（农产品加工及贮藏工程专业论文）米根霉产L乳酸耐高温菌株的选育及发酵条件优化.pdf

米根霉产l 乳酸耐高温菌株的选育及发酵条件优化 摘要 采用不同剂量的c 0 6 0 丫射线对米根霉a s 3 8 1 9 进行辐射诱变，通过种子培 养基温度梯度驯化，溴钾酚绿平板初筛，发酵复筛的选育方法，获得一株在3 8 下高产l 乳酸的突变株，命名为m u t 5 ，该菌株产l 一乳酸的量为9 1 2 0g l ， 比出发菌株提高了2 4 15 。斜面转接七代后，该突变株的摇瓶产l 乳酸能力 比较稳定。 通过单因素试验和正交试验，优化突变株m u t 5 的摇瓶发酵条件。确定最 优发酵培养基组成：葡萄糖1 2 0g l ，( n h 4 ) 2 8 0 44g l ，k h 2 p 0 40 3g l ， z n s 0 4 7 h 2 00 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 4g l ，c a c 0 36 0g l 。在发酵温度为3 8 的条件下，最适培养条件为接种量1 0 ，装液量2 0 ，摇床转速2 0 0r m i n 。 突变株m u t 5 产l 一乳酸的能力达9 2 8 4g l 。 为了初步研究乳酸生物合成中的能量代谢，分别考察了温度对突变株m u t 5 和出发菌株f l f o a t p a s e 活力，胞内能荷( e c ) 和氧化还原度的影响。结果 表明：能荷与f l f o a t p a s e 活力呈正相关性，而氧化还原度与能荷呈负相关性。 在3 8 下，突变菌株的f l f o a t p a s e 活力比出发菌株提高4 2 3 7 ，显著高于 3 2 培养下出发菌株的f l f o a t p a s e 活力。 f i f o a t p a s e 的典型抑制剂d c c d 对突变株f l f o a t p a s e 活力和产l - 乳酸 均有影响。对3 8 下发酵4 8h 的菌丝体进行f l f o a t p a s e 活力研究，发现突 变菌株未加d c c d 时的f l f o a t p a s e 活力比出发菌株未加d c c d 时的 f l f o a t p a s e 活力高，当加入d c c d 后，突变株的f i f o a t p a s e 活力降低了2 0 8 4 ；d c c d 的不同浓度对突变株产乳酸都有影响，突变株加入d c c d 的浓度为 0 8m m o l l 时的最高乳酸产量比不加d c c d 时的最高乳酸产量降低了l5 5 9 。 因此，突变菌株f l f o a t p a s e 活力提高，使细胞内a t p 的量增加，提高了细胞 对外界环境压力的抵抗力，从而提高了突变菌株对温度的耐受性，也保证了乳 酸的产量。 关键词：米根霉耐高温突变株l 乳酸发酵条件优化 f l f o a t p a s e能荷氧化还原度 s c r e e n i n go fh e a t r e s i s t e n tr h i z o p u so r y z a es t r a i np r o d u c i n g l l a c t i ca c i da n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a b s t r a c t r h i z o p u so r y z a ea s 3 819w a sm u t a g e n i z e dw i t h c 0 6 u1 ，- i r r a d i a t i o n ，a f t e r d o m e s t i c a t e di ns e e dm e d i u mb yt e m p e r a t u r eg r a d i e n t ，a n dt h e nf i r s ts c r e e n e dw i t h b r o m o c r e s o lg r e e np l a t e ，s e c o n ds c r e e n e dw i t hf e r m e n t a t i o n m u t 一5w a ss c r e e n e d o u t ，w h i c hw a sr e s i s t a n tt oh i g ht e m p e r a t u r eo f3 8 a n di t sl - l a c t i ca c i dy i e l d w a s91 2 0g l ，i n c r e a s e d2 4 15 c o m p a r e dw i t hp a r e n ts t r a i n h e r e d i t a r ys t a b i l i t y t e s td e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o d u c t i v i t i e so fm u t 一5f r o m18 t o7 “s e r i a lp a s s a g ew e r e s t a b l e b yu n i f a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g no fe x p e r i m e n t ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s o ft h em u t 一5w e r eo p t i m i z e dw i t hf l a s k t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r eg l u c o s e12 0g l ，( n h 4 ) 2 s 0 44g l ，k h 2 p 0 4o 3 g l ， z n s 0 4 7 h 2 00 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 4g l ，c a c 0 36 0g l u n d e rt h ec o n d i t i o n t h a tt h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s38 ，t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e i n o c u l u m sv o l u m e10 1 i q u i dv o l u m e2 0 ，r o t a t i n gr a t e2 0 0r m i n t h el l a c t i c a c i dy i e l do fr o u t 一5r e a c h e d9 2 8 4g l i no r d e rt op r e l i m i n a r ys t u d ye n e r g ym e t a b o l i s mo fl a c t i ca c i db i o s y n t h e s i s ， t h er e s e a r c hw a sf o c u s e do ne f f e c t so ft e m p e r a t u r eo nt h ef if o a t p a s ea c t i v i t y ， i n t r a c e l l u l a re n e r g yc h a r g e ( e c ) a n do x i d a t i o n - r e d u c t i o ns t a t eo fr o u t 一5a n dp a r e n t s t r a i nr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a te n e r g yc h a r g ea n dt h ef1f o a t p a s e a c t i v i t yw a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o n ，a n do x i d a t i o n - r e d u c t i o ns t a t ea n de n e r g yc h a r g e w a san e g a t i v ec o r r e l a t i o n i n38 ，t h ef if o a t p a s ea c t i v i t yo fm u t - 5w a s i n c r e a s e d4 2 37 c o m p a r e dw i t hp a r e n ts t r a i n ；a n dh i g h e ro b v i o u s l yt h a nt h e f 1 f o a t p a s ea c t i v i t yo fp a r e n ts t r a i ni n3 2 ，n - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ( d c c d ) ，w h i c h i st h es p e c i f i ci n h i b i t o ro f f 1f o a t p a s e ，h a de f f e c t so nfif o a t p a s ea c t i v i t ya n dl l a c t i ca c i dp r o d u c i n g f ，f o a t p a s ea c t i v i t yw a sr e s e a r c h e di nf e r m e n t e d4 8ha n di tw a sf o u n dt h a t f i f o - a t p a s ea c t i v i t yo fm u t - 5w i t h o u td c c dw a sh i g h e rt h a np a r e n ts t r a i n w i t h o u td c c di n3 8 ，w h e nt h ed c c dw a sa d d e d ，t h ef i f o - a t p a s ea c t i v i t yo f m u t 一5w a sd e c r e a s e db y2 0 8 4 t h ec o n c e n t r a t i o no fd c c dh a de f f e c t so nm u t 一5 f e r m e n t a t i o np r o d u c i n gl a c t i ca c i d t h el - l a c t i ca c i dy i e l do fm u t 一5 ，w h i c ha d d e d t h ec o n c e n t r a t i o no fd c c dw a so 8m m o l l w a s15 5 9 l o w e rt h a nt h el - l a c t i c a c i d y i e l d o fm u t 5w i t h o u td c c d t h e r e f o r e ，w i t ht h ee n h a n c e m e n to f l e y w 。r d s ：竺h i z o p u so r y z 口p ；h e a t - r e s i s t a n tm u t a n t ；l j a c t i ca c i d ； 眦小a i ：鲫c o 删n i o n o p t i m i z a t i o n f l f o - a t p a s e e n e r g yc oxidation r e d - u c t i o ns t a t e c n a r g e d ，哪 州 唱衙 铡。比n ， 1 i d o u e 肾d s r r 0 a n n 罴删 c ，d耋量咖 p 唔 t 璺k 篙一 甜 恣0 妇 螨 i ，枷也k m 培她蓦嘴 卜 m 把 酣 e m t t 乜 n m u 帅 埘 m 卧= 蛔 卜 a a 删 j 詈 1 f 芒 舢 咖眦 唧 ) 1 舒鲫协 c e 由 毗 甲 e k t a 鹭 渊 煳 图1 1 图1 2 图2 1 图2 2 图2 3 图2 4 图2 5 图2 - 6 图2 7 图2 8 图2 9 图2 一l0 图2 1 1 图2 12 图3 1 图3 2 图3 3 图3 4 图3 5 图3 6 图3 7 图3 。8 图4 1 图4 2 图4 3 图4 4 插图清单 乳酸的结构式1 论文的技术研究框架图1 1 还原糖含量标准曲线1 6 乙醇含量标准曲线1 7 蛋白质含量标准曲线1 9 c 0 6 u 丫射线对米根霉a s 3 819 的致死率和正突变率的影响2 0 耐高温突变株的初筛结果2 1 耐高温突变株纯化后筛选结果”2 2 突变菌株m u t 5 和出发菌株发酵产l 乳酸与发酵时间的关系2 2 突变菌株m u t 5 和出发菌株发酵产乙醇随发酵时间的变化2 3 突变菌株和出发菌株发酵中还原糖变化2 3 突变菌株和出发菌株发酵中生物量变化2 4 发酵过程中l d h 活力变化曲线2 4 发酵过程中a d h 活力变化曲线2 5 葡萄糖浓度对乳酸产量的影响2 9 硫酸铵浓度对乳酸产量的影响3 0 硫酸锌浓度对乳酸产量的影响3 0 硫酸镁浓度对乳酸产量的影响31 磷酸二氢钾浓度对乳酸产量的影响3 1 装液量对乳酸产量的影响3 3 转速对乳酸产量的影响3 3 接种量对乳酸产量的影响3 4 突变菌株m u t 5 和出发菌株能荷的变化3 9 突变菌株m u t 5 和出发菌株氧化一还原度的变化4 0 突变菌株m u t 5 和出发菌株f l f o a t p a s e 的变化4 0 抑制剂d c c d 对突变株f l f o a t p a s e 的影响4 1 表3 1 表3 - 2 表3 3 表4 1 表4 2 插表清单 正交试验因素水平表2 8 l 9 ( 3 4 ) 正交实验设计及实验结果3 2 方差分析表3 2 抑制剂d c c d 对突变株产乳酸的影响4 2 突变株与出发菌株乳酸、生物量、l d h 和a d h 比活力的比较4 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得 金肥王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者擀稍跏 签字日期：呵年伞月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金且巴工业太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权 金日巴工业太堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名： 嘲如 签字帆岬年伞月加日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 翩襁，匆廷翩签名剧边 签字日期力曲产阳娜 ， 电话： 邮编： 致谢 本研究论文是在姜绍通教授和罗水忠老师的悉心指导下完成的。在两年半 的攻读学位期间，姜绍通教授作为我的导师，他以严谨的治学态度和开阔的学 术视野逐步引导我怎样去探求学问和克服困难，对我的科研能力的提高起到了 十分重要的作用，同时在生活上给我的无私关怀让我深切的感受到为人师长的 辛劳和为人学子的幸福；罗水忠老师和蔼的为人和敬业精神也是我终生学习的 榜样。在此谨向两位恩师表示衷心的感谢和深深的敬意。 我还要感谢潘丽军教授、潘利华老师、李兴江老师、郑志老师、陈小燕老 师、操丽丽老师、韩卓老师给我的指导和帮助。以及吴学风师姐、潘牧师兄， 刘靖、聂慎德等及本科生顾春燕在实验过程中给予的大力帮助。 感谢在同一个宿舍生活的好友张必芳、韩抒对我生活上的关心和实验中的 支持。以及众多朋友对我的帮助和鼓励，这里一并向他们致谢并祝愿他们前程 似锦。 最后，我还要特别感谢我的姐姐和妹妹，是她们给了我经济上的支持，使 我能顺利的完成学业，还要感谢父母这些年来对我的养育之恩，父母的亲情永 远是我力量的源泉。 作者：胡燕红 2 0 0 9 年2 月16 日 第一章绪论 1 1 乳酸的结构及理化性质 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) ，学名q 羟基丙酸( a h y d r x y p r o p i o n i ca c i d ) ，分子式 c h 3 c h o h c o o h ，是一种常见的、结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动 物、植物和微生物中。乳酸分子中有一个不对称的碳原子，因此乳酸具有旋光 性，l 一( + ) 一乳酸为右旋型，d 一( ) 乳酸为左旋型，d l 乳酸为消旋型，结构式如 图1 1 【1 1 。 h o o c h h 3 c l - ( + ) - 乳酸 图1 1 c o o h ； h 洲 i ； c h 3 d - ( - ) - 乳酸 乳酸的结构式 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点1 6 8 ，沸点1 2 2 ( 2k p a ) ， 相对密度1 2 4 9 。乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物，为无色透明或浅黄色糖 浆状粘性液，几乎无臭或略带脂肪酸臭，味酸，与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、 丙酮混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯【2 】。乳酸浓度达到6 0 以 上，具有很强的吸湿性。商品乳酸含量通常为6 0 ，食品级乳酸含量为8 0 以上，药典级乳酸含量为8 5 - - 9 0 。在6 7 1 3 3p a 的真空条件下反复分馏， 可得到高纯度的乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸。乳酸分子内有一个羟基 和一个羧基，可以参与氧化、还原、缩合、酯化反应【3 】，而且加热乳酸时发生 自动酯化，可形成乳交酯。 1 2 乳酸的应用 乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，其用途极为广泛。乳酸、乳酸盐及 其衍生物广泛应用于食品、医药、饲料、化工等领域【4 】。乳酸作为一种有巨大 潜力的产品，未来的发展机会在于其作为原料大规模的应用于如下4 个方面：可 生物降解塑料、氧化化学品、绿色化学品和溶剂以及植物生长调节剂等1 5 j 。 人体中只含有l 一乳酸脱氢酶，因而只能利用自体产生或摄入的l - - 孚l 酸。 由于l 一乳酸对人体无毒副作用，且易吸收，可直接参与体内代谢，因此被广泛 用作酸味剂、防腐剂和还原剂1 6j 。l - - ? l 酸还可用于清凉饮料、糖果、糕点的生 产，也可用于鱼、肉、蔬菜的加工和保藏。另外，l 乳酸有很强的杀菌作用， 其杀菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的几倍，可以直接用作手术室、病房、 实验室、车间等场所的消毒剂1 7j 。l 乳酸、l 乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合 配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。l 乳酸的铁、钠、钙盐等溶解性好， 是补充金属元素的良好药品。 乳酸可以用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽，使之触感柔软。 在化妆品和清洁卫生用品方面，乳酸和乳酸钠可作为滋润剂、皮肤增白剂、p h 调节剂、保温剂、抗菌剂、乳化剂、稳定剂，延长产品的保质期，提高产品的 质量。乳酸可添加于烟草中，能保持烟草的湿度，提高烟草的质量。乳酸可用 于制革工业中脱石灰，它能使石灰变成可溶性的乳酸钙盐而除去，使皮革柔软、 细密，从而制成高级皮革。l 乳酸还可作为植物生长活力剂，水产用生菌剂等 应用于农、渔业上，具有十分诱人的开发前景【7 8 】。 l 乳酸的聚合物一一聚l 一乳酸( p l a ) 是无毒高分子化合物，具有生物相容 性，在人体内可以被分解为l - - t l 酸，为人体所代谢。因此，聚l 一乳酸可用于 生产缓释胶囊制剂【9j ，从而使血液循环中药物浓度相对降低，大大提高疗效， 降低副作用，在治疗癌症方面取得可喜进展；也可制成手术缝合线，随伤口愈 合而被机体分解吸收，无需拆线，这特别适合机体深部组织的缝合，减少病人 的痛苦；还可制成生物植片，以修复骨折或其它机体损伤。聚l 一乳酸除在医药 行业中使用外，由于其具有与聚苯乙烯相似的光泽度、加工性能及生物可降解 性，可以广泛用于降解塑料及绿色包装材料的生产【l0 1 。近年来，人们发现聚 l 一乳酸在空气、水和普通细菌存在下可完全分解成水和二氧化碳，形成良好的 生态循环【l ，因而可以消除“白色污染”。聚l - $ l 酸由于具有良好的机械性能， 熔点高，其膜材对氧、水汽有良好的透过性，又有较好的透明性，还有较好的 抗菌、防霉性，使用寿命可达2 3 年，已经成为良好的绿色材料。在美国和日 本，聚乳酸已用于涂料层、透明塑料容器、发泡容器、薄膜、餐馆容器、儿童 玩具、蔬菜包装等方面【l2 。h j 。 1 3 乳酸的生产方法 1 3 1 化学合成法 1 9 6 3 年，美国m o n s a n t o 公司开始采用化学合成法生产乳酸【l4 1 。化学合成 法生产乳酸可通过多种途径进行，其中具有现实意义的是乳腈法。该法是乙醛 与氢氰酸经碱性催化剂作用生成乳腈，然后粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐 酸或硫酸水解为乳酸，同时产生相应的氨基酸副产物。粗乳酸用甲醇醋化得乳 酸甲酯，精馏后再水解为乳酸【l5 1 。乳酸的其它一些可行的化学合成法包括糖的 碱性催化水解、丙烯乙二醇氧化、乙二醇的硝酸氧化等。 2 1 3 2 酶转化法 酶法生产乳酸主要有2 氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化。 日本东京大学的木畸等6 】研究了用酶法生产乳酸，分别从恶臭假单胞菌和 假单胞菌l13 细胞中纯化出l 一2 卤代酸脱卤酶( 简称为l 酶) 和d l 2 卤代酸 脱卤酶( 简称为d l 酶) ，使之作用于底物d l 2 一氯丙酸，就可得到l 一乳酸或 d 一乳酸。 h u m m e l 等【l j 从d 一乳酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 菌体中 得到d 一乳酸脱氢酶，然后以无旋光性的丙酮酸为底物转化得到d 一乳酸。 1 3 3 发酵法 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等为原料，经微生物代谢制得。自然界 中产乳酸的微生物很多，但产酸能力强，可以应用到工业上的只有根霉属和乳 酸菌类【1 7 , 1 0 1 。其中生产乳酸的细菌菌株主要采用德氏乳杆菌，其生产的乳酸主 要为d l 一乳酸，采用厌氧分批式发酵。对于传统的发酵原料一一小麦面粉水解液， 德氏乳杆菌较之干酪乳杆菌有更高的产量和生产率。目前国内外研究的重点是 诱变选育耐高糖和高酸的德氏乳杆菌菌株，并进行高浓度发酵驯化【1 8 之0 1 。根霉 属中的米根霉是生产l ( + ) 一乳酸的理想菌种，目前国内外研究者所采用的根霉 菌种多为米根霉1 2 1 1 。 1 3 4 乳酸生产方法的比较 化学合成法的主要缺点是产品为外消旋乳酸，即d l 一乳酸；并且其原料为 乙醛和剧毒物一一氢氰酸，许多人对其产品的安全性表示担心，此外化学合成 法的生产成本也较高，因而使得化学合成法生产乳酸受到很大的限制。酶法生 产乳酸虽可以专一性地得到旋光乳酸，但工艺复杂且不成熟，应用到工业上还 有待于进一步研究。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而 获得具有立体专一性的d 一乳酸、l - $ l 酸或是两种异构体以一定比例混合的消 旋体，以满足生产聚乳酸的需要。另外发酵法生产乳酸不仅能以葡萄糖、乳糖 等单糖为碳源，还能利用淀粉、纤维素等为原料发酵生产乳酸，因此微生物发 酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生产成本低，产品光学纯度高，安全性高等 优点而成为生产乳酸重要的方法。 1 4 米根霉发酵生产l ( + ) 乳酸研究进展 根霉属中产l ( + ) 乳酸的菌种很多，有米根霉、黑根霉、华根霉、行走根 霉、小麦曲根霉和美丽根霉。其中米根霉生产l ( + ) 乳酸的能力最强，但发酵周 期长，糖转化率低，发酵温度低、易染杂菌等缺点限制了其在实际生产中的应 用。因此，国内外许多学者对米根霉的菌种改良做了大量研究，主要集中在发 酵工艺的改进、高产菌株的选育、代谢机理研究及代谢通量分析、代谢关键酶 3 的研究等方面。 1 4 1 发酵工艺研究 近年来对根霉发酵生产l ( + ) 乳酸的发酵工艺研究主要集中在发酵原料的 选择、发酵条件的优化和菌丝形态对发酵及分离效率影响等方面。为了提高乳 酸生产率，改进分离过程，围绕乳酸生产各个单元过程开发了许多新技术 2 2 - 2 7 ： 采用半间歇或连续操作改进生产；采用固定化技术或细胞循环反应器得到高浓 度细胞提高乳酸产量；采用发酵一分离耦合的萃取发酵技术等。 l9 8 5 年河合启一申请了固定化米根霉生产l 乳酸的专利1 2 8 。1 9 8 9 年h a n g 等【z 9 j 研究报道了用海藻酸钙固定化米根霉生产l ( + ) 一乳酸的方法，实验结果表 明乳酸产量和葡萄糖的利用率均高于使用游离细胞进行发酵。y i n 等人【30 j 采用 气升式发酵罐接种米根霉发酵，由玉米淀粉直接生产l 乳酸，所得乳酸的质量 浓度为1 0 2g l ，得率为8 5 。林建平等 2 2 - 2 4 】对转盘反应器固定化米根霉的l 乳酸发酵进行了研究，结果表明：此法进行乳酸发酵具有发酵速度快、l 乳酸 得率高及既能用于连续又能用于间歇发酵等优点，同时他利用发酵与离子交换 分离耦合技术进行乳酸发酵研究，简化了后续分离步骤。天津大学孙彦等人【2 5 2 6 j 采用聚氨酯泡沫法固定化米根霉发酵生产l 乳酸，速率提高了3 倍。t a y 等 人【3 l j 使用旋转的纤维床生化反应器( r o t a t i n gf i b r o u s b e db i o r e a c t o r ) ，将米根霉固 定在搅拌棒的衬基上，使细胞在其上生长而不是游离于整个发酵罐。这种方法 克服了传统的固定化中不利于营养物质、氧的传递等缺点。为了有效移走发酵 液中的乳酸，y a b a n n a v a r 4 】使用a l a m i n e 3 3 6 叔胺和油醇的混合物来萃取乳酸。 在膜法发酵方面，t e j a y a d i 和x a n i e r 等【4 j 进行了研究。t e j a y a d i 等采用反渗透与 发酵耦合起来成为膜生物反应器，在4 0g l 的游离菌浓度下连续操作，乳酸盐 浓度达8 9g l ，转化率为8 9 。x a n i e r 等采用管式超滤膜细胞循环生物反应 器进行乳酸发酵。长期发酵的结果，乳酸浓度和生产率都高于高密度发酵的结 果。 1 4 2 米根霉菌种改良 米根霉在分类上属于接合菌亚f - j ( z y g o m y c o t a ) ，接合菌纲( z y g o m y c e t e s ) ， 毛霉目( m u c o r a l e s ) ，毛霉科( m u c o r a c e a e ) ，根霉属( r h i z o p u s ) 。菌落疏松或稠密， 最初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝匍，2 4 匐爬行，无色。假根发达， 分枝呈指状或根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍弯曲株成束，与假根对生，有时 膨大或分枝，呈褐色，长2 1 0 - 2 5 0 0 斗m ，直径5 1 8l x m 。囊轴呈球形或近球形或 卵圆形，呈淡褐色，直径3 0 2 0 0p , m 。囊托呈楔型。孢子囊呈球形或近球形， 老后呈黑色，直径6 0 2 5 0u m 。孢囊孢子呈椭圆形、球形或其他形，呈黄灰色， 直径5 8l x m 。有厚垣孢子，其形状、大小不一致，未见接合孢子，该菌于3 7 4 0 4 能生长【3 2 】。 1 9 9 4 年w s u n t o r n s u k 和y d h a n g 3 3 通过紫外线诱变或亚硝基胍诱变处理米 根霉n r r l 3 9 5 ，得到3 株高产l ( + ) 乳酸的米根霉菌株1 n 1 、3 n 4 和4 n 6 ， 产酸分别为1 7 6 0 、1 7 6 0 和1 9 8 0g l ，至少比原始菌株提高5 7 ，其中3 n 4 菌株的糖化酶活力比原始菌株提高了5 4 。江苏省微生物研究所曹本昌等【3 4 】 选育了一株产l ( + ) 一乳酸的米根霉菌株j s m i r 7 3 ，并对该菌的发酵特性及影响 产酸的条件进行了研究，使用5 0 0l 发酵罐进行扩大实验，口服葡萄糖质量分 数13 时产酸1 0 1g l ，玉米粉质量分数2 0 时产酸10 5g l 。山西省微 生物研究所蒋明珠等【35 】采用自行选育的米根霉r 4 7 菌株，3 5 摇瓶培养4 8 h ，初始葡萄糖质量分数1 5 时产乳酸1 1 8 4 0g l ，糖转化率达7 8 9 0 。福 州大学杨虹等【3 6 。3 8 】利用淀粉酸性培养基富集培养，并结合k m n 0 4 一k c i 平板 检出的方法从土壤中筛选出根霉r 2 菌株，产乳酸8 1 g l ，并以其为出发菌 株经紫外线诱变，从琥珀酸平板上获得了变异株r 2 9 1 ，以葡萄糖为碳源产酸 10 3g l ，对糖转化率为6 8 9 0 。乔长晟等 3 9 , 4 0 】选育一株米根霉高产菌株 n a f 0 3 2 ，在优化的发酵培养条件下，发酵6 0h ，产乳酸9 4 2 8g l ，糖转化 率为6 7 9 6 。白冬梅等人【4 l l 利用酸性馒头片富集培养，用含脱氧胆酸钠和溴 甲酚绿平板检出的方法，从土壤中选出了根霉菌r o r y z a er 3 0 1 7 。并利用u v 、 硫酸二乙酯和6 0 c o 对菌株r o r y z a er 3 0 l7 进行了诱变选育，得到突变株 r 1 0 2 1 【4 引。当初始玉米淀粉浓度为1 2 0g l ，摇瓶发酵6 0h 后，该菌株产乳酸 7 9 4 0g l ，比出发菌株提高5 2 ，l 乳酸纯度达到9 9 0 5 。姜绍通、郑志等 m 3 j 在对米根霉菌株诱变的基础上，确定发酵控制参数，深入分析和讨论了代谢 途径。潘丽军等【4 4 】研究了米根霉发酵代谢关键酶一一乳酸脱氢酶的催化特性， 通过金属离子调控其活性，取得了很好的实际效果。李兴江等1 4 5 1 研究了米根霉 a s 3 8 1 9 发酵甘薯淀粉生产l - - 孚l 酸的最适条件。罗水忠、肖小发等1 4 6 利用同步 辐射软x 射线对米根霉a s 3 8 1 9 进行诱变，并研究了诱变菌株的发酵特性。 上述研究主要围绕米根霉高产菌种的诱变筛选，而发酵温度及其它环境耐 受菌株选育方面也有较多报道，其目的在于通过选育糖、产物、温度、p h 等耐 受性突变株以提高菌株的发酵性能。赵华等人【4 1 7 】通过u v b 照射培养和热冲击处 理，成功的选育出一株既耐酒精又耐温的酵母菌突变株u v - 7 3 6 1 2 1 7 ，该突变 菌株3 6 下在含1 6 ( v v )酒精的培养基中生长良好，三角瓶发酵酒精度 达到1 4 3 0 ( v v ) 。谭强【4 8 】采用紫外线照射和可见光复活，并结合7 5 高 温定向选育，得到一株耐高温菌株7 5 l 3 5 6 6 ，其在4 0 条件下，浓度为2 0 0b x 的麦芽汁发酵液中，产酒率高达1 1 5 0 ，而且发酵速度快，发酵周期可缩短1 2 h ，生产性能稳定。在根霉方面，周英俊等人【49 j 以黑根霉s w 3 4 1 为出发菌株， 利用c 0 6 0 丫射线进行诱变，选育出一株在3 4 下生长并且转化率较高的菌 株。 5 米根霉发酵产l 乳酸耐高温菌株选育研究尚未见文献报道。而以嗜热乳杆 菌为代表的细菌发酵产l 一乳酸工业菌种虽然营养需求及产物复杂、分离困难， 但是发酵温度高( 4 0 以上，远高于米根霉发酵产l 乳酸的3 2 ) ，而成为目 前发酵产l 乳酸工业的主要菌种之一。因此开展米根霉发酵产l 乳酸耐高温菌 株选育研究意义重大。 1 4 3 米根霉发酵产l 乳酸碳代谢的研究 米根霉发酵生产l 乳酸是一个复杂的代谢过程。在细胞内，葡萄糖在有 氧条件下，按照e m p 途径分解葡萄糖后，同时生成目标产物乳酸和主要副产 物乙醇，它们分别由乳酸脱氢酶( l d h ) 和乙醇脱氢酶( a d h ) 所催化形成p 。 因此，l d h 和a d h 是米根霉发酵产l 乳酸碳代谢的两种关键酶，通过对它 们活力的调控研究，最大程度的抑制a d h 活力和提高l d h 的活力，从而达 到降低乙醇转化率，提高l 乳酸转化率的目的。 ( 1 ) 乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) 乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s el d h ) 是一种寡聚酶，由四个亚基组成， 相对分子量大约为3 6 0 0 0 道尔顿，每一个亚基具有相同的功能，具有五种同工 酶，其作用是催化乳酸和丙酮酸的可逆转化，l 一乳酸脱氢酶可逆催化氧化l - 乳 酸为丙酮酸【5 。反应中乳酸脱氢酶分子的每一个亚基都结合一个底物分子和一 个辅酶分子( 烟碱胺腺嘌呤二核苷酸n a d + n a d h ) ，独立的发生反应。在氧 化l 乳酸的逆反应中，乳酸脱氢酶在n a d h 的辅助下，可逆催化还原去质子 化丙酮酸盐，生成去质子化l 乳酸盐。 o b a y a s h i 在1 9 6 6 年首次报道了在米根霉中存在n a d + 依赖型的乳酸脱 氢酶52 1 。k a t s u i c h is a i t o 以及a k a n es a i t o t 5 3 】等人在二十七种能够突出积累乳酸 的米根霉中发现了两种i d h 基因，分别为i d h a 与l d h b ，编码n a d + 依赖型 乳酸脱氢酶。经过研究，发现乳酸脱氢酶基因序列中的l d h 基因在乳酸合成中 可能起着相当重要的作用。c h r i t o p h e rd s k o r y 5 4 】从米根霉中分离克隆出n a d + 依赖型的l 乳酸脱氢酶的两个基因l d h a 和l d h b ，这两个基因不包含内含子， 并且有超过9 0 的核苷酸序列是相似的。作者通过对各种l d h 序列进行比 较后发现l d h a 和l d h b 不同于以前分离的真核生物和原核生物的l d h 基因。 本课题组从米根霉a s 3 8 1 9 中初步分离出乳酸脱氢酶，对其酶学特性、发酵体系 l d h 活力及代谢调控进行了研究【5 5 , 5 6 】。获得了该乳酸脱氢酶的最适反应p h 为7 4 ，最适催化温度为3 0 , - , 5 0 。m 9 2 + 、c a 2 + 对该酶有激活作用，k 十、z n 2 + 对该酶有抑制作用。以n a d h 和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7 2 2 x1 0 珥 m o l l 和1 2 4 x1 0 一m o l l 。 ( 2 ) 乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s ea d h ) 是一类分布广泛的含锌金属 6 酶，以n a d + ，n a d p + 或p q q 为辅酶。a d h 广泛分布于大自然中，在人和 哺乳动物的肝脏、植物组织、及微生物细胞中都有发现。a d h 具有广泛的底 物特异性，是许多有机体中的主要短链醇代谢的关键酶，它的生理作用在于可 逆的催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物【57 1 。在哺乳动物体内，a d h 和乙醛脱氢酶( a l d h ) 构成了乙醇代谢的主要氧化通道，是体内乙醇代谢的 主要限速因素垆引，a d h 主要催化乙醇生成乙醛，是人和动物各种器官和组织 内乙醇的氧化过程中的第一步，因此在解酒以及防止乙醇引起的肝损伤方面具 有重要意义；植物a d h 是其无氧呼吸的主要酶，乙醇发酵是根系厌氧胁迫时 的主要产能途径，a d h 则是关键酶之一【59 l ，因此植物a d h 的主要生理作用 是通过巴斯德效应维持较高的能荷来延长植株在缺氧条件下的存活时间【6 0 1 ，它 对植物在缺氧条件下的应激是非常重要的【6 1 1 ，另外，其它方面，在番茄果实的 成熟和软化以及植物芳香气味的产生过程中，a d h 都发挥了重要作用【6 2 1 。微 生物体内，a d h 是主要的短链醇代谢的关键酶，可逆的催化氧化短链醇、芳 香醇等为相应的羧基化合物，在不同的微生物中，其生理作用有所不同 6 3 - 6 5 l 。 微生物来源的a d h 中，酵母和一些嗜温细菌a d h 的报道较多，不同微 生物来源的a d h 分子量、催化特性等有所不同。大多数微生物中提取纯化的 a d h 为二聚体，但也有一些为四聚体。一些a d h 以p q q 为辅酶，它们电 子传递途径上有差别。酵母醇脱氢酶( y e a s ta l c o h o ld e h y d r o g e n a s ey a d h ) ，是 一条分子量为1 4 5k d a 的四聚体，每条肽链上结合一个n a d 十和一个z n 2 + 。 面包酵母y a d h 有3 种同工酶：y a d h 1 ，y a d h 2 ，y a d h 一3 。y a d h 1 是 在厌氧发酵时才表达；y a d h 2 是细胞质组成成分，为葡萄糖所抑制；y a d h 3 则在线粒体中发现，在成长的酵母细胞中y a d h 1 占了酵母y a d h 活性的 主要部分【6 6 1 。 目前针对a d h 在米根霉发酵过程中的活力变化情况及其分离纯化、酶学 特性研究极少 4 4 , 6 7 , 6 8 j 。米根霉发酵生产l 一乳酸是一个较复杂的代谢过程，属于 异型发酵，生成乳酸的同时还有副产物，其中乙醇占主要部分。因此对乙醇脱 氢酶的特性研究可以深入了解米根霉的代谢机理，为提高乳酸的产率以及分析 发酵过程的代谢流具有重要的意义。 1 4 4 米根霉发酵产l 乳酸能量代谢对碳代谢的调控研究 糖酵解途径是微生物细胞中至今为止研究的最为清晰的代谢途径。在真核 1 6 9 j 和原核【7u j 微生物中，通过糖酵解途径的流量不能通过过量表达基因编码糖酵 解的关键酶( 无论是单种酶还是复合酶) 而大量增加。研究表明，a t p 的需求 和供应在糖酵解过程中起着关键的作用【_ 7 1 】。已经得到充分证实，辅因子 a t p a d p 7 2 , 7 3 】、n a d h n a d + 7 4 1 和乙酰c o a 7 5 1 都参与了代谢途径，并在代谢 流的分布和速率上起着重要作用。然而，尽管经过大量的研究，对控制糖酵解 7 关键性因素和控制糖酵解流量的关键步骤却缺失精确的了解【7 6 】。本文尝试着从 a t p 酶活、微生物细胞的能量代谢和n a d h 再生与氧化途径三个方面来研究 米根霉a s 3 8 1 9 在较高温度下发酵产乳酸过程中糖酵解过程的能量变化，从而 来初步探讨耐高温菌株发酵产乳酸的机理及其对碳代谢的调控研究。 ( 1 ) a t p 合成酶( a t ps y n t h e t a s e ) a t p 合成酶( a t ps y n t h e t a s e ) 或f l f o a t p 酶( 或h + - a t p 酶) 广泛存在于 线粒体、叶绿体、异养菌和光合细菌中，是生物体能量转换的核心酶，他们分 别位于线粒体内膜，类囊体膜或质膜上，参与氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨 膜质子动力势的推动下催化合成a t p 。它是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷 酸化偶联的关键装置，也是合成能源物质a t p 的关键装置。不同来源的a t p 合 成酶基本上有相同的亚基组成和结构，都是由多亚基装置形成的。其分子结构 由突出于膜外的f l 头部和嵌于膜内的f o 基部两部分组成【7 7 1 。 水溶性外周蛋白f l 位于内膜突出于基质内的部分，它由五种亚基( 仅，p ， 丫，6 ，) 组成【7 引，一般认为这几个亚基的准量关系是0 【3 p 3 丫6 ，其中a ，p 亚基 上有核苷酸结合位点，且p 亚基的结合位点具有催化a t p 合成或水解的活性。 据氨基酸序列分析表明，a ，p 和丫亚基在各种物种中较保守，其中又以p 亚基 最为保守，6 和亚基保守性较差【_ 7 9 】。f o 是嵌合在线粒体内膜上的疏水蛋白复 合体，它也由各种亚基组成，但在不同物种中它的组成差别很大【8 0 】：在细菌( 大 肠杆菌) 中，f o 由a ，b ，c 三种亚基组成；在蓝藻中，f o 由a ，b ，6 ，c 四种 亚基组成