现。人血 清白蛋白( h s a ) 是现有的天然载体蛋白之一，其分子量约为6 6k d a ，具有5 8 5 个 氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质。h s a 是很多内源因子和外源药物的 载体，药物和血清白蛋白结合后，可以减少其生物利用度，同时增加在体内的半 衰期【1 8 】。h s a 在体内的半衰期可以达到1 9 天【i 引，另外，h s a 在毕赤酵母中可 以高效表达，据相关文献报道，其在发酵液中的表达量可以达到4e e l f 2 0 1 ，并且 纯化工艺比较简单方便。因此，蛋白药物基因通过与h s a 基因融合后，在毕赤 酵母或酿酒酵母中表达，可以获得半衰期被延长的融合蛋白药物。2 0 0 1 年，美 国h g s 公司研制的一系列与h s a 融合延长蛋白质药物，如h s a 与干扰素、人 生长激素等，都分别进入了临床试验，其中h s a h i f n p 也已经进入了早期临床 开发阶段。 1 2 2 2p e g 化修饰 p e g 化( p e g y l a t i o n ) ，即聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e ，p e g ) 共价修饰蛋白质， 是化学修饰中最为常见的修饰剂，主要通过增加蛋白质的分子量，减少药物排泄， 同时p e g 可以作为屏障阻挡蛋白质分子表面的抗原决定簇【2 2 1 ，减少免疫原性和 体内清除率，并且还可以保护蛋白质不容易被蛋白酶水解【2 3 1 。目前已经上市的 p e g 化的蛋白药物，如p e g 化的l 天冬酰胺酶、p e g 化的i f n 砣b 、p e g 化的 g c s f 等【2 4 ，2 52 6 】，在血浆中的半衰期一般可以延长几倍、几十倍甚至几百倍。 但是其免疫原性和生物活性也相对降低，这是p e g 化修饰技术的一大缺点。 1 2 2 3 基因突变 利用寡核苷酸引物、p c r 介导的定点突变及盒式突变等方法构建突变体延 长蛋白药物半衰期【2 7 1 。常用的方法有增加蛋白药物的糖基化程度，通过糖基化增 加药物表面的侧链和蛋白稳定性，阻碍蛋白酶对药物蛋白的降解，同时增加了蛋 白药物的分子量，减少肾小球的滤过；其次是通过形成缓释的微沉淀物，延长游 离型药物的释放时间。目前两种新型的重组组织纤维溶酶源激活剂已经被欧洲和 美国批准上市，同时成功上市的还有重组e p o 突变体等。 4 第一章绪论 1 2 2 4 长效制剂 对于半衰期短的多肽蛋白类药物可以采取改变剂型来延缓其在体内的释 放，达到延长药物作用时间的目的。这些剂型包括埋植剂( 分为可降解和非降解) 、 微球注射剂等。k a j i h a r a 等用硅胶制备了的0 【干扰素埋植剂，主要工艺是采用人 血清白蛋t 刍( h s a ) 作保护剂，与a 干扰素一起混匀后冷冻干燥，将冷冻干燥的 h s a i f n a 、硅胶和固化剂混合，经真空干燥成型后装入聚四氟乙烯管。由于h s a 在体内安全性好，用h s a i f n a 粒子制备埋植剂可将载药量进一步提高。干扰素 埋植剂制备工艺条件大多比较温和，避免使用有机溶剂、加热、剧烈搅拌等操作， 有效地保持了干扰素制剂的活性，但非降解埋植剂需要手术埋植和摘除，增加了 病人的痛苦，目前研制的几种干扰素埋植剂，其缓释效果也远未达到避孕药物埋 植给药，可维持控速释药几年的效果【2 8 2 9 30 1 。 1 3 影响外源蛋白表达的因素 外源基因在毕赤酵母表达系统中的高效表达受到许多因素的影响，如密码 子、启动子、表达载体、宿主菌的表型、培养条件、外源基因的性质、基因拷贝 数、信号肽、甲醇诱导的浓度和诱导时间、蛋白酶的降解以及发酵参数等。相关 研究结果表明，通过改造外源基因的内部结构，优化培养条件，降低蛋白酶降解 作用和改变发酵参数等方法可以提高外源蛋白的表达量【3 1 3 2 ，3 3 1 。 1 3 1 稀有密码子 当表达重组非酵母蛋白时，外源基因的表达量还与密码子的选用有关。不同 的表达系统的宿主在密码子的使用频率上是不同的，即表达系统的密码子“偏爱 性 。某些物种的常用密码子也许在毕赤酵母中是稀有密码子，在酵母中表达量 较高的基因往往都是采用酵母所偏爱的密码子来提高外源蛋白在毕赤酵母中的 表达量。在所有的6 1 个密码子中有1 9 - 2 5 个是酵母所偏爱的密码子，表达量高 的基因几乎毫无例外地使用这些偏爱密码子。 1 3 2 外源基因的内在特性 由于不同外源基因性质的不同，导致毕赤酵母表达系统表达水平相差也比较 大。主要表现在以下两个方面： a + t 含量外源基因中a + t 含量也可影响表达量，a + t 含量高的基因在毕赤 酵母中表达时可能会造成转录的提前终止，其共有序列a t t a t t t a t a a a 就是一 个典型的转录终止信号，同时a + t 含量高的序列还可能存在一些不太确定的转 录终止信号。其解决方法一般是通过重新设计序列，使a + t 含量控制在一个理想 的理论范围之内。 u t r 序列外源基因序列1 1 1 烈a5 端非翻译区( 5 u t r ) 的核苷酸序列和长度 是影响外源基因能否高效表达的一个重要因素。适当长度的5 u t r 可极大地促进 m r n a 的有效翻译，5 u t r 太长或太短都会造成核糖体4 0 s 亚单位识别的障碍。 5 江南人学硕士学位论文 a o x l 基因的5 u t r 长度为1 1 4b p ，当富含a + u 时，其编码的醇氧化酶表达量极高。 实验结果提示我们使外源m r n a 的5 u t r 尽可能和a o x l m r n a 的5 u t r 相似是 必需的。 1 3 3 基因的拷贝数 外源基因的拷贝数也是影响其能否在p i c h i a p a s t o r i s 中高效表达的一个重要 因素。不同外源基因对拷贝数的要求不同，大多数情况下，单拷贝外源基因与多 拷贝外源基因对表达量无明显的影响，而有些基因可通过增加外源基因的拷贝数 使表达量提高数十倍。许多实例表明含单拷贝外源基因表达框的宿主菌有时足以 获得最佳产量，并且在大多数情况下随着拷贝数的增加外源蛋白的表达量也会相 应增加。但也有研究发现，有些高拷贝数的基因反而会降低其表达水平，原因可 能是外源m r n a 的翻译效率低或蛋白通过内质网不能正确折叠或者折叠效率低 造成的。在一些实例中我们还发现增加拷贝数对蛋白质的表达产量反而会有副作 用。因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的，高表达菌株的筛选应以表 达蛋白量的高低为唯一标准。 1 3 4 培养条件 含氧量是影响表达水平的极为重要的因素之一。有报道认为，如果用发酵罐 进行培养，外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出1 0 1 0 0 倍。中科院上海 生化所用毕赤酵母表达的胰岛素前体，在摇瓶发酵时为4 0m g l ，而在1 0l 的发 酵罐中的表达水平为2 5m g l 。究其原因，可能是普通摇瓶发酵的溶氧效率不理 想，影响了菌体的高密度生长及表达。因此保持一定的溶氧浓度，可以降低底物 和有害废物的抑制作用，实现高密度发酵。研究表明，在毕赤酵母高密度发酵的 过程中，如果溶氧低于2 0 ，将会使菌体的生长和代谢受到影响；但如果溶氧过 高( 超过6 0 ) ，细胞就会发生氧中毒。由此可见，溶氧过高或过低都对外源蛋 白的表达有很大影响。因此，使溶氧保持在有利于外源蛋白高效表达的范围对于 高密度发酵来说是非常重要的l n 4 1 。 碳源也是影响高水平表达的重要因素之一。毕赤酵母表达培养基常用的碳源 是甘油，但甘油砌勰动子有抑制作用。t h o r p e 用山梨糖醇代替甘油作为碳源， 结果表明生物质量下降，但外源蛋白的表达有所提高。甘油的添加量也影响到外 源蛋白的表达，甘油添加的最适水平应该在利用甲醇诱导时能够被消耗殆尽的水 平卜【3 5 ，3 6 】 l l o 甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会对源蛋白的表达水平产生影响口7 1 。由 于过高浓度的甲醇会抑制细胞的生长和产物的表达，因此通过合适的策略控制甲 醇的流加是提高外源蛋白表达量的关键因素之一。在研究中，常采用下列3 种方 法来调控甲醇的流加：( 1 ) 根据溶氧控制甲醇流加； ( 2 ) 通过气相色谱检测控 制甲醇流加；( 3 ) 采用甲醇甘油混合流加。除上述3 种方法外，华东理工大学 6 第一章绪论 生物反应器国家重点实验室研制开发了甲醇传感器，通过在线检测甲醇浓度控制 甲醇的流加。 温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果1 3 引。温度对毕赤 酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质( 溶解氧量、基质的分解吸收速率等) 及生物合成方向等都有影响。从酶动力学角度看，温度升高，反应速率加大，代 谢速率加快，缩短了发酵周期；但温度过高，又会使酶变性失活，温度越高，酶 的失活速率也越快，具体表现在菌体易老化，发酵周期缩短，影响产物的产量。 据报道，毕赤酵母的培养温度为2 8 3 0 。c ，2 8 是酵母菌体生长的最适温度，3 0 是外源蛋白表达的最适温度。诱导期间，如果温度超过3 2 ，对蛋白表达不利， 甚至会导致细胞死亡。 毕赤酵母能在比较广的p h 值范围内( p h 3 0 7 o ) 生长，因此可以选择适宜外 源蛋白表达的p h 值。比如半乳糖氧化酶( o a o ) 在p h 值低于6 时表达量很低，但在 p h 值为6 时表达量达到最高。过高的p h 值同时又会影响蛋白的积累，尤其在基因 工程菌分泌表达过程中，有些蛋白对p h 值比较敏感，容易受到蛋白水解酶的水 解。因此针对不同的蛋白必须选择与之相适应的p h 值，这样既可以高效表达目 的蛋白又能抑制蛋白酶的水解，保持目的蛋白的稳定性。尽管毕赤酵母生长的p h 值范围比较宽，但是具体到不同的重组工程菌，就各有不同的最适生长p h 值 3 9 a 0 o 1 3 5 蛋白酶的降解 对于表达分泌型外源蛋白来说，蛋白酶降解是影响表达量的一个重要因素。 蛋白酶降解常引起目的蛋白表达量减少、生物活性降低，并可能在分离纯化过程 中造成产物污染。外源蛋白的稳定性也直接影响到基因的表达量，几乎没有一种 高表达蛋白是特别稳定的，宿主菌内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速率。随 着重组蛋白的分泌增加，其它一些细胞内物质( 如蛋白酶等) 的分泌量也增加， 在培养基中积累从而造成对重组蛋白的降解。此外酵母细胞膜上有一种k e x 2 样蛋白水解酶，能专一性水解a 一因子前体中羧基端的肽键，即连续的2 个碱性氨 基酸( 如l l y s a r g ，l y s l y s 和a r g l y s 等) ，从而使目的蛋白降解【4 l j 。为了提高外源 蛋白在发酵液中的稳定性，使其免受蛋白酶降解，可采用以下几种解决方法：一 是改造尸p a s t o r i s 表达宿主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的 产物更加稳定，或使用已有的蛋白酶缺陷菌株，如s m d l1 6 8 ( h i s 4 ，p e p 4 ) 、 s m d l1 6 5 ( h i s 4 ，p r b l ) 和s m d l1 6 3 ( h i s 4 ，p e p 4 ，p r b l ) 等，亦可避免产物降解【4 副； 二是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物，提 供酵母细胞蛋白酶过量的底物，以减少目的蛋白的降解；三是由于p p a s t o r i s 能 忍耐较宽的p h 范围( p h 3 o 7 0 ) ，因此可通过调节溶液的p h 值来抑制蛋白水解酶 活性，防止目的蛋白降解；四是降低甲醇诱导表达时的培养度。m e i m 等通过将 7 江南大学硕士学位论文 诱导表达时的温度由3 0 降至2 5 ，使得半乳糖氧化酶表达量提高- 4 倍【4 3 j ；五 是通过添加特异性蛋白酶( 天冬氨酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶以及丝氨酸型 蛋白酶) 的抑制剂可以减少外源蛋白的降解m j ；六是将外源蛋白和蛋白水解酶抑 制剂基因共同表达来抑制蛋白酶活性，减少目的蛋白的降解，如将外源蛋白与一 种在毕赤酵母中稳定的蛋白伴侣融合表达，通过改变外源蛋白的性质来提高稳定 性。 1 4 本课题来源和研究内容 本研究室利用基因工程技术成功构建了i f n l 3 与人血清白蛋白融合蛋白 ( h u m a ni f n l 3 h s af u s i o np r o t e i n ，h i f n l 3 h s a ) 基因并在毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 ) 中表达，经检测融合蛋白分子量约为9 0k d a ，具有h s a 的抗原 性，用细胞病变抑制法测定摇瓶发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为6 4 0 i u m l ，并通过对5l 发酵罐上发酵过程参数及其过程控制对基因工程菌毕赤酵 母表达h l f n p h s a 影响的研究确定了一系列的发酵参数。在表达过程中，融合 蛋白发生降解，很大程度上影响了表达产物的积累；同时在一定程度上也阻碍了 融合蛋白在规模化生产上的发展。解决融合蛋白的降解，抑制蛋白酶的水解作用 成为目前工作的关键。本文针对这株毕赤酵母工程菌表达r a f n p h s a 融合蛋白 过程中出现的比较严重的降解问题进行初步的研究 主要研究任务包括： ( 1 ) 从本实验保藏的重组k m 7 1 i h 菌株出发，以提高融合蛋白h i f n p h s a 的表达量为目标，考察与蛋白酶活性相关的营养和环境等单因素对融合蛋白 h l f n p h s a 表达的影响，并在单因素实验基础上应用响应面法( r s m ) ，以表 达过程中发酵液中的目的蛋白r a f n p h s a 为响应值，对诱导p h 、氮源、蛋白酶 抑制剂等影响目的蛋白主要参数进行优化，以期得到最佳的控制目的蛋白水解， 提高融合蛋白表达量的控制策略。 ( 2 ) 通过s d s p a g e 的w e s t e r n b l o t t i n g 杂交实验确定这株重组菌在融合蛋 白分泌表达时降解。并进一步通过h p l c 确定蛋白酶水解的作用部位。同时应用 活性电泳技术对发酵液和工程菌体系中的主要蛋白酶进行初步的酶谱分析，初步 确定降解这一蛋白的蛋白酶种类。 8 第二章营养及环境条件对融合蛋白h l f nb h s a 表达的影响 第二章营养及环境条件对融合蛋白h l f n p h s a 表达的影响 2 1 引言 本课题组前期工作已经对毕赤酵母基因工程菌摇瓶培养的生长条件和表达 条件做了初步的探索，使这株基因工程菌在摇瓶发酵培养和发酵罐培养中都可以 表达这一融合蛋白。但是在进一步的研究中发现在表达过程中蛋白会发生不同程 度的降解，严重影响融合蛋白i f n 3 h s a 的表达量。 在研究毕赤酵母对外源蛋白的表达时，国内外的学者发现毕赤酵母液泡中含 有多种蛋白酶【5 5 】，并认为蛋白酶是影响外源蛋白表达的重要因素之一。同时发 现，这些蛋白酶的酶活水平随着诱导环境中的营养物质的差异而有所不同，特别 是氮源的缺乏会造成发酵液蛋白酶活力的增强【5 4 1 ，培养基中补加一些酪蛋白水 解物、胃蛋白水解物【5 6 】或者直接添加各类氨基酸都是控制蛋白酶活性的有效措 施；另外一些学者在研究中发现，采用控制蛋白p h 值的方法可以有效的控制发 酵液中蛋白酶的活力，提高外源蛋白的产量；发酵过程中，选择性的添加一些蛋 白酶抑制剂也是控制发酵液中蛋白酶的活力进而提高外源蛋白的产量的有效途 径。但有时这些因素又不是独立的作用因素，它们之间往往又会发生交互作用， 响应面分析的方法可以在很大程度上满足了这些要求，可以得到一个最优的添加 策略，最大限度地控制蛋白酶的活性，从而控制目的蛋白的降解，使外源蛋白的 表达量达到最大。 在本研究中发现，虽然目标蛋白l l i f n d h s a 的降解十分严重，但由于发酵液 中蛋白酶含量相对较少，目前蛋白活力很难准确定量，故本章主要是以提高融合 蛋( j h i f n 3 h s a 的表达量为目标，考察与蛋白酶活性相关的营养和环境等单因素 对融合蛋白h i f n b h s a 表达的影响，并在单因素实验基础上应用响应面法 ( r s m ) ，以表达过程中发酵液中的目的蛋白h i f n 3 h s a 为响应值，对诱导p h 、 氮源、蛋白酶抑制剂等影响目的蛋白主要参数进行优化，以期得到最佳的控制目 的蛋白水解，提高融合蛋白表达量的控制策略。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 携带有i f n d h s a 融合基因的重组毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) k m 7 1 p p i c 9 k i f n b h s a ( 简称k m 7 1 i h ) 由本研究室构建并保存【4 5 】。 2 2 2 培养基 ( 1 ) 种子斜面固体培养基( y p d ) g l ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏1 0 ，琼 脂2 0 9 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 菌体生长培养基( b m g y ) g l -蛋白胨2 0 ，酵母膏1 0 ，1 0 0m m o l 1 p h = 6 0 磷酸缓冲液，y n b1 3 4 ，甘油1 0 ，生物素0 0 0 2 ( 3 ) 诱导培养基( b m m y ) g l , 蛋白胨2 0 ，酵母膏1 0 ，1 0 0m m o v lp h 6 0 磷 酸缓冲液，y n b1 3 4 ，甲醇2 0 ，生物素0 0 0 2 ( 4 ) p l a c k e t t b u r m a n 实验发酵培养基：按照实验设计配制。 ( 5 ) 最陡爬坡实验培养基：按照实验设计配制 2 2 3 主要试剂 亮氨酸( l e u ) ，谷氨酸( g l u ) ，赖氨酸( l y s ) ，丙氨酸( a l a ) ，缬氨酸( v 甜) ，苯丙 氨酸( p h e ) ，苏氨酸( r h r ) ，半胱氨酸( c y s ) ，天冬氨酸( a s p ) ，精氨酸( a r g ) ，酵母氮 基( y n b ) ，菲哕啉( p h e n a n t h r o l i n e ) ，苯甲酰胺( b e n z a m i d e ) ，乙二胺四乙酸( e d t a ) 从上海生物工程有限公司购得。 蛋白胨，酵母粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，葡萄糖，甲醇，乙醇，盐酸， 生物素，氯化钙和甘油从中国医药( 集团) 上海化学试剂公司。 2 2 4 主要仪器和设备 l s 。b 5 0 l 型立式圆形压力蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂 h y g i i 型回旋式恒温调速摇床上海新星自动化控制设备成套厂 7 5 2 型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 低速冷冻离心机s i g m a 公司 p h s 3 c 型精密p h 计 雷磁仪器 m u l t i s k a mm 1 ( 3 酶标仪t h e r m o 公司 2 2 5 常用缓冲液的配制 ( 1 ) l o y n b 称取1 3 4gy n b ，1 0 0m l 去离子水溶解 ( 2 ) 1 0 甘油 用移液管取2 0m l 甘油，加到8 0m l 去离子水中，配制成1 0 甘油 ( 3 ) lm o l lp h6 0 磷酸缓冲液 称取磷酸氢二钾1 5 0 6g ，磷酸二氢钾5 9 0 6g 分别用6 6m l 和4 3 4m l 去离 子水溶解。溶解完全后，将磷酸氢二钾溶液缓慢加入磷酸二氢钾溶液中，边加边 搅拌，使得磷酸缓冲液的最终p h 为6 0 。 ( 4 ) 5 0 0 b i o t i o n 称取2 0m g 生物素，1 0 0m l 去离子水溶解，避光保存。 ( 5 ) 氨基酸标准溶液的配制 分别称取l e u ，g l u , l y s ，a l a ，v a l ，p h e ，t 虹c y s ，a s p ，a r g ，各o 5g 定容至5 0 m l ，配制成1 的氨基酸溶液，微孔虑膜过滤除菌。 1 0 第二章营养及环境条件对融合蛋白h i f n1 3 一h s a 表达的影响 2 2 6 培养方法 ( 1 ) 斜面种子培养 将保藏菌株划线于y p d 平板上，3 0 恒温培养4 8h ，得到单菌落，再从 y p d 平板培养基上挑出单菌落，接种于新鲜的y p d 斜面上，3 0 培养2 4h 。 ( 2 ) 摇瓶种子培养 挑取一环新鲜培养2 4h 的y p d 斜面上的菌体，接种于装有2 0m lb m g y 培养基的2 5 0m l 三角瓶中，于3 0 ，2 5 0r m i n 振荡培养3 8h 。 ( 3 ) 摇瓶诱导培养 将摇瓶种子培养的种子液全部转移到无菌的5 0m le p 管中，室温下5 0 0 0 r m i n 离心5m i n 收取酵母细胞，加入5m lb m m y 重悬细胞。将重悬细胞转移 到无菌的试管中，于3 0 ，2 5 0r m i n 振摇，进行诱导培养。每2 4h 补加一次1 0 0 甲醇至终浓度1 ，持续诱导培养9 6h 。将诱导培养物转移到1 0m le p 管中，室 温下5 0 0 0r m i n 离心5r a i n ，收集上清。每个条件设3 个平行样，实验结果以平 均值表示。 2 2 7h l f n d h s a 的测定 本文采用微量人白蛋白检测试剂盒( 上海名典生物工程公司产品) 检测诱导 后发酵上清液中h s a 含量，并依据h s a 与t a r s i 3 按l ：1 结合，故根据公式： c ( 1 l i f n b h s a ) = c ( h s a ) x 8 4 7 6 6 2 计算融合蛋白的含量，式中6 6 2k d 为h s a 分子量， 8 4 7k d 为h i f n l 3 h s a 分子量。 2 2 8 表达过程中的单因素影响 ( 1 ) p h 值 将诱导培养基的初始p h 分别调至2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、 1 0 0 。用盐酸和3 0 n a o h 调节。 ( 2 ) 氮源的添加