（环境科学专业论文）水环境中微生物及其胞外聚合物与重金属作用机理研究.pdf

贵州师范大学硕士学位论文 a bs t r a c t e x w a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e ( e p s ) s e c r e t e db ym i c r o o r g a n i s mp l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei np h a r r n a e y , c u l t u r e dm i l ka n dw a s t e w a t e rt r e a t m e n ti ne n v i r o n m e n t i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h ec o m b i n i n gm e c h a n i s mb e t w e e nm i c r o o r g a n i s m & i t s e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c ea n dh e a v ym e t a l s ，t h es t u d yu s e sas t i m u l a t i n g m e t h o di nl a b o r a t o r yt og r a d u a l l yu n d e r s t a n da tl a r g er e l a t i o n s h i po ft h r e ea s p e c t sa s f o l l o w s ：p h y s i o l o g i c a lr e s p o n s eo fm i c r o o r g a n i s mt oh e a v ym e t a ls t r e s s ，c h a n g i n g e p sp r o p e r t yi n d u c e db yh e a v ym e t a la n dt h ec o m b i n i n gm e c h a n i s mb e t w e e ne p s a n d h e a v ym e t a l s t h er e s u l t ss h o wi nt h ef o l l o w i n g f i r s t l y , e x i s t i n gc a + c a l ld e c r e a s es t r e s so fh e a v ym e t a lc do na l g a lc e l l s ，a n d p r o t e c tc e l l s f r o mm o r ed a m a g e ，w h i c hc a nb ea t t r i b u t e dt op r o t e c t i n ge f f e c to f c a l c i f i c a t i o nl a y e r st r i g g e r e db yb i o c a l c i f i c a t i o n s e c o n d l y , s l i g h tc uc a ni n d u c es y n e c h o c y s t i ss p t op r o d u c em o r ep r o t e i n - l i k e a n ds o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t l i k ee p st h a ti sm w 14 0 0 0 d a a n dh u m u si ne p si s n o tf r o ms e c r e t i o no fm i c r o o r g a n i s m ，b u td e c a y i n ga n dd e c o m p o s i n gm i c r o o r g a n i s m i si t ss o u r c e f i n a l l y , t h er e s u l t sa b o u tc o m b i n i n gm e c h a n i s mb e t w e e nh e a v ym e t a lc da n d t w o e p s ss h o wt h a ta no b v i o u sq u e n c h i n ge f f e c to fl bt r i g g e r e db yc dc o n c e n t r a t i o n l e s st h a nlxl0 4m o l l 1c a nb eo b s e r v e da tp hv a l u e4 t h ep h e n o m e n at h a tw a s q u e n c h e da tl o w e rp hv a l u ew a sn o to n l yr e l a t e d 埘也t h ep r o t o n a t i o ne f f e c to f f l u o r o p h o r e s b u ta l s ol i n k e d 、撕mt h ec h a n g eo fc o m b i n i n gs i t e sb e t w e e nc da n d p r o t e i n - l i k e i na d d i t i o n , f o rt h ea n a l y s i so ff u r t h e rt h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e s p e c t r u m ，f l u o r o p h o r e so fp r o t e i n - l i k ei nl bh a v ec h a r a c t e ro fs i n g l e n e s s ，w h e r e a s f l u o r o p h o r e so ft bh a v eac h a r a c t e r i s t i co fd i v e r s i t y a tp h10q u e n c h i n go f f l u o r e s c e n c ep e a k so fp r o t e i n - l i k ei nl ba n dt ba ler e s u l t e df r o mt w oa s p e c t s ，o nt h e o n eh a n d ，i tw a sr e l a t e d 州t l lt h ep r o d u c t i o no fe p s c dc o m p l e x ，a n d0 1 1t h eo t h e r h a n di tc a nb ea t t r i b u t e dt oc o l l i d i n gq u e n c h i n gb e t w e e nf l u o r e s c e n c em o l e c u l e s i nt h es t u d y , t h e o r e t i c a li n n o v a t i o no nf l u o r e s c e n c et i t r a t i o ni sn o to n l ye x h i b i t e d b u ta l s ot h e s ec o n c l u s i o n sw i l lh e l pu st ou n d e r s t a n dt h es e l f - p u r i f i c a t i o no fw a t e r c o l u m n si nh e a v ym e t a l s i i 贵州师范大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：m i c r o o r g a n i s m ，e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e ( e p s ) ，m i c r o i n t e r f a c e ，f l u o r e s c e n c e ，h e a v ym e t a l i i i 贵州师范大学硕士学位论文 学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导帅的指导f ，独立进行研冗 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：未b 篷 2 力司年6 月豸日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州师范大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅； 本人授权贵州师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 糍：陋筠”瓣 贵州师范大学硕士学位论文 第一章引言 胞外聚合物( e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e ，e p s ) 是由微生物细胞所分 泌、由多糖、蛋白质和少量的脂类、核酸等构成、并且分子量分布范围为1 0 3 0 k d a 的一类有机高分子聚合物质。其组分以来源不同而有所差别，但最主要的是以多 糖和蛋白质为主，其次还有少量的核酸。由微生物细胞体所分泌的胞外聚合物在 医药、制奶工业和环境废水处理等领域扮演重要的角色( 康福星等，2 0 0 9 ；n a t a r a j 甜a ，2 0 0 8 ) 。已有研究表明，e p s 能够有效地去除水体中的p 元素，并且e p s 去除重金属的能力与多糖含量有关( 周健等，2 0 0 8 ；郑蕾等，2 0 0 8 ) ，这种去除 能力与e p s 所具有的生物活性、疏松的结构特性和胶体负电性有关，如此性质 特点使得e p s 能够捕捉和容纳水体中大量的重金属有毒元素，从而在一定程度 上减轻了水体污染( c l o e t f e ta 2 0 0 1 ) ；同时，水体中e p s 能够不断地通过微生 物增生获得补充，这使得e p s 能够源源不断地通过微生物体的分泌而获得及时 的补充。因此，鉴于e p s 具有以上两方面的特点，它成为影响重金属元素环境 生物化学效应的一个重要因素，同时也使得e p s 的环境生物化学效应研究成为 国际环境污染学领域研究的热点问题之。 e p s 对重金属元素的环境生物化学效应主要指的是由微生物所分泌的e p s 与重金属发生的包括配位、吸附、吸收和凝絮等在内的生物、化学和物理的反应， 以及由此反应过程所引起的有毒重金属元素的迁移转化、分配状态、扩散和埋藏 等状态的改变。同时，e p s 对水体中有毒重金属元素的影响还反映了环境生物化 学循环和生物系统耦合的重要方面，是控制和调节水体与生物、沉积物之间物质 输送和交换的重要途径( 康福星等，2 0 0 9 ) 。 胞外聚合物的产生意义 在水生环境中，微生物能够分泌大量的以可溶性有机质存在的胞外聚合物。 这些e p s 对微生物的生存起着至为关键的作用( d e c h o ，1 9 9 0 ) ，其表现为两个 方面：一方面e p s 能在比较稳定的水域中固定微生物细胞体，避免水体流动而 导致微生物生活在环境不稳定状态( 图1 1 a ) ( a z e r e d oe ta 1 1 9 9 9 ；a u s t c ne ta 1 ， 1 9 9 8 ) ：一项针对微生物吸附p b 的研究表明，细胞体对p b 的累积与胞外e p s 量 有关同时，尽管p b 能够通过e p s 渗入细胞体内，但是细胞体对p b 并没有明 显的累积效应，胞外覆盖的e p s 具有明显的p b 累罩只效应( s u hp ，a l 】9 9 9 ) 。由 此说明另方面，疏松的e p s 聚合物覆盖在微生物的表面在环境与微生物胞 膜之创形成一个缓冲层，这种缓冲层有助于保护细胞体免受有毒物质损害。同时， 大量的研究结果还表明，这些覆盖在细胞表面的疏松e p s 聚台体能够捕捉水体 环境中的营养盐用以维系细胞的生长需要( b h a s k a r a n dl a z a r o v a2 0 0 5 ) 。同样， 当重会属离子和带有负电性的e p s 通过架桥万式结台后，导致e p s 结构发生变 化，并在e p s 凝絮物中形成疏水区域。凝絮后( 图卜1 b ) 的“e p s 重龛埔”复 合体沉积后从水体中分离，这个过程往自然水体的净化过程中扮演重要的作用 ( c o l l e r a ne la l1 9 9 2 ；c o s t e n o np ，耐1 9 9 4 ：d a v e ye la l2 0 0 1d a v i e sp fa l 】9 9 8 ： d e b c e fp fa 1 1 9 9 6 ：d e b e e r “a 1 1 9 9 4 1 。 灏 f a l( h ) 目l - im * 十* 物h 女f a ) l t m 镕m i _ 10 0 0 0 1 ；e _ 】敏# i b l t t u m 目l0 0 ( i j ”i a h m * m 月十m # 扒e p s f i g ia t l a e h m e n lc a l i s c a n n i n ge e c i m n i c m i c m s c o p ! ：1 0 0 0 l dn l c s 。1 f 口h o n i a h m j c f o $ c o p e , j0 0 0 x jo y e p s “_ j c d 椰岫e a d f ls h n ee p s 砖l c n 。q m i c r o n a c e l l ， 根据前人对e p s 产量和_ 日= 境因子zu 】关系的研究( h o a g l a n df ，a l1 9 9 3 ：f a n g “a l2 0 0 2 ：s i n g he ，a l1 9 9 9 ：a l u w i h a r e “a l1 9 9 9 ：y u ee l f2 0 0 5 ) ，e p s 物质的生 物产量不仅与微生物1 7 身所处的生长阶段有关而且还与环境中p h 值、盐度、 温度与和重金属浓度的胁迫状况有关。从生物反馈机制上理解在耳境条| _ 1 _ 政变 的情况下微牛物产生更多e p s 的行为可以归结为生物应激性的一种表现。这 种应撇性能够蛀大程度避免微生物细胞体免受危害。在定环境条件范刨内，。 鬻 贵州师范大学硕士学位论文 环境胁迫程度增加时，微生物反馈机制所产生的更多量的e p s 能够更有效地去 除有毒、有害物质的污染，这在定程度上形成了“环境口微生物之间的相 互耦合机制。 e p s 对重金属元素的环境行为产生一定影响，这种影响又可追溯到e p s 内 的活性基团与该元素的键合( 络合) 能力。总体上，e p s 与环境分散元素之间的 关系以及e p s 胶粒之间的相互关系都可归结为胶体级环境物质之间的生物化学 微界面关系。这种界面关系的界定为研究e p s 环境行为方式进行了很好的学科 定位。 1 2 微生物胞外聚合物( e p s ) 生化过程 1 2 1 溶解性有机质( d o m ) 与e p s 的行为差异 根据原子力显微镜和核磁共振的一项研究表明，海洋中d o m 主要由多糖 构成并且海水中d o m 的组成与浮游生物e p s 的释放量关系密切( y u ee ta 1 2 0 0 5 ) ，这表明胞外聚合物是水体d o c 的重要来源之一。d o m 中e p s 所占的比 重由温度、盐度、p h 等外部环境条件，和种群密度、类型等微生物自身条件所 决定( b a t s t o n ee ta 1 ，2 0 0 1 ；d e b e e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。由于d o m 来源于生物残体的腐化 和分解产物、微生物代谢产物等，而e p s 来自于微生物的分泌产物( w ue ta 1 ，2 0 0 1 ； c o b l ee ta 1 ，1 9 9 6 ；p a v o n ie ta 1 ，1 9 7 2 ) ，这使得d o m 和e p s 之间具有很大的相异 性。具体表现在：产生时间的相异性。e p s 产物与新近生物产物相关，而d o m 的产生可能经过一定时间的分解和腐化过程。从化学组分构成可知，e p s 中的蛋 白质、脂类、多糖等这些与新近生物产物的化学组分含量比例较高，而d o m 中 腐殖酸和富里酸等腐殖类产物比例较高，这说明d o m 经历过一定时期的腐化和 分解过程；来源不同。e p s 来源于细菌、浮游动植物等微生物的分泌产物，而 d o m 不仅包括来自于大型动植物分解的产物，而且还包括细菌、浮游动植物等 微生物产物：定义范围不同。已有报道表明，在海洋中微生物所分泌的胞外聚 合物产量与d o m 的产量具有明显的关系，这表明微生物e p s 是水体d o m 的主 要来源之一( y u ee ta 1 2 0 0 5 ) ：生物耦合机制不同。正如前文针对“环境口微 生物”之间相互耦合机制的理解，这一过程反映了微生物能够通过产生e p s 量 贵州师范大学硕士学位论文 的变化来对环境条件的胁迫进行反馈，这种反馈一定程度上避免了细胞受到损 害：同时从环境层面上，使得环境胁迫程度降低( b e r g a m a s c o 甜a l ，2 0 0 3 ) 。例如， 当环境中的一定量的重金属浓度对微生物产生胁迫作用时，微生物通过分泌大量 的e p s 来形成一个缓冲层来保护细胞体，同时这些e p s 能够在一定程度上能够 通过e p s 的生物化学活性降低或去除水体重金属。鉴于以上差异性，使得e p s 的提取方法、研究思路以及研究方法相异于d o m 的研究，由此所派生出的系 列问题也是e p s 所关注的焦点问题。 1 2 2e p s 去除重金属元素的环境生物化学行为 活性污泥微生物法除重金属的技术已经被广泛应用于城市污水的处理过程 中，并且许多学者对微生物细胞体对这些元素的净化机理也作了深入的研究 ( z h o ue la 1 ，2 0 0 5 ；b e e c ha n ds u n n e r , 2 0 0 4 ；g o m 6 ze ta 1 ，2 0 0 1 ) 。作为微生物分泌的 产物e p s ，由于其表面带有大量电荷，这使得胶体之间相互排斥而呈现分散状 态；如此的性质和分散体系使得e p s 有更多的机会参与到诸如重金属的环境生 物化学的转化过程中( 图1 2 ) 。固然e p s 去除不同重金属的作用机理存在差异， 但是去除这些元素的过程中e p s 所表现的行为方式无非是通过其自身所特有的 胶体带电性、疏松性和生物活性3 种方式来实现。e p s 捕捉分散元素后，e p s 基 团与这些元素的配位反应最终导致e p s 胶体表面电荷也随之发生改变，分子间 发生架桥作用而产生凝絮( g o n z a l e ze la 1 1 9 9 8 ；l i ue ta 1 2 0 0 4 ；傅平青等，2 0 0 4 ) 。 从而，e p s 凝絮后沉淀成湖底沉积物的一部分。e p s 分散体系到凝絮沉淀的过程 也是环境中重金属元素的固定过程。其环境意义表现为重金属污染物浓度的降 低。同时，e p s 在水体的富营养化水体自净过程中可能扮演重要角色( r e e m t m s a e ta 1 ，2 0 0 1 ；n a g a m i n ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在针对生物除磷的一项研究表明：8 2 左右 的磷聚集在聚磷菌菌体内，另外1 8 的磷聚集在e p s 中( 周健等，2 0 0 8 ) 。这 说明，生物对磷的吸附效应导致了菌体内磷的积聚，同时e p s 通过化学、物化 及生化作用，将部分磷聚集于e p s 内，成为一个磷储存库。根据b h a s k a r 等人 ( b h a s k a ra n db h o s l e ，2 0 0 5 ) 针对“e p s 重金属”配位体在水生环境食物链中的 作用进行了初步研究，结果表明以e p s 为食的水生动物能把所食用e p s 中的2 9 成为自身组织的一部分，4 9 的e p s 通过呼吸作用以c 0 2 形式排出，在此食物 4 m 大学坝 学址论女 链过程中，动物显然能够利用e p s 中的能量和物质由此推断，1 3 p s 所配位的 重金属也可能通过e p s 的摄入而随之被纳八食物链体系。纳入体系的重金属的 形态、生物利用性以及在环境中的分配状况等都会伴随着e p s 的摄入而发生很 大变化( j a y s a n k a re la 1 2 0 0 8 ；b a r k a y “a 1 2 0 0 3 ：b r i me lo ，2 0 0 1 c h a n gp ，a l 1 9 9 3 ) 。 。，、：j i j ，止、，一，一 浮瓣m 钫，m 3 7 1 p o ：i 1 邀y ”靠竹企8 j 孝一# 篓碧蔫h * ” | j = ：曼量二：塑：壁! _ 目i - 2m # 中胞外笨台物来源其环境生物化# m m ( b h a s k 帅db h o s i e2 0 0 5 ) f i g 12 n t c co f e p s m d i t s 日m db i o c h e m lc ( b h n k a r m d b h o s l e2 0 0 5 1 3 环境微生物胞外聚合物( e p s ) 研究现状 胞外聚台物的产生及其对环境有毒污染物的地球化学转化过程的始响，不 仪展现了环境微生物与污染有毒物质尤其重余属离子之自j 相互作用的界面关系， 而且还体现了微生物在有毒物质刺激下的生物应激作用。因此，k 期以来，e p s 的提取及在e p s 参与条件f 重金属的形态转化机理直是微生物胞外聚合物研 究领域关注的焦点。 1 3 1e p s 的提取及其存在的问题 正如前文针对e p s 和d o m 在环境中关系的阐述，在e p s 研究过程中具有完全 不同d o m 的研究方法和思路。尤其针对自然水体中e p s 研究，由于e p s 构成了 贵州师范大学硕士学位论文 d o m 一个重要的组成部分，这使得d o m q h 的相近成分( 如腐殖质类、生物分解 残体等) 干扰e p s 研究；例如，在三维荧光光谱( e e m ) 或红外光谱( f t i r ) 分 析中，一般情况下d o m 和e p s 的光谱特征无明显差异：就分析方法，d o m 可以 自然水体取样并简单处理后进行e e m 观测( 傅平青等，2 0 0 4 ；y u ee la 1 ，2 0 0 4 ；a d a v e t a l ，2 0 0 8 ) ；但是，针对水体中e p s 的研究，为了避免生物残体、腐化物质的干 扰，就不能使用类似处理d o m 样品的方法处理自然水体中的e p s 样本。同时，由 于e p s 具有生物近缘性，其中的生物活性成分很容易由于处理不当而引起诸如占 主要成分的蛋白质官能团与结构的变性失活，这决定了 e p s 的提取和分离过程在 其后续e p s 对重金属元素环境生化效应影响的研究中十分重要。因此，e p s 的提 取和分离方法研究构成了后续一系列环境生化性质研究的基础。 不同的e p s 提取方法决定了其产物组分、干重( d r yw e i g h t ) 等e p s 属性也存 在很大差异，因此针对不同的研究目的应选择相应的e p s 提取方法。理想的提取 方法应该满足下面3 种条件：对e p s 的性质没有影响或影响极小；获得均匀 的组分；具有较高的提取效率。但是，由于e p s 在非实验室条件下存在的复杂 性以及组成成分之间性质上的相异性，满足上述所有条件的理想提取方法并未找 到。根据现有的研究成果，已有的提取方法主要可以概括为3 种：即物理方法、 化学方法。物理方法主要是直接离心法( c o n t r o lm e t h o d ) 、超声波法、离子交换 树脂法、加热法等；化学提取方法包括e d t a 法、甲醛- n a o h 法、戊二醛法等( c o m t e e la 1 ，2 0 0 6 ) 。如此的分类方法并非是严格意义上的分类，因为每一个化学提取方 法都使用物理方法的分离如离心、震荡等。如此的分类是基于化学药品是否参与 e p s 与胞膜分离的过程中。比较两类方法：物理提取方法比较温和，具有不引入 化学药品、e p s 内生物活性成分变性小的优点；缺点是e p s 提取量较少( c o m t ee t a 1 ，2 0 0 7 ) 。因此，物理提取方法更适用于后续实验过程中e p s 的光谱、吸附等灵 敏度要求高、e p s 官能团结构变异小的实验类型。而化学提取方法一般具有提取 量大的优点，但是由于胞外聚合物的一系列环境生物化学作用是通过官能团的特 性来实现( 如吸附、配位等) ，由于前期分离过程中，化学药品已与e p s 通过物 理或化学作用相结合，一方面这些药品使得e p s 更容易从细胞壁剥离而被提取， 另一方面尽管在提取后期使用了膜分离技术，但是膜分离的过程并不能使得已发 生性质变异的e p s 遵循可逆的反应而转变成初始自然状态。因此，药品的加入在 6 贵州师范大学硕士学位论文 一定程度上势必改变了e p s 的性质。从已有研究结果分析，不同提取方法所获得 的在后续e p s 与重金属元素研究实验中，实验结果差异性较大( k l o c ke la 1 ，2 0 0 7 ； l i ua n df a n g ，2 0 0 2 ；n o v a k , 2 0 0 7 ) ，这说明提取方法的选择显然已经影响后续实验 的进行。此外，鉴于以上提及的两种提取类型的优缺点，有些学者使用“物理 化学”联合方法。这两种方法的优化和组合在考虑到后续实验研究目的的基础之 上，综合考虑具体的物理化学之间的互补关系以及所研究的微生物类型，不失 为一种暂时可行的方法。 在目前的研究中，针对提取后的e p s ，学者们采用细胞破碎量、e p s 产量和 各化学组分等这些指标来评估提取效果( a z e r e d oe ta 1 ，19 9 9 ；c o m t ee ta 1 ，2 0 0 7 ； k l o c ke la 1 ，2 0 0 7 ；n o v a k , 2 0 0 7 ；z h a n ge ta 1 ，19 9 9 ；l ia n dy a n g ，2 0 0 7 ) 。然而，在针 对微生物胞外聚合物对有毒重金属生物地球化学循环的影响时，由于采用提取方 法的差异性导致了模拟实验的结果产生较大偏差。为了更能准确地评估e p s 对有 毒重金属生物地球化学循环的影响，学者们一般采用2 种或者更多的提取方法获 得同一类微生物的e p s ，然后模拟其对有毒重金属的环境归宿的实验。诚然，如 此的方法能够较好地评估e p s 对有毒重金属生物地球化学循环的影响。然而，任 何模拟实验结果的获得都需要最终以自然环境为参比，这就要求研究者在提取 e p s 时，根据实验需要在尽可能小地诱变其性质的条件下提取e p s 物质。显然， 由于实验条件的影响，研究者所应用的评估方法已经不能够有效地评估在e p s 提 取过程中所导致的e p s 性质变异。如此的变异就决定了在进, t e p s 对有毒重金属 生物地球化学循环影响的实验中，所获得的结论与自然条件下这一实际过程之间 出现较大出入。 、 就e p s 后续实验过程中的研究目的而言，研究的真正目的是揭示自然环境下 e p s 对重金属环境生物化学转化过程的影响这一规律。本质上，微生物胞外聚合 物与重金属作用的机理是界面反应过程。而e p s 提取最主要目的是避免不必要成 分的参与和尽量减d e p s 性质的变异。因此，良好提取方法的选择只是解决了一 部分问题。针对e p s 与重金属之间环境界面问题，一些学者采用温和的离心方法 分离胞壁外围e p s ，这种方法的采用在一定程度上减少微生物细胞的破碎量( 葛 利云等，2 0 0 6 ；f o r da n dm i t c h e l l ，1 9 9 0 ) ；同时，由于胞壁外围e p s ( 1 0 0 s e l yb o u n d , l b ) 和内围e p s ( t i g h t l yb o u n d ，t b ) 与环境界面关系不同，在很少破坏细胞体 7 贵州师范大学硕士学位论文 且不引入化学药品的情况下，通过不同层面的“细胞环境”界面差异性理解e p s 对重金属元素环境生物化学转化过程的影响。 1 3 2e p s 对水体中重金属元素的环境生物化学转化过程的影响 近些年研究均表明，e p s 参与了环境中重金属的迁移转化等( d e c h o ，】9 9 0 ； z h a n ge ta 1 。2 0 0 6 ) 。e p s 对重金属污染物的吸附和吸收过程取决于重金属的形态、 微生物类型和环境状况，如在水体中c a ，n a 等离子存在下，其与重金属能够形 成竞争吸附，这在一定程度上抑制了e p s 对重金属的吸收( w ua n dt a n o u e ，2 0 0 1 ； m c s w a i n e t a l ，2 0 0 5 ) 。因此，长期以来，重金属在e p s 参与下的形态转化机理和 环境效应一直将是重金属环境生物化学研究领域的关注焦点。 大量最新研究已经表明：e p s 对水体中微量金属元素的如汞、镉、铜和铅等 的生物环境化学循环起着十分重要的作用。这主要是由于e p s 能够与金属离子形 成有机金属配位体，导致可溶性金属元素环境化学行为的改变，影响其生物有效 性、溶解性以及对生物的毒性( w ue ta 1 ，2 0 0 4 ；g a d d ，2 0 0 5 ；康福星等，2 0 0 8 ) 。因 此，微生物胞外聚合物与重金属作用机理的研究成为当前阶段研究的环境热点问 题之一。从目前所研究的成果可以看出，研究者集中于e p s 与重金属结合机理的 研究以及两者结合过程中的动力学研究。以c d 研究为例，从z h a n g 等( 2 0 0 6 ) 从活 性污泥中提取的胞外聚合物质的研究表明：在c d 初始浓度为1 0m g l 以的条件下每 克e p s 所能够吸附c d 的量为3 3 0 6m g ，并且这种吸附作用能够用f r e u d l i c h 等温吸 附模型来解释。而在e p s 对重金属生物化学循环的影响程度方面，不同环境介质 下有金属与e p s 结合态及动力学过程还不甚清楚，同时其影响程度还亟待进一步 研究。最近的研究还表明，微生物及其分泌的胞外聚合物能够产生生物钙化现象 ( c a n a v e r a se ta 2 0 0 6 ；k a w a g u c h ia n dd e c h o ，2 0 0 6 ；f l e m m i n g ，1 9 9 6 ) ，这种现象的 产生不仅解释了喀斯特地区部分生物钙化体的来源，而且更重要的是钙化壳的产 生可能在一定程度上抑制了微生物胞外聚合物对重金属生物环境化学转化过程 影响。另一个方面，鉴于e p s 能够引起生物钙化现象，自然界中微生物及其分泌 的e p s 所产生的生物钙化体，是否包埋了吸附有“e p s 重金属 的络合物，值得 进一步的研究。如果该研究结论成立，e p s 生物钙化过程将成为重金属元素的又 一行为归宿方式。 8 贵州师范大学硕士学位论文 1 3 3e p s 对水体中重金属元素环境生化效应研究面临的问题 正如前文针对d o m 和e p s 行为性质的论述，e p s 是自然水体中d o m 的重 要来源之一，d o m 中腐化物质、生物残体等非e p s 组分在一定程度上增加了 e p s 的研究难度。此外，由于胞外聚合物的产生反映了微生物对环境之间的一种 反馈，这种反馈其环境意义是微生物利用e p s 物化性质降低环境对细胞体胁迫 的过程。一方面，e p s 在胞壁外构成一个缓冲层，另一方面分离出细胞体的e p s 通过净化水体中重金属元素营造一个适宜于微生物生长的环境，这种关系就决定 了e p s 的研究有别于d o m 的研究。因此，在自然水体中微生物所产生的e p s 必须经过分离，其目的是排除含有生物残体、腐化物的d o m 的干扰。现阶段的 e p s 分离结果的评判主要以细胞破碎量、各组分含量等作为评价依据，而忽略了 e p s 基团性质的改变的评判。这就是在后续研究如吸附与解析附、重金属结合等 一系列的试验中，不同提取方法所获得的实验结论出现较大实验偏差的原因。 ，e p s 是一种具有生物活性的细胞分泌物，其在环境中对重金属环境生物化 学转化的影响通过本身官能团来实现( o m o i k ea n dc h o r o v e r , 2 0 0 4 ) 。因此，在研究 过程中，其环境条件的变化能够直接影响其作用效果，甚至导致部分基团或结构 的变异而失活。可见，寻求一种既降低e p s 破碎量的分析方法，又能够最大程 度地获得实验结果的方案成为研究者比较关注的问题。 鉴于以上提及的研究现状，不难理解微生物胞外聚合物的研究大多聚集在 e p s 的降污效应、提取方法、自凝絮的效果的研究上，而把微生物胞外聚合物的 在自然界大环境下的意义的研究仍需要进一步完善。就目前我国研究现状，随着 我国经济快速发展，以有机污染、重金属污染等一系列环境污染问题也引起了人 们的普遍重视，环境科学事业也有了进一步的发展。鉴于微生物及其胞外聚合物 在环境净化中所起的效用，大量的针对胞外聚合物的研究也演变成为一类热点问 题。同时，国内主要针对括性污泥胞外聚合物的研究主要集中在： e p s 去除有 毒物质或n 、p 的研究；活性污泥e p s 凝絮性的研究；e p s 提取方法的研究。 一系列的研究结果表明微生物胞外聚合物在环境生物化学循环中起到重要的作 用。如：在活性污泥废水处理过程中，分段式s b r 对于去除有机物、氨氮和总 磷的效果可以达到9 0 以上，模拟实验也显示e p s 对重金属c d ，z n 也具有相当 高的去除率( 郑蕾等，2 0 0 8 ) ：针对胞外聚合物的吸附动力学实验，z h a n g 等人( 2 0 0 6 ) 9 贵州师范大学硕士学位论文 的研究结果表明这一过程能够符合f r e u n d i l i c 方程，这一结论和国内吕英等人针 对胞外聚合物对c u 2 + 的吸附性能的观测结果一致。由此，在国内外研究中，我们 不难看出国内学者大都集中在活性污泥与重金属的作用规律和e p s 提取方法的 探讨上，在两者相互作用上，集中研究的是e p s 吸附重金属的性能上。正如前 文所述，作为自然界水体自净、碳储库的一部分，胞外聚合物在在环境中的意义 远不仅仅表现在生产废水的处理中，其对自然环境有毒物质如重金属等形态转 化、分布也同样更具有深远的意义。因此，今后的研究方向需要在寻求研究技术 突破的基础上，采用新的方法和思路来探索其更为宽广的环境意义。 1 4 本研究所要解决的问题及其创新点 正如前文针对e p s 研究所面临问题的论述，目前，针对微生物胞外聚合物 的研究大多聚集在e p s 的降污效应、提取方法、自凝絮的效果的研究上，这种 研究仅仅现定于污水处理的狭义层面上。实际情况是，由于微生物在水体中普遍 存在，且有着较强的生物适应性和相当可观的生物量，因而在大的自然环境背景 下，微生物及其胞外聚合物与重金属之间的作用机理的研究就显得具有十分重要 的意义。该研究将有助于我们更为深入地对自然条件下微生物参与下的重金属污 染水体自净这一过程的理解。 1 4 1 解决的问题 鉴于微生物与胞外聚合物之间的密切关系，并且先前的研究也表明微生物的 类型和生长条件能够决定e p s 的性质。因此，本研究从“微生物对重金属的生 理响应”、“重金属作用下微生物所产生的e p s 变异”和“重金属与e p s 的结合 机理”3 个层面研究了微生物及其胞外聚合物与重金属之间的关系。该研究所要 解决的问题是： 重金属对微生物的胁迫机制。重点解决的是重金属对钙化微生物的生理胁 迫作用。该研究着重阐述钙化微生物细胞体对重金属胁迫的生理响应过程。 重金属作用下微生物产生的e p s 特性。该部分研究从e p s 分子量分布、各 分子量段e p s 性质变异状况、e p s 腐殖质来源和e p s 产量变化4 个方面阐述了重 1 0 贵州师范大学硕士学位论文 金属诱导下微生物所产生的e p s 性质变异。 重金属与e p s 之间的结合机理。由于微生物e p s 与水体环境界面接触的差 异性，该研究根据这种界面接触关系使用不同的方法提取了l b ( 细胞外层) 和 t b ( 细胞内层) ，并分析了重点解决了2 种类型的e p s 与重金属之间的结合机理 的差异性。 1 4 2 研究创新点及其环境意义 综上所述，e p s 对重金属元素的赋存形态、分布状况以及生物可利用性等环 境生物化学效应影响显著。与d o m 的研究相比，人们对e p s 的环境行为还缺乏 更为深刻的认识。e p s 提取方法、e p s 对重金属及元素行为转化的影响、e p s 与 元素间微界面关系、e p s 与重金属元素反应的适时追踪过程以及新的实验分析手 段，都可以为某些至关重要的研究环节提供新的思路。鉴于此，本研究的创新点 归结如下： 鉴于先前关于重金属对微生物生理胁迫方面研究较多，而从生物钙化角度 研究重金属对蓝藻的生理胁迫作用极少。本研究旨在理解生物钙化过程中重金属 对蓝藻的生理胁迫。这对重金属在自然界中的行为转化和生物对重金属的吸附机 理的研究具有十分重要的意义 探讨了微生物对重金属作用的反馈机制，该反馈机制主要体现在e p s 分子 量分布的变化和e p s 性质的改变，这一改变有助于我们对微生物通过e p s 净化水 体中重金属污染物这一自净过程的理解。并且，在节中还探讨了e p s 中腐殖质的 来源，证明e p s 腐殖质并非直接来源于细胞体的分泌，而是分解和腐化的产物。 通过c d 滴定e p s 的方法，适时地追踪了重金属与e p s 的反应过程。 以重金属c d 为探针，通过重金属对l b 和t b 的猝灭效应的差异性，探 讨了两种类型的e p s 结构的差异性。 贵州师范大学硕士学位论文 第二章钙化的集胞藻对c d 的生理响应 重金属污染是人类面临的最为紧迫的环境污染之一。尤其在地处亚热带喀斯 特区的贵州山区，由于特殊的地质状况，土壤中c d 的污染指数达到了4 0 5 ，属 于重度污染( 宋春然等，2 0 0 5 ) 。这些污染物随着农业灌溉和自然降水势必进入到 自然水体中，并通过食物链作用或生物体对重金属的累计效应( 难以排出) ，最 终对处于食物链顶端的生物产生致命的危害( 邱昌恩等，2 0 0 5 ) 。 目前，利用藻体的生物吸附作用去除水体重金属，以其具有高效、环保、低 耗等优点被认为是最有前途的方法之一( v o l e s k ye la 1 ，1 9 9 9 ；a r a v i n d h a ne la 1 ， 2 0 0 4 ；t s u n e d ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。因此，国内外许多学者针对藻体对重金属吸附机理 进行了广泛、深入的研究。 同时，蓝藻也具有生物钙化作用。根据先前的研究，蓝藻的钙化作用与其自 身的光合作用密切相关( b e e re ta 1 ，2 0 0 1 ；t e de ta 1 ，1 9 9 1 ；a t s u s h ie ta 1 ，1 9 9 8 ； k i m b e r l ye ta 1 ，2 0 0 6 ) 。这一过程的机理可以理解为，当微生物吸收水中扩散的 h c 0 3 后，其中一部分脱h + ( 式1 ) 。脱一后的c 0 ：一与水中溶解性的c a 2 + 结合生 成沉淀( 式2 ) ，即形成钙化。其中，在细胞内的矿与另一部分h c o ；结合生成 能够被光合叶绿体利用的c 0 2 并进行光合作用( 式3 ) ( t e de la 1 ，1 9 9 1 ) 。其可具 体表述如下： h c o ；臼h + + c o g 一脱旷作用( 1 ) c o g 一+ c a 2 + 营c a c o ，山 钙化作用( 2 ) h + + h c o ；营c 0 2 + h 2 o 光合作用 ( 3 ) 、面薪 用藻体通过生物吸附作用除去水中重金属污染物的过程中，可能伴随有钙化 现象的产生。细胞内( 外) 的钙化壳在一定程度上会影响藻体对重金属污染物的 吸收。同时，在富含c a 2 + 的喀斯特区域，自然水体中的钙化现象的产生势必对重 金属污染物的行为归宿和形态的转化产生一定的影响。目前，针对藻体吸附重金 属机理和重金属对藻体生理胁迫的研究较多i 从生物钙化角度研究重金属对蓝藻 的生理胁迫作用极少。本研究中，旨在理解生物钙化过程中重金属对蓝藻的生理 胁迫。这对重金属在自然界中的行为转化和生物对重金属的吸附机理的研究具有 1 2 贵州师范大学硕士学位论文 十分重要的意义。 2 1 材料和方法 2 1 1 藻种培养 集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p 藻种( f a c h b - 8 9 8 ) 购于中国科学院武汉水生物研究 所国家淡水藻种库，培养条件为：2 5 c ，3 0 0 0l x ，p h 值为8 ，培养基为b g1 1 ， 持续光