（农产品加工及贮藏工程专业论文）谷氨酰胺活性肽的制备及性质研究.pdf

谷氨酰胺活性肽的制备及性质研究 捅要 谷氨酰胺( g i n ) 为条件必需氨基酸，在生物体代谢过程中起着重要 的作用，由于其难溶性和不稳定性极大地限制了它的开发和应用。谷氨酰 胺活性肽能较好地克服这些缺点，但目前临床上使用的主要是人工合成的 谷氨酰胺二肽( 甘氨酸谷氨酰胺和丙氨酸谷氨酰胺) ，这种二肽的价格昂 贵，合成量低，其广泛应用仍然受到制约。 本文以来源丰富的小麦蛋白为原料，采用酶解法制备谷氨酰胺活性 肽，并对其理化性质和生物学功能特性进行探索研究。试验的主要结果如 下： 1 单因素试验确定了从面粉中提取小麦蛋白的较适条件为：温度 3 0 、n a c l 浓度2 、水面比为1 、p h 7 0 ，此条件下提取蛋白中的总蛋白含 量7 9 2 6 ，谷氨酰胺含量4 3 2 5 ，蛋白溶解度1 2 9 5 。 2 以提取的小麦蛋白为原料，采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步水解制 备谷氨酰胺活性肽。通过正交试验得到的最佳制各工艺条件为：碱性蛋白 酶在温度6 0 、p h9 5 、底物浓度4 ( w v ) ，酶用量1 5 ( w w ) 的条件下 水解2 h ，水解度为2 1 2 5 ，再采用胰蛋白酶在温度4 0 、p h9 0 、酶用 量1 5 ( w w ) 的条件下水解2 h ，水解度提高3 。3 0 。活性肽制品的彳导率为 6 1 3 8 ，肽中谷氨酰胺的含量为3 3 1 4 。 3 对谷氨酰胺活性肽制品的理化性质进行测定研究，结果表明，三氯 乙酸氮溶解指数8 3 3 3 ，平均肽链长度4 0 7 ，盐含量0 2 9 9 l ，h p l c 法 测定谷氨酰胺活性肽由相对分子量为2 8 5 4 和2 1 1 7 的两组分组成，组成百 分比为3 5 6 9 和6 4 31 。与游离谷氨酰胺相比，同渗重摩显著降低，溶 解度显著提高。 4 谷氨酰胺活性肽体外抗氧化试验证明了其抗氧化能力、还原能力和 超氧阴离子自由基捕获能力随着浓度的升高而增强。以昆明种小鼠为实验 对象，进行体内抗氧化和抗疲劳试验的结果显示，与对照组相比，给予高 剂量活性肽能显著提高小鼠肝肾组织中的超氧化物歧化酶( s o d ) 活性， 减少脂质过氧化物丙二醛( m d a ) 的产生；并能延长小鼠游泳时间和耐缺 氧存活时间，提高抗疲劳能力。 关键词：小麦蛋白：谷氨酰胺活性肽；酶解制备；理化性质；抗氧化性； 抗疲劳性 s t u d y o np r e p a r a t i o na n dp r o p e r t yo f g l u t a m i n e - - b i o a c t i v ep e p t i d e s a b s t r a c t g l u t a m i n ei sac o n d i t i o n a l l ye s s e n t i a la m i n oa c i d ，w h i c hp l a y sav e r y i m p o r t a n tr o l ei nm e t a b o l i s m t h ei n s t a b i l i t ya n dl o ws o l u b i l i t yo ff r e eg l n h a m p e ri t se x p l o i t u r e a n du s e g l u t a m i n e - b i o a c t i v ep e p t i d e sc a no v e r c o m e t h e s es h o r t c o m i n g s ，b u to n l yt h eg l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d e s s u c ha s g l y g i na n da l a g i nw e r ea p p l i e di nc l i n i cp r e s e n t l y ，a n dt h eh i g hp r i c e ，l o w s y n t h e s i sq u a n t i t ya l s ol i m i ta p p l i c a t i o no f t h et w os y n t h e s i sd i p e p t i d e s i nt h i ss t u d y ，w i t hw h e a tp r o t e i nw h i c hi sak i n do fc h e a pa n dc o n v e n i e n t p r o t e i nr e s o u r c e sa sm a t e r i a l ，g l u t a m i n e - b i o a c t i v ep e p t i d e sw e r ep r e p a r e db y e n z y m eh y d r o l y z i n gw h e a tp r o t e i n i n a d d i t i o n ，p h y s i c a l a n dc h e m i c a l p r o p e r t i e sa n db i o l o g yf u n c t i o nw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h r o u g ho d df a c t o rt e s t s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s o fe x t r a c t i o nw e r e o b t a i n e da sf o l l o w s ：3 0 ，n a c l = 2 ，w a t e r ：f l o u r = l ，p h 7 0 w h e a tp r o t e i n w a sg a i n e di nt h i sc o n d i t i o n i t sp r o t e i nc o n t e n tw a s7 9 2 6 ，t h ec o n t e n to f g i n w a s4 3 2 5 a n dt h es o l u b i l i t yo fp r o t e i nw a s 12 9 0 ， g l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d e sw e r ep r e p a r e db yh y d r o l y z i n g w h e a t p r o t e i nw i t ha l c a l a s ea n dt r y p s i no n eb yo n e s e l e c t i n g d ha n dt h ec o n t e n t o fg l na si n d e x e s ，t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sw e r eo b t a i n e d a sf o l l o w s ：a l c a l a s ea t6 0 ，p h 9 5 ， s = 4 ( w v ) a n de = 1 5 ( w w ) f o r1h o u r ，d h = 21 2 5 ，t r y p s i na t4 0 c ， p h 9 0a n de = 1 5 ( w w ) f o r2h o u r s ，i n c r e a s i n gd h = 3 3 0 t h ef i n a ly i e l d o f b i o a c t i v ep e p t i d e sw a s6 1 3 8 t h ec o n t e n to fg i n w a s3 3 1 4 s t u d y i n go nt h ep h y s i c a l a n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，t h et c a n s lw a s 8 3 3 3 t h ea v e r a g ep e p t i d el e n g t hw a s4 0 7 ，t h ec o n t e n to fs a l tw a so 2 9 9 l ， t h ep e p t i d e sw a sc o m p o s e do fr e l a t i v em o l e c u l a rm a s s2 8 5 7a n d2 1 1 7b y h p l c t h ep e r c e n t a g ew a s3 5 6 9 a n d6 4 31 c o m p a r e dw i t hd i s s o c i a t i v e g l u t a m i n e ，a n dt h eo s m o l a l i t yw a so b v i o u s l yr e d u c e d ，s o l u b i l i t yw a so b v i o u s l y i n c r e a s e d t h ea n t i o x i d a t i o na n da n t i f a t i g u ef u n c t i o n so fg l u t a m i n e b i o a c t i v e p e p t i d e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t so fe x p e r i m e n ti nv i t r os h o w e dt h a tt h e a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e s ，r e d u c t i v ea c t i v i t i e sa n dh y d r o x y lr a d i c a l ss c a v e n g i n g a c t i v i t i e sb e c a m es t r o n g e ra st h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n s t h ee x p e r i m e n to f a n t i o x i d a t i o na n da n t i f a t i g u ee f f e c t si nv i v ow e r ep r o c e s s e dw i t hm i c ea s s u b j e c t s c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e h i g h - d o s eg l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d e sc o u l do b v i o u s l y i m p r o v et h ea c t i v i t i e s o fs o da n dr e d u c et h ec o n t e n t so fm d a i nl i v e ra n dk i d n e y i na d d i t i o n ，i t c o u l dp r o l o n gt h es w i m m i n gt i m ea n d l i v i n gt i m eo fm i c e ，e n h a n c et h e a n t i f a t i g u ea b i l i t i e s k e y w o r d s ：w h e a tp r o t e i n ；g l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d e s ；e n z y m e h y d r o l y z e d ； p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ；a n t i o x i d a t i o n ；a n t i f a t i g u e ； 表格清单 表1 1 小麦蛋白的氨基酸组成8 表1 2 常用的食品级蛋白酶9 表2 1 小麦蛋白制品基本理化指标测定结果1 7 表3 1 碱性蛋白酶单酶水解小麦蛋白正交试验方案与结果分析2 8 表3 2 胰蛋白酶二次水解小麦蛋白正交试验方案与结果分析2 9 表4 1g b p 的相对分子量测定结果一3 4 表5 1 不同浓度的g b p 的抗氧化能力的测定结果4 0 表5 2 不同浓度的g b p 的还原能力的测定结果4 1 表5 3 不同浓度g b p 的超氧阴离子自由基捕获能力的测定结果4 1 表5 - 4g b p 对小鼠s o d 活性的影响4 2 表5 5g b p 对小鼠m d a 含量的影响4 2 表5 - 6g b p 对小鼠游泳时间的影响4 2 表5 7g b p 对小鼠缺氧存活时间的影响4 3 插图清单 图1 1 谷氨酰胺结构式1 图2 1 温度对蛋白含量的影响曲线1 5 图2 2n a c l 浓度对蛋白含量的影响曲线1 6 图2 3 水面比对蛋白含量的影响曲线1 6 图2 4p h 对蛋白含量的影响曲线1 7 图2 5 牛血清蛋白标准曲线l8 图2 - 6 小麦蛋白彻底酸水解氨基酸分析图谱1 8 图2 7b t i 保护反应后小麦蛋白氨基酸分析图谱1 9 图3 1l 酪蛋白标准曲线2 4 图3 2p h 对小麦蛋白水解度的影响2 5 图3 3 温度对小麦蛋白水解度的影响2 5 图3 - 4 底物浓度对碱性蛋白酶水解小麦蛋白的影响2 6 图3 5 酶用量对小麦蛋白水解度的影响2 7 图3 - 6 水解时间对小麦蛋白水解度的影响2 7 图3 7 谷氨酰胺活性肽制品“3 0 图4 1h p l c 法测定g b p 的相对分子量结果一3 4 图4 2 谷氨酰胺和g b p 的溶解度测定结果一3 5 图4 3 谷氨酰胺和g b p 的同渗重摩3 6 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得 金日巴王些盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：( ，长百1 j 签字日期： 明年簟月谚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金起工些态堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权 金胆工些太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： e 赢 签字日期呷年年月f 8 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 胁年 签字眺汐卜月嘶 电话： 邮编： 致谢 本论文能够得以顺利完成，首先要感谢我的导师潘丽军教授，无论是 在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法以及成文 定稿方面，我都得到了潘老师悉心细致的教诲和无私的帮助，潘老师广博 的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终 生受益，在此表示深深的谢意。 同样深深感谢两年半来传授我知识的姜绍通教授、郑志副教授、罗水 忠老师、钟昔阳老师和韩卓老师，你们为我的实验提供了很多便利，在此 向你们表示真诚的感谢。 此外，研究生期间与我朝夕相处的同学是我最值得珍惜的宝贵财富， 谢谢罗炳华、冯丽桦、桂蕾、蔡静、刘靖、胡燕红、罗蕾蕾、聂慎德同学， 感谢你们一路走来的陪伴。 最后，感谢我的爸爸、妈妈，正是因为有你们的鼓励和支持，才有了 今天的我。在我成功的时候，你们的笑容散发着幸福、满足和荣耀的光芒， 照亮了我的前程；在我失败的时候，你们的眼神透露出理解、包容和鼓励 的信息，鼓足了我的勇气。 两年半的岁月稍纵即逝，研究生的生活，我感受着自己的成长，经历 着学校的发展。感谢命运的安排，让我有幸结识了许多良师益友，是他们 教我如何品味人生，让我懂得如何更好的生活! 人生处处是驿站，已是挥 手作别之时，在此，向所有帮助过我的人献上我最诚挚的谢意! 作者：张丽 2 0 0 9 年4 月 第一章引言 1 1 谷氨酰胺简介 1 1 1 谷氨酰胺的化学结构和理化性质 谷氨酰胺( o l u t a m i n e ，o l n ) 是谷氨酸的y 羧基酰胺化的氨基酸，是构成 蛋白质的氨基酸之一，分子量1 4 6 15 ，分解温度18 5 ，等电点5 6 5 ，属中性 氨基酸。作为2 0 种构成蛋白质的基本氨基酸之一，谷氨酰胺占全身游离氨基酸 一半以上【z 3 】，是机体含量最丰富的氨基酸，人体内的谷氨酰胺主要储存于脑、 骨骼肌和血液中。因此，谷氨酰胺被认为是目前所知的最重要的氨基酸之一， 并被称为“条件性必需氨基酸”。谷氨酰胺的结构式如下： h 2 n o0 n h 2 图1 1 谷氨酰胺结构式 f i gl - 1s t r u c t u r a lf o r m u l ao fg l u t a m i n e 1 1 2 谷氨酰胺的功能 1 1 2 1 抗氧化作用【4 】 谷氨酰胺是谷胱甘肽( g s h ) 的合成前体，g s h 是人体内一种极为重要的抗 氧化物质，g s h 在应激状态下能保护组织免于氧自由基的损害，从而降低了化 疗、放疗、感染等应激情况下自由基对细胞的损伤，增高了毛细血管的通透性， 使细胞外液浓度降低。因此，补充谷氨酰胺可通过保持和增加组织细胞内谷胱 甘肽的储备，有利于保护或减轻内皮细胞免受氧自由基介导的损伤，稳定细胞 膜和蛋白质的结构，也有利于受损细胞的修复和功能恢复，提高机体的抗氧化 能力。乔玉成【5j 等采用大鼠力竭性游泳运动，通过补充g i n 对比实验，观察力竭运 动后18 h 大鼠肝组织中丙二醛、g s h 、超氧化物歧化酶含量的变化。结果表明： 补充外源性g i n 有助于维持运动后肝组织g s h 水平，增强其抗氧化损伤能力， 减轻肝组织脂质过氧化反应。徐文萍等研究游泳前补充和未补充外源性g i n 对大 鼠血清和肾、肝组织丙二醛( m d a ) 含量、g s h 水平、超氧化物歧化酶( s o d ) 活力影响。表明补充g i n 能抑制血清、肝组织s o d 升高和。肾组织m d a 的增多【3 。 1 1 2 2 参与生物大分子的合成 谷氨酰胺是d n a 合成、细胞分化与成长所需，也是创伤恢复与组织修复所 需，当机体严重创伤时，提供外源性含g l n 膳食及药物，能促进伤口愈合，g i n 起到节氮和促进机体恢复的作用，提高机体对感染的耐受性。另外，它还参与 蛋白质的生物合成，其分子中的氨氮作为氮源参与核酸和糖蛋白的合成【6 】。 1 1 2 3 增强机体免疫力，防止疾病的发生 谷氨酰胺是淋巴细胞增殖所必需的，具有重要的免疫调节作用，谷氨酰胺 是淋巴细胞，肠黏膜细胞等快速代谢细胞的首选能源物质，淋巴细胞中富含高 活性的谷氨酰胺酶，作为核酸生物合成的前体和主要能源。谷氨酰胺可促进淋 巴细胞，巨噬细胞的有丝分裂和分化增殖，抑制肿瘤坏死因子( t n f ) ，白介素 1 ( i l 1 ) 等细胞因子的产生。 黄耀凌等【_ 7 】给小鼠补充外源性谷氨酰胺，结果小鼠脾淋巴细胞自然增殖能 力增强，b 淋巴细胞分泌抗体能力增强，吞噬细胞的吞噬活性增强，红细胞免 疫功能也明显增强。c a s t e l l 等【8 】提供了口服补充谷氨酰胺可以预防感染发生的 最好证据：参加马拉松的运动员在比赛后即刻或运动后2 h 摄入安慰剂饮料或者 谷氨酰胺溶液，进行谷氨酰胺补充的运动员中8 l 的人在这一时期没有发生感 染，补充安慰剂的运动员只有4 9 的人没有发生感染。 1 1 2 4 供能作用p j g i n 为生糖氨基酸，脱氨后可异生为葡萄糖或糖原。糖原贮备的增加有利于 机体耐力的提高，增强机体对运动负荷的适应能力。当肌肉剧烈运动，储备的 a t p 不能满足机体所需时，肌酸磷酸激酶可以直接将肌酸磷酸的能量传递给a t p 供体所用。其中，肠道是利用g i n 最多的器官，并且g i n 在肠道是主要的能源物质。 1 1 2 5 调节酸碱平衡 谷氨酰胺在机体内有抗酸作用。正常情况下，它能促进。肾脏排泄过多的酸， 从而防止机体酸中毒，慢性代谢性酸中毒时，器官内的谷氨酰胺含量和流向发 生改变，如肝脏、肌肉、肺释放的谷氨酰胺，被肾大量利用，以满足肾对氨源 的需求，肾通过合成谷氨酰胺而解除氨毒。g i n 被肾远端小管还原成氨( n h 3 ) 和谷氨酸( g l u ) ，n h 3 结合过量的h + 成n h + 4 与c l 。一起排出体外。机体在酸 中毒时维持谷氨酰胺新平衡可通过许多途径，但肝脏谷氨酰胺酶被门静脉中氨 激活最为重要，此时肠对谷氨酰胺吸收量并没有增加，大量的谷氨酰胺在酸中 毒时通过肝脏谷氨酰胺酶释放出来以维持肾的需要。 1 1 2 6 抗应激作用 添加谷氨酰胺可使血清的皮质酶水平显著降低，是一种极有潜力的热休克 反应促进剂，谷氨酰胺能诱导动物的热休克反应，且特异性地增强起主要保护 作用的热休克蛋白h s p 7 2 矛ih s p 2 7 的表达。在创伤、外科手术或者感染状态下， 血液和组织中的谷氨酰胺的含量陡然下降。添加谷氨酰胺可提高动物的存活率， 增强免疫功能，减少毒血症的发生，增强肠道屏障功能和抑制肠黏膜萎缩，对 创伤、化疗、放疗等引起的肠粘膜损伤具有明显的保护作用 1 0 - 1 4 】。 1 1 2 7 对学习记忆的改善作用 2 学习记忆是运动技能形成的前提和基础。谷氨酸作为主要的中枢兴奋性氨 基酸递质，介导一系列高级神经活动，因此，补充谷氨酸具有促进记忆作用。谷 氨酰胺作为谷氨酸代谢的前体物质，可通过血脑屏障自由出入大脑，因而比谷 氨酸更具有调节神经系统功能的作用。有研究表明，谷氨酰胺的补充可提高脑 内一氧化氮合成酶活性和海马n 甲基d 天冬氨酸受体数目，对学习记忆 有重要意义，有利于运动技能的形成。 1 1 3 谷氨酰胺的应用前景 鉴于谷氨酰胺的多种特有功能，可开发出各种食品或药品，具有广阔的应 用前景。 1 1 3 1 强化免疫食品 人体的免疫系统主要由皮肤、呼吸道、胃肠道粘膜、免疫细胞和免疫球蛋 白组成。这个系统内的每个部分几乎与谷氨酰胺有关，其中免疫细胞尤其明显， 在谷氨酰胺缺乏时，淋巴细胞、巨噬细胞几乎不能生长。各种实验证明，谷氨 酰胺可使免疫系统更加有效地发挥作用。如果利用这特性，将谷氨酰胺加入 布丁或果汁饮料中可以大大提高儿童或成人对疾病的抵抗力，还可以大大提高 化疗病人的免疫细胞水平。另外，开发外用药物可使烧伤或皮肤移植病人的皮 肤再生速度加快，并能有效地提高病人抗感染能力。 1 1 3 2 强身壮体的食品或药品 肌肉是身体中谷氨酰胺的生产基地和贮藏仓库。肌肉细胞内存有大量流动 的谷氨酰胺，约占总游离氨基酸6 0 ，以维持肌肉细胞的正常工作。在代谢应 急状态时，如饥饿、疾病、创伤或从事紧张生理活动时，肌肉产生更多的谷氨 酰胺以维持血液中谷氨酰胺的水平，而肌肉中的谷氨酰胺水平可能会下降5 0 。 对这类病人最普通的方法是静脉注射谷氨酰胺以阻止或减少肌肉分解。开发含 有谷氨酰胺的新型输液具有极其重要的现实意义。过量运动时产生代谢反应， 在体内形成过量的酸，人体必须通过肾脏在谷氨酰胺的作用下除掉这些酸性副 产物，如果得不到外界的及时补充，机体就不得不分解肌肉得到大量谷氨酰胺 到肾脏，导致肌肉功能受到影响。如果将谷氨酰胺与其他营养物质配制成新型 口服液或运动型饮料，每天补充l o g ，不论病人还是运动员，即便是健康人也利 于维持正常的肌肉功能。 1 1 3 3 增强肠胃功能的食品或药物 葡萄糖胺是构成肠胃粘膜的重要组分，而谷氨酰胺能促进葡萄糖胺的合成， 支持胃粘膜的修复，日本科学家将谷氨酰胺与其他药物复合制成新型抗胃溃疡 药物一一麦滋林已在中国市场流通。在亚洲市场，谷氨酰胺在同类胃药中的市 场份额是相当大的。目前市场上还未见到用谷氨酰胺专门治疗腹泻的药物，特 别是小儿和孕妇，用谷氨酰胺制成的抗腹泻药物没有其他化学药物的不良反应， 而且效果良好。其具体机制包括：首先，它可以增加肠道对钠和氯的吸收，进 而增加水分的吸收；其次，谷氨酰胺通过增强免疫功能来提高抗感染力。如果 是感染性腹泻，就有利于肠道清除侵入机体的病原微生物；最后，有些腹泻是 由于炎症感染或禁食引起的肠粘膜受损所致，谷氨酰胺则可促进肠粘膜修复从 而有利于肠道吸收水分和营养物质。 1 1 3 4 老年食品及保健品 进入2 1 世纪以后，包括中国在内的世界人口结构将进入老年化状态。老 年化人口将逐渐增加，老年食品及保健品将会有越来越大的市场份额。有些老 年人长期饮酒或长期服药导致胃肠功能紊乱和消化、吸收不良，其结果使得老 人的营养摄入不足，补充外源性谷氨酰胺可以提高血浆中谷氨酰胺的浓度，保 护胃肠道的正常功能。将维生素b 6 、b 1 2 、d 、烟酸、锌、铬、钙以及谷氨酰 胺复配成营养保健品，可防止老人骨质疏松和肌肉萎缩、防止萎缩性胃炎，甚 至对冠心病及延缓衰老均有好处。将维生素c 、维生素e 、1 3 胡罗卜素以及谷 氨酰胺复配成营养液，属于清除体内氧自由基，提高免疫力，延缓衰老类型的保 健品。同时，老年人服药相对增多，增加了肝脏的负荷，谷氨酰胺可保护肝脏 更能耐受药物的刺激，维持其正常的功能。 谷氨酰胺现在的国际市场价格约在1 0 0 万元吨左右，生产成本约为谷氨 酸的3 4 倍。如果按年产10 0 0 吨计算，原料药产值约为1o 亿元人民币【1 5 】。消化 道溃疡和脑神经功能疾病在我国乃至世界都属多发病。药用氨基酸需求量很大， 有巨大的潜在市场。药用长期以来一直依靠进口，价格昂贵。如果加工成药剂 后可创造更大的经济效益，产品还可大量出口创汇。 1 1 4 谷氨酰胺应用的局限性 谷氨酰胺在通常情况下可由人体自身合成，但在非常情况下，人体不能自 身合成，需要由外界补充，这样才能维持人体正常的新陈代谢。 目前，谷氨酰胺的生产方法主要有合成法和发酵法【l 引。合成法制g l n 主要 有以下两种：第一种方法是由l 谷氨酸甲酯经缩合、加成、成盐、水解、经 活性炭脱色、重结晶得成品。另一种方法是采用l 谷氨酸合成甲酯后，与水合 阱反应得酰阱，再用r a n e y 镍将其还原为g l n 。发酵法生产g i n 类药用氨基酸在 国外产量十分可观：19 7 7 年日本用发酵法生产年产量达10 0t ，19 7 9 年上升到 5 0 0t ，1 9 9 0 年则上升到12 0 0t ，并有逐年递增的趋势。用发酵法生产的发酵 浓度日本为6 0g l ，韩国为5 0g l 。日本味之素公司g l n 提取总收率为4 0 。 我国自2 0 世纪8 0 年代以来也进行了发酵法工艺的研究，但国内尚属起步阶段。 谷氨酰胺在临床上应用还相当困难，究其原因有：首先，谷氨酰胺水溶液 极不稳定，容易水解成谷氨酸和氨，谷氨酰胺受热后形成毒性物质一一焦谷氨 酸( p y r o g l u t a m i ca c i d ，p g l u ) 。尽管研究发现低温保存时g i n 分解较少，但在复温 时，随着温度的增加，p g l u 生成也成倍增加，即使使用前配制，也需要严格的 无菌条件，而且具体实施极为困难。其次，谷氨酰胺侧链不带电荷，溶解度较 4 低，2 0 时溶解度为3 5 9 1 0 0 9 水。为降低g i n 形成p g l u 和氨的危险性，临床上 应用g i n 时浓度不超过1 o 1 5 ，这样就增加机体的水负荷，某些患者( 如心衰， 肾衰患者) 不能耐受如此大的水负荷。另外，机体对游离氨基酸的适应性较差， 容易产生过敏现象，有时，一瓶2 5 0 m l 的输液得经3 h 以上才能输完，速度稍快， 就会出现恶心、呕吐、休克等过敏现象，严重地限制了它在紧急情况下的应用 【4 】 o 因此，目前g i n 的应用主要有两个途径：一是现配现用，把g l n 晶体加到氨 基酸溶液中，然后过滤除菌，在八小时内输完。该过程必须严格无菌操作且工 作繁琐、费时，使用范围受到限制。其次是合成g l n 衍生物，如乙酰谷氨酰胺 ( n a c e t y l g l u t a m i n e ) ，它合成容易，加热稳定，在体内可形成g i n ，但它的利用 率较低，摄入量的2 0 4 0 被从尿中排泄掉，实际应用中损失太大。 1 2 谷氨酰胺活性肽 1 2 1 生物活性肽简介 生物活性肽指的是一类相对分子质量小于6 0 0 0 ，具有多种生物学功能的多 肽。这些活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，食用安全性极高。生物活 性肽是肽类的热门研究领域，肽的吸收和生理作用已有较深入的研究【l 6 1 。 1 2 1 1 生物活性肽制取方法 目前，生物活性肽的生产制备方法和途径主要有三条： ( 1 ) 提取法 提取法是指从自然界生物体中提取其本身固有各种天然活性肽类。在该方 法中，生物体含量很低，加工成本却很高，且大量提取会造成物种资源萎缩； 另外，提取生物活性肽残存有机溶剂又会带来毒性问题。 ( 2 ) 合成法 合成方法制备生物活性肽，包括化学合成法，酶合成法和基因表达法。化 学合成法就是用精细化工生产的氨基酸进行人工嫁接成单肽，此法成本高、成 功率小，与现代绿色化学的要求有一定距离；酶合成法，此法相对有很多优点， 如反应温和，酶催化位置有方向性等，但反应产物多，最适酶缺乏及产率过低 等因素都制约着其发展；基因表达法是从动物，如从猪胸腺和人的组织及血液 中分离或提取合成，此类产品如胸腺肽、胸腺五肽、白细胞介素i 、白细胞介 素i i 、白细胞介素i i i 、免疫球蛋白、人血清白蛋白、干扰素、脑活素、肿瘤细 胞坏死因子、表皮生长因子等，此法在过去的一定时期发挥了一定的作用，但 此法获得肽成本高，副作用大。 ( 3 ) 酶解蛋白法 酶解蛋白法就是用生物酶( 芳香植物蛋白酶) 降解( 催化) 蛋白质，将动 植物大分子蛋白质降解成小分子活性多肽，通过口服，人体极易吸收和利用。 这种方法是完全模拟人体将大分子蛋白质降解成肽的模式，进行体外人工降解 大分子蛋白质合成的肽。这种方法获得的外源性的肽极易被人体吸收和被组织 利用，而不会出现基因表达法的排异性和病毒携带的风险，机体适应性强，也 不会出现化学合成肽的化学毒性及风味问题。 蛋白质降解获得的多肽，它们的生理功能多种多样，既有整体性，也有相 互传递、相互控制、相互抑制作用，还具有综合治疗作用。若将多肽按单一生 理功能纯化，可能不如不分离纯化的好。单一功能的肽，其生理功能确定，这 固然好，但单肽有一定的禁忌或选择性，而混合多肽对单肽的一些不利因素可 中和或牵制，达到统一和平衡。酶法多肽的可贵之处，就是蛋白质降解物生理 功能的整体性、综合性、中和性、协同性。这是酶法多肽理论在当今多肽领域 理论和实践的创新，具有较强的现实性和独特性。 1 2 1 2 酶解蛋白制备生物活性肽的进展 国外对蛋白质水解的研究始于1 0 0 多年前，然而真正使蛋白质水解成为热点 和焦点的原因，是人们从蛋白质的酶解物中发现并分离纯化出具有一定生理活 性的生物活性肽【l7 】。大米蛋白方面，y o s h i y u k i s 等用酶解处理黄酒加工的副产 物酒糟，分离获得了9 种a c e 抑制活性的肽。玉米醇溶性蛋白方面，采用嗜热菌 蛋白酶( t h e r m o l y s i n ) 水解玉米醇溶性蛋白( r z e i n ) 获得了一种具明显降血压功 能的活性肽，其一级结构为p r o p r o v a l h i s l e u t l 8 。2 0 1 。还有玉米蛋白用特殊蛋 白酶分解处理成小断片的“玉米肽，这些玉米肽可使身体吸收乙醇的速度减慢， 并能促进酒精代谢，这样可以大大减少急性酒精中毒的发生率，人们称此类玉 米肽为醒酒肽。玉米淀粉是酿酒的原料，玉米蛋白又可防止醉酒，确实令人称 奇【2 1 1 。 我国利用蛋白酶解制备生物活性肽方面的研究起步较晚，早期对蛋白质水 解的研究主要是基于改善蛋白质的加工功能特性方面，而且大量的研究工作都 集中在大豆蛋白、花生蛋白等植物蛋白。随着对生物活性肽具有的各种生理功 能的进一步认识，现在国内对生物活性肽的研究与生产也非常重视。大豆蛋白 方面，肖凯军等人研究了木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白的工艺参数，并制备出 营养效价高、易于消化吸收、无异味和苦味的大豆多肽，并把它应用于老年奶 粉中【2 引。吴建平等人应用不同蛋白酶对大豆蛋白进行水解，通过研究证明其酶 解液具有降血压功能并证实酶解液中含有a c e 抑制因子，确定了大豆蛋白酶解 制备降血压肽的最佳工艺条件，同时分析了大豆降血压肽的分子量分布、氨基 酸组成和肽谱等。哈高科公司利用酶解方法己从大豆蛋白中制备出具有抗氧 化功能的大豆低聚肽产品。乳蛋白方面，目前我国实现工业化的乳蛋白生物活 性肽主要是酪蛋白磷酸肽( c p p ) ，其产品中c p p 含量介于2 5 9 0 不等，c p p 成 分的分子量介于2 0 0 0 d a 3 0 0 0 d a 之间，近年来，国内已展开了对淡水鱼蛋白和 海洋鱼蛋白的研究与开发【2 弘2 4j 。 生物活性肽的研究领域发展很快，已受到科学家和政府的高度重视，短短 6 几年内就有众多的生物活性肽被研究出来。在国内生产活性肽的厂家中，三九 公司已开发了一系列多肽产品如免疫活性肽、神经肽、减肥肽、酪蛋白磷酸肽 和抗菌肽等作为药品和保健品【25 1 。广州轻化所和杭州的娃哈哈集团也开发了类 似的保健肽【26 1 ，这些肽的生产取得了巨大的经济效益和社会效益。随着现代蛋 白质工程和酶工程技术迅速发展，将会有更多的生物活性肽不断被研究和开发 出来，应用于功能性食品、食品添加剂、化妆品、无公害饲料添加剂、并开发 出新的临床药物。 1 2 2 谷酰胺活性肽的研究进展 由于谷氨酰胺的特殊物理化学性质，限制了它的广泛应用，于是人们把目 光转向了g l n 活性肽( g l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d e s ，g b p ) 上，它能克服谷氨 酰胺单体的缺点，不仅具有水溶性好，稳定性强，低敏感性，易于吸收等优点， 而且保留着谷氨酰胺原有的多种营养和功能，已越来越被人们所关注。 19 19 年t h o e r f e l d e r 假设并证实了肽中g l n 的酰胺基比游离g l n 中的酰胺基要 稳定【27 1 。7 0 8 0 年代的动物实验和人体临床实验证实了g l n d x 肽作为g l n 代用品 的功效性和安全性，并分别对三种g l n d 、肽即g l y g i n ，a l a g l n ，g l u g l n 进行了 研究。进入9 0 年代，日本首先从谷蛋白中开发出一种富含g l n 活性肽的营养液， 并获得专利。近来研究表明，机体对寡肽的吸收利用率远比对游离氨基酸f f a a ) 高，日本市场上出现的第三代蛋白水解物中游离氨基酸( f a a ) 少于2 0 ，而小 分子量的寡肽占7 0 以上，小分子量寡肽营养丰富，具有极佳的生理特点，能 及时、快速补充机体所需氨基酸。 目前比较常用的是人工合成的谷氨酰胺二肽：甘氨酰谷氨酰胺( g l y g i n ) 和丙氨酰谷氨酰胺( a l a g l n ) ，2 0 时，g l y g l n 和a l a g i n 在水中的溶解度分别 为15 4 9 和5 8 6 9 ，而且有很好的耐热稳定性，1 2 0 高温处理仍能保持稳定。常 温下2 年仍能保持稳定，加入到营养混合液中也不影响谷氨酰胺二肽的稳定性。 谷氨酰胺活性肽在体内易分解成谷氨酰胺，从而补充机体的谷氨酰胺不足。 a l b e r s 等的实验证明，健康人体长期注射谷氨酰胺二肽，没有任何副作用及不 良反应，不影响正常的肝肾功能 28 1 。谷氨酰胺二肽在肠外营养中的应用是安全 的，也是有效的，具有谷氨酰胺的许多作用。它们的生理作用没有明显的差别， 所以无论是g l y g l n 还是a l a g l n ，都可用来代替谷氨酰胺用于肠外营养，达到 治疗的目的。 但是这种人工化学合成的二肽价格昂贵，合成量低，且有污染，其广泛应 用仍然受到制约，很难满足市场的需求。而利用酶法水解原料制备富含g i n 的活 性肽具有水溶性好、稳定性强、对机体的低敏感性、易于吸收等优点，且较用 化学方法有很高的安全性，经酶法制备的寡肽可以直接作为辅助治疗的功能食 品和食品添加剂，也可作为其他氨基酸药物的强化剂，以补充机体内缺乏的谷 氨酰胺，起辅助治疗作用，缩短患者恢复期。 黄耀凌等用谷蛋白酶解肽灌喂2 1 日龄断奶仔猪，发现补充酶解肽能维持早 期断奶仔猪机体血浆的谷氨酰胺库，与游离谷氨酰胺的作用相近。与早期断奶 仔猪相比，灌喂酶解肽和灌喂谷氨酰胺的仔猪血清中反映机体应激的皮质醇激 素下降，l e p t i n 水平下降，其他与生长免疫相关的激素( i n s u l i n ，t 3 ，t 4 ，i l 2 ) 在 血清中的水平上升，仔猪增重提高，免疫机能加强。而且酶解肽组和谷氨酰胺 组仔猪与正常断奶组比较其生产性能及免疫指标接近【29 1 。 1 2 3 酶法制备谷氨酰胺活性肽 小麦蛋白被美国批准为公认安全物质( g r a s ) ，主要由谷蛋白和谷胶蛋白 组成。小麦蛋白的氨基酸及组成见表1 1 【4 】。 表1 1 小麦蛋白的氨基酸组成( m g 1 0 0 9 ) f i gl 一1 a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fw h e a tp r o t e i n ( m g 10 0 9 ) 从表中可见小麦蛋白中含有大量的谷氨酰胺，且小麦蛋白粗蛋白含量高， 适口性好，无异昧，是淀粉工业的副产物，其来源广泛，可以采用生物酶技术 对其进行有限酶解，可制各安全、水溶性好、敏感性小的优质寡肽，是取代谷 氨酸胺二肽很有潜力的新型氨基酸制剂。 水解度( d e g r e eo fh y d r o l y s i s ) 是酶法水解蛋白质过程中的个重要的指 标。酶催化下控制水解作用的原理是3 4 】：1 9 7 6 年a d l e rn i s s e n 首先提出水解度的 概念：d h = h ( 被裂开得肽键数) h 息( 蛋白质的总肽键数) 。1 9 7 7 年a d l e rn i s s e n 又采用这个参数描述了控制蛋白质酶催化水解的原理和方法。蛋白质在催化下 水解，随着被裂开的肽键数不断增加，反应体系的p h 不断下降，如果在反应 过程中连续的加入碱液就有可能保持反应体系得p h 不变。从化学角度上看，肽 键的水裂解过程中，其机理为： ( 1 ) 打开肽键 c h r c o n h c h r + h 2 0 c h r7 c o o h + n h 2 c h r 8 ( 2 ) 质子交换 c h r c o o h + n h 2 c h r 叫c h r c o o + n h 3 + - c h r ( 3 ) 氨基滴定 n h 3 + c h r 。+ o h 二_ n h 2 c h r + h 2 0 近年来，蛋白水解酶的开发和应用发展迅速，下面是常用的食品级蛋白酶 的基本概况： 表1 - 2 常用的食品级蛋白酶 t a b l e1 - 2u s u a l l yu s e df o o dg r a d ep r o t e a s e 研究表明，谷氨酰胺活性肽中非n 端g l n 才是稳定有效的【35 1 ，为此要求产品 中游离的g i n 及n 端g l n 越少越好。由表1 2 可看出：风味酶有很强的氨肽酶作用， 常用于增进和改善水解液的风味，能彻底的水解蛋白质。酸性蛋白酶兼具有外 切和内切酶的作用。木瓜蛋白酶水解过程中能水解酰氨基团 3 6 - 3 8 】。目前，采用 酶法制备谷氨酰胺结合肽，通常选用的酶为碱性蛋白酶，胃蛋白酶和胰蛋白酶。 9 任国谱等以玉米蛋白为原料，采用复合蛋白酶a 和碱性蛋白酶两次酶解制 备谷氨酰胺活性肽营养液，酶解液通过