（无机化学专业论文）大分子调控难溶钙盐结晶的谱学研究.pdf

i ti sn o t o n l yi m p o n a n t a c a d e m i c s i g n i f i c 锄c e a b o u t r e s e a r c h i n g t h e m e c h a n i s mo fb i o m i n e 豫l i z a t i o nu s i n gp r o t e i n sa n de n z y m e s a so r g a n i cm a t f i xb u t a l s oi r n p o r t a n ti n s t m c t i o n a ls i g n i 丘c a n c et ot l l e e s p e d a 王m a t e r i a l sw i t he x c e l l e n t p r o p e r t i e sa n dp r e v e n t i n gd i s e a s e s i nt h i sp a p e r ，b i o m i n e r a l i z a 胁nw a sf i r s tr e v i e w e d t h er c s e a f c hs i g n 溉a l l c e ， c a t e g o r i e s ， c h i e fc h a r a c t e r i s t i ca n d m e c h a i l i s mo f b i o m i n e r a l i z a t i o nw e r e i n t r o d u c e d w bn o t o n l y t a l k e da b o u tt h e h i s 形貌十分独特的多孔状c a c 0 3 结晶。在聚乙二醇和羟乙基纤维素溶液中分别生成 着超分子相互作用，不仅基质对钙盐的结晶有诱导作用，同时，在晶体生长过程中，生成 s o l u t i o n sb e f o r ca i l da f t e rc r y s t a l l i z a t i o n t h eo b t a i n e dc o m p o s i t ec a l c i u ms a l t s w e r ec h a r a c t e r 汝db 卫x - r a yp o w d e rd i f f r a c t i o n ( m ) a n a l y s i sa n ds c 眦i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) 。 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ev a 专e r i t ec a l c i u mc a r b o n a t e c r y s t a l sw e r ef o n n e d i nb o v i n es e m ma i b u m i n ，b o v i n eh e m o g l o b i na l l d p e p s i ns o l u t i o n ， w h i l ei n l y s o z y m es o l u t i o nf o r m e da r a g o n i t ec a l c i u mc a r b o n a t e t h e s ef o u rk i n d s0 f p r o t e i n sa n de i l z y i n e sa l lc a nd i r e c tt h ec r y s t a l l i z a t i o no fh a pw h i c hh a v ed i f 诧r e n t s i z ea n ds h 印e s c a i c i t ew i t hd i 骶r e ms h a p e sf o n n e di n p o l y v i n y la l c o h o la n d p 0 1 y p r o p y l e n e a c y l a m i d es o l u t i o n s ，w h i l ei np o l y e t h y l e n eg l y c o la n dh y d r o x y e t h y l c e l l u l o s es 0 1 u t i o nf o r m e d a r a g o n i t e a n d v a t e r i t e ，r e s p e c t i v e ly f u r t h e m l 0 1 e ， a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fc i r c l l l a rd i c h r o i s m ( c d ) 、f b u r 主e rt r a n s f o r m a t i o n i n f r a r e ds p e c t f o s c o p y ( f b i r ) 觚dm e a s u r e l n e n to fc o n d u c t 孤c er a t i o s w ef o i i i l d t h a tt h e r ew a st h es u p e r m o l e c u l ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm a c r o m o l e c u l e sa l l dc a l c i u m s a l t sd u r i n gt h ec a l c i u ms a l t sf b 瑚a t i o n p f o c e s s i ti sn o t o n l yt h e o r e t i c a l l ys i g n i f i c 鲫tt or e s e a r c ht h em e c h a i l i s mo f b i o m i n e r a l i z a t i o nb u ta l s o i n s t m c t i v e l yi m p o r t a n t t ot h e b i o m i m e f i cs p e c i a l m a t e 血l sw i t he x c e l l e n t p r o p e n i e s 7 n l i sw o f kw a ss u p p o r t e db yi h en a t i o n a l n a t l l r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( n 0 2 0 3 7 1 0 1 6 ) ， k e y w o r d s ：o 曙a n i cm a t r i x ，p r o t e i l l ，e n z y m e ，m a c r o l n o l e u l e s ，c a l c i u mc a r b o n a t e 。 h y d r o x y a p a t i t e ，s u p r a m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n ，b i o m i n e f a l i z a “o n b i o m i m e t i cs y n h e s i s 蔓二至丝堡 第一章绪论 本论文属于生物矿化的研究范畴。生物矿化的研究是化学、医学、生物和材料等多学 科相互渗透和相互交叉的前沿课题附，孤，研究生物矿化不仅对认识生命现象有重要的理论 意义，而且可以为人工合成特殊功能材料和生物智能材料提供了一种新的方法，因此生物 矿化研究已成为材料科学、生命科学、医学和生物无机化学等领域的研究热点。目前，对 生物矿化的模拟研究主要集中在三个方面：基质的种类、组成对无机物结晶的影响，如 研究泡囊、表面活性剂、l b 膜等有机组合体对无机物结晶的影响；基质的物理化学性 质对无机物结晶的影响，这方面的研究主要集中在有机基质的表面自由能、过饱和度、酸 碱度、粘度等对无机物结晶的影响：对生物矿化过程形成的无机物的研究，这包括晶体 的组成、形貌与它们的功能之间关系的研究。 蛋白质是生物体的重要组成部分，一些蛋白质在生物矿化中发挥着重要作用。近3 0 年来，蛋白质的生物功能引起人们的普遍关注，特别是随着生物高分子研究新技术、颓方 法在该领域研究上的应用，使国内外对蛋白质及其复合物的研究迅速发展。目前蛋白质化 学己成为分子生物学、医学、食品科学等领域的研究热点之一。我们的实验体系采用蛋白 质作为有机基质，这使得我们的研究体系更加接近生命体系，并且有可能得到有机无机复 合材料。 生物矿化机理的研究属于微观体系的研究，利用现代光谱学技术，可以使我们的视野 扩展到微观领域，从而对生物矿化过程中有机基质和无机盐之间的相互作用进行深入的研 究，期望在分子和超分子水平上认识生物矿化机理。 1 1 生物矿化概述 生物矿化是指在生物体内生成矿物质的过程，即在生物体的特定部位，在一定的物理 化学条件下和有机基质的指导下，生物体将无机物与生物有机基质通过自组装形成具有生 物功能的特殊材料的过程，是一个高度受控的生命过程。生物矿物质与地质上的矿化作用 产物明显不同的是无机相的结晶严格受控于天然生物大分子，在常温常压下，利用环境中 极其简单常见的组分通过一系列节能、无污染的处理，并通过生物分子的超分子预组装， 在隔室中进行晶体的成核、生长和精确的加工修饰【4 】，形成天然有机无机复合材料：其外 形优美、排列有序、结构合理、性能优越，是传统的材料科学工程所不能及的。图1 1 。图 1 第一章绪论 1 4 是存在于生物界的各类生物矿物的显微结构示意图。 图1 l 各种纤状结构和柱状结构立体示意图 n 驴聪l lg r a p h i cm o d e lo f v a r i e o u s 舳f e - l n 汜蛐dp o l a r - l i k cs t n l c t l 】r c s 图1 - 2 叶状结构立体示意图 n 鲥坤1 2g r a p h i cm o d do ff o l i a g e - l i hs t 邢c t t t r e s 图l - 3 交指纹结构立体示意图 n g u n 1 - 3g r a p h i cm o d c l0 fc r o s d - a n g e r p d n ts h c t u r c s 图l - 4 珍珠结构立体示意图 勘卵脚l - 4g 叩h i cm o d e lo f p e a l l 2 第一章绪论 生物矿物的分布相当广泛，从细菌、微生物的细胞壁，植物的叶子、针刺，昆虫的甲 壳、螯刺，节肢动物的外壳，软体动物的骨针、禽蛋的外壳直至动物的骨骼和牙齿。它们 的功能十分齐全，除了广泛用作细胞的离子库以及结构、支撑和保护的材料之外，往往还 具有某种特殊的功能。例如，趋磁细菌中有序排列着的数颗单磁畴大小的f e 3 0 4 被用于游 动时识别方向，同样，金枪鱼、鲑鱼的头部也以f c 3 0 4 作为导航的生物磁罗盘，三叶虫以 c a c 0 3 作为眼棱镜，而头足纲动物如乌贼则以c a c 0 3 作为它的浮力装置，鱼类的头部以及 哺乳动物的内耳都是以c a c 0 3 作为重力接受器的，不过前者是文石结构而后者则是方解石 结构，如此等等，不一而足。这些生物矿物还具有特定的显微结构。如软体动物的贝壳珍 珠层，它是由定向排列的文石小板片及少量有机质( 5 ，质量百分比含量) 形成层状结 构即】，具有硬度大及韧性高的特点，破裂韧度比相应的无机成因文石大2 3 个数量级m ； 海胆骨针由方解石单晶组成，但又不像无机成因方解石单晶那样极易沿解理面裂开，其力 学性能独特【8 】。生物矿化的原理为制造高级复合材料提供了新的思路和途径【9 以3 1 。 1 1 1 研究生物矿化的意义 近年来，有关生物矿化的研究十分引入注目。其主要原因是生物矿化的研究已成为化 学、医学、生物和材料等多学科相互渗透和相互交叉的前沿课题【m 】，更为重要的是它为人 工合成具有特殊功能的晶体材料和生物智能材料提供了一种新的思路和方法。 1 1 1 1 在材料科学领域的意义 最近二十余年的研究表明，基于生物矿化的原理合成无机材料，即仿生材料工程，是 一种全新的材料设计和制造策略，它将会给材料科学带来一场革命【1 2 ，1 4 1 5 】。随着仿生合成 化学这一新兴领域的出现，材料科学家越来越意识到无机材料合成中传统的高温高压合成 方法已经不能适应未来对先进材料的要求。而与普通天然材料及合成材料相比，生物矿化 材料具有特殊的高级结构和组装方式，有很多独特的近乎完美的性质，如极高的强度，非 常好的断裂韧性、减震性能、表面光洁度以及光、电、磁、热、声、催化活性等特殊功能 “。正是这些独特的性质，引起了科学家的兴趣，通过各种手段，揭示生物矿化材料形成 的奥秘，研究生物矿化材料的形成过程，为人工合成材料提供新的理论指导与设计依据【切。 研究生物矿化机理及仿生矿化材料，是基础理论的需要，也是具有巨大潜力的应用项目。 生物矿化中的自组装、动力学、反馈和再模拟将为合成生物活性陶瓷、功能生物材料、非 传统资源利用等提供新的理论，也将为这些领域的发展开辟新的研究天地。通过对生物矿 化的研究，认识到有机分子可以改变无机晶体的生长形貌和结构，因而提供了强大的工具 用来设计和制造新的材料。日前已经成功地仿生合成制备了纳米材料、半导体材料、陶瓷 3 第一章绪论 薄膜材料、金属和有机聚合物基体上的陶瓷薄膜涂层材料、人造骨材料及复杂形貌的类生 物矿物材料等等u ”。 1 1 1 2 在医学领域的意义 结石病是世界性的常见病和多发病，结石的形成机理、诱导因素及抑制因素尚不十分 清楚，一些结石中含有的大量无机物及少量有机基质是生物体内异常矿化形成的产物，大 量的研究证实基质在结石的形成中起到了非常重要的作用。对生物矿化的研究有助于找出 异位矿化、结石和矿物溶解( 龋齿、骨质疏松) 的病理原因，为治疗这类疾病提供有用的 信息，同时也为临床上用药提供参考，从而更有效地预防和治疗结石、骨质疏松，具有重 要的临床意义【1 9 】。 长期以来，大范围骨缺损的临床修复一直是困扰医学界的主要难题之一。天然骨组织 结构的复杂性以及材料加工方法的局限性使临床应用的骨修复材料的化学组成、相组成、 微细结构、生理学功能及其对生理环境的响应特性很难达到与人体骨组织完全一致1 2 仉2 ”。 羟基磷灰石( 珏a ) 是人体骨组织的主要无机物成分，与骨矿物质相似，能够引导骨骼生长， 无毒性，并且与人体组织具有良好的相容性，可以作为骨替代物而进行骨缺陷修复，或涂 覆于接骨材料表面，使其植入体内后有更好的修复效果，与其它骨替代材料相比，羟基磷 灰石拥有不可比拟的优势，因而在新型骨替代材料领域占有极其重要的地位【2 2 岱l 。羟基磷 灰石作为植入材料可引导新骨的生长，为新骨的形成提供生理支架。在齿科方面，可用于 生产人工齿根、骨水泥、牙膏。2 0 0 3 年崔福斋用胶原蛋白作基质制备了h a 的复合材料， 实验结果表明，作为骨修复材料与本骨有十分相似的生物功能。h a 与医用高聚物复合作 为骨替换材料使得h a 韧性增强，并充分发挥了h a 良好的生物相容性【2 6 ，卸，这是今后h a 应用研究的主要方向。随着合成技术的进步，羟基磷灰石在生物组织工程、硬组织整形和 修复、医药等领域将发挥愈来愈重要的作用。 1 1 1 3 在生物无机化学领域的意义 生物矿化是生物无机化学研究中的一个重要领域，生物矿化的研究是化学与生物科学 融合而形成的前沿学科，是从分子水平认识生命过程的机理所必需的，也是把生命科学引 进实际领域的基础和桥梁。模拟生物矿化是控制材料合成的一种很有前景的方法，尤其是 超分子排列，有可能是实现无机材料生物合成的新途径。今后应加强在细胞和基因水平的 研究工作，实现无机材料生物合成的新途径。此外，由于纳米科学和纳米药物的兴起，( 纳 米) 固体生物无机化学将是未来生物无机化学研究的一个崭新领域。 4 第一章绪论 l ，1 2 生物矿化的分类 从不同的学科领域出发，生物矿化分类不同。医学把矿化分为正常矿化和异常矿化， 化学则从反应发生的机理上加以分类。 根据生物体合成矿物过程的复杂程度和生物晶体生长过程中有机质的参与程度，生物 矿化可以分为生物诱导矿化和生物控制矿化两大类【2 8 】。 1 1 2 1 生物诱导矿化( 1 n d u c e d 瑚蛐i n e r a l l 豫t l o n ) 生物诱导矿化是指由生物的生理活动，如新陈代谢产物的析出，呼吸作用引起吸入0 2 和呼出c 0 2 ，沉淀位置如细胞壁的建立等，引起周围环境物理化学条件改变而发生的生物 矿化作用。在这种矿化过程中，矿化是有机体的生物活性和周围物理环境之间的相互作用。 这种矿化作用没有固定的局限空间，没有专门的细胞组织或生物大分子引导，只接受很少 的生物控制。细胞内和细胞外的矿物形成都没有有机物的精心设计，也没有任何活性生物 化学媒介的参与。其形成的矿物晶体习性与无机化学沉淀矿物非常类似，晶体任意取向， 缺乏独特的形态等。这种矿化过程所形成的矿物的类型可以由环境条件决定，同样的生物 在不同环境下可以形成不同矿物。如硫酸盐还原细菌诱导沉淀的黄铁矿与无机成因的黄铁 矿显著不同。生物诱导矿化作用在原核生物和真菌中占统治地位，在原生动物和藻类中也 经常发生，如仙掌藻的节片、海鳃中的轴骨均为诱导矿化的产物。 1 1 2 2 生物控制矿化( c 蚰t m u e db l o m i n e 瑚l i z a “挑) 生物控制矿化是指由生物的生理活动引起，并在空间、构造和化学三方面受生物控制 的矿化作用。这种矿化作用发生在局域化的空间内，如脂质泡囊的微区远离矿化过程初始 阶段的细胞外，通过泡囊内离子浓度的生物控制、离子输运的选择性控制及泡囊膜内部的 化学信息反馈系统控制。在这种矿化过程中，生物矿物成核和生长通常受过饱和度和共沉 淀离子的浓度控制，生物能决定活性离子穿过生物膜的运动速度，因此决定矿化位置的离 子浓度。进一步的化学控制是矿物相与有机分子的相互作用，其中有机分子起加速和抑制 矿物生长的作用，从而控制所形成的矿物的形态、排列、取向和内部结构。生物控制矿化 作用形成的生物矿物结晶习性独特，大小均匀，形态一致，排列规则，甚至晶轴方向一致。 我们一般所谈的生物矿化作用通常是指生物控制矿化作用。 1 1 3 生物矿化的主要特征 切生物矿化作用都是受控的、动态的过程，矿化过程中的每一步骤都发生在一定的 时间和精确的位置上。这是因为生物体内进行的矿化作用不同于实验室里的结晶形成，它 是在细胞基质的参与下，受到代谢调控，在特殊的反应介质中进行的，故整个过程具有以 5 第一章绪论 下三个明显的特征： 1 1 3 1 生物矿化发生在特殊的隔室中 细胞在生物矿化中的重要作用从根本上来说是隔室化，它可使反应物富集、定位并催 化反应的发生。隔室的空间是由细胞所分泌的生物大分子经过自组装而形成的，它可以是 纤维状、片状的基质，也可以是先在细胞膜上形成，然后从膜上分离出来的基质泡。晶体 成核和生长过程被隔室在时间上加以分开而调节，基质作为模板，可以诱导生物矿物的结 晶方式与大小，提供矿物形成的生长点，使其具有有序结构并将矿物与软组织相连。在基 质的有机无机界面上，可以通过调节离子运送、离子的配合与解离、氧化还原性质等达到 准确地控制局域的离子过饱和度，甚至还可以通过离子结合强度和水流方向来改变矿化位 点处的离子活性，从而对晶核的形成、晶体习惯面的形成与改变以及晶体生长过程中的相 变等产生影响。隔室内的过饱和度则受到离子载体或离子泵的控制，而且基质泡、聚电解 质、磷蛋白或其他的钙离子成键蛋白、磷脂以及酶催化所释放的新生离子等都会对过饱和 度产生影响，不过迄今为止，对于此机理还不是很了解。 1 1 3 2 生物矿物一般具有确定的晶体大小和取向 晶体生长与有机基质的结构和化学性质密切相关，晶体的选择性常常是由有机无机界 面的特殊位置诱导而产生的，它可以包括：周期性的带负电荷的表面；同时带有疏水 基团和亲水基团的双功能骨架分子；含有对于成核作用的临界位点数目的外延单元。同 时，由于成矿过程是细胞指导和基质参与的，故矿物相可以不断地再生，大多数晶体是在 基质结构中生长的，但某些结构分子也可能结合到晶格之中。 1 1 3 3 矿物的宏观生长是通过许多增长单元的填充与组装而完成的 由细胞分泌所形成的隔室单元或基质，在完成形成矿物的密度及形状之后，分泌过程 将会产生新的单元，矿物的沉析作用处于一个动态的不断更新的运动面之中。在溶液中， 分子问的特殊相互作用如大环配体的主客体相互作用，酶一底物的反应以及抗体抗原偶联 等，都是分子大小、电荷、形状和动力学等的互补性所决定的。 生物矿化过程存在着不同层次的控制作用，向每个隔室中运送成核所需要的分子和离 子是受到隔室内物理化学参数以及外部生化反应的过程，生物能学的调控而最终是受到基 因库的控制，这是一个极其复杂的过程。而主要的难点则集中于有机无机界面。这是由于 界面的性质与界面两侧的体材料有很大的区别，在界面上更易发生化学反应。只有深入了 解界面的几何特征，化学键合，界面的化学缺陷和结构缺陷等，才能在分子水平上去认识 生物矿化过程，从而方可利用晶体工程去模拟生物矿化过程，发展新型的人工晶体。 6 第一章绪论 1 1 4 生物矿化的机理 生物矿化区别于一般矿化的显著特征是，它通过有机大分子和无机物离子在界面处的 相互作用，从分子水平控制无机矿物相的析出，从而使生物矿物具有特殊的多级结构和组 装方式。生物矿化中，由细胞分泌的有机物通过自组装对无机物的形成起模板作用，使无 机矿物具有一定的形状、尺寸、取向和结构。 m a n n 等人认为生物体内矿化过程可以分为四个阶段【2 9 枷l ：超分子预组装，界面分子 识别，化学矢量调节、细胞水平调节和再加工。 1 - 1 4 1 超分子预组装( s u p r a m o l 删l a r p r e o r 窨蚰i z a 6 0 n ) 这一阶段是指在矿物相沉积前构造出一个组织化的反应环境，该环境决定了无机矿物 成核的位置【3 2 】。生物矿化中常用的超分子预组装方法有两种：一种是蛋白质笼和脂类泡囊 的自组装，另一种是扩展的蛋白质一多糖网络的构筑。前者主要用于细胞内生物矿化，后 者则主要用于多细胞生物的细胞外和细胞间生物矿化。 1 1 4 2 界面分子识别( i n t e 嘲d a im o k c l l l a rr e 鲷i n o n ) 在生物矿化的第二个阶段，无机矿物相在已形成的超分子预组装体的控制下，在无机 ，有机界面处自溶液中成核。生物矿化中的界面分子识别可以从有机，无机物界面的结构、 化学环境和空间状态三个方面加以讨论【3 3 】： 1 1 4 2 1 无机生物矿物生长的空间定位与空间约柬洲 有机界面为矿物晶体的定位生长提供了一个有效空间，晶体就在这个有效空间内形 成，同时，它又对晶体生长在空间上的扩展给予约束和限制，从而使得晶体在结构、形态 及尺寸上都得到控制。例如贮铁蛋白是由2 4 个多肽亚单位通过自组装所形成的一个内径 为8 0 a 的球体，它的内部球腔为生物矿化作用提供了一个特定的反应空间【3 5 ，3 6 1 。 1 1 4 2 2 晶体生长的局域化学控制d 刀 理论上，晶体的成核过程必须克服一个从饱和溶液中自发形成固相的活化能垒，即晶 体的戍核活化能。在生物矿化过程中，可以通过降低表面能和增大过饱和度来降低晶体的 成核活化能。晶体生长的局域化学控制主要是指控制有机界面附近的化学微环境，而其中 最主要的环境因素是局域过饱和度，它不仅反映了矿化环境的非平衡态状况，而且还是决 定晶体成核与生长的基本条件。 1 1 4 0 化学矢量调节( t o a ir 荨瑚i a t i 佃) 无机物矿化材料，在不同的位置上可以形成特定的晶型结构。很明显，生物隔室内溶 液的物理化学性质的调节作用是晶体生长、聚集和结构的个重要因素。矿物相通过晶体 7 第一章绪论 生长进行组装得到亚单元，同时形态、大小、取向和结构受到有机分子组装体的控制。这 一阶段通过晶体的生长和终止与矿物相的组装紧密联系起来。生物矿物最为惊人的特性就 是它们所具有的精确的修饰作用。例如，对于同一种生物矿化材料，在不同的位置上可以 形成特定的晶型结构。 1 1 4 4 细胞水平调节和再加工( c d l u h rp m c 髂s i 略) 已形成的矿物核在超分子预级装体的控制下继续生长，在细胞的参与下，形成高级结 构，其中生物矿物被赋予了独特的结构和形态，并产生了复杂的微结构和超微结构。生物 矿化的这一阶段包括了许多构筑过程，这些过程产生了具有复杂的微结构和超微结构的更 为高等的构筑模式。正是在这一级别的构筑模式上，生物材料与人工合成材料存在着明显 的差异。但是令人遗憾的是，这一阶段中所涉及的识别和组织化过程的细节尚不清楚。 1 2 生物矿化的研究进展 1 2 1 仿生合成和生物矿化的研究历史 生物矿化的研究始于上世纪2 0 旬o 年代。德国、丹麦、瑞典的学者用偏光显微镜对生 物矿物进行了系统的观察，人们对生物矿物的形貌已经有了粗浅的认识。5 0 一6 0 年代，西 北欧及美国的学者借助于透射电镜和扫描电镜对生物矿物做了深入的研究并建立了有机 基质的概念。1 9 7 2 年c r e n s h a w 采用e 瑚渔这种温和的去钙化剂来处理双壳类贝壳，使有 机质大分子能较完整地保留下来，开始了生物矿物中有机质的研究。1 9 7 6 年b w e n s t a m 和 w e i n e r 研究发现，在生物矿化过程中“有机基质调制”是决定生物矿化材料的优异性能的 关键，这时人们已经对生物矿化的概念有了初步的认识，开始对生物矿化过程中无机物与 有机物的界面分子识别进行研究。 8 0 年代以来，随着各种微区分析技术的发展，人们利用各种不同的专门仪器，如红外 - 拉曼、穆斯堡尔谱仪、核磁共振、顺磁共振、中子活化等，不仅探明了绝大部分门类的主 要矿体结构和矿物成分，而且将生物矿物的研究提高到细胞生物学、分子生物学乃至生物 无机化学的水平。1 9 8 6 年s t e p h c nm 卸n 等人以卵磷脂( p q 作为有机基质，在其形成的单层 泡囊内产生分立的完美球形或圆盘形磁铁矿晶体，而不存在卵磷脂泡囊时，则在本体溶液 内形成针状的y - f c o o h 和c c f e 0 0 h 沉淀。在生物体内发生的矿化作用，通常是采用泡囊 来形成矿物的隔室化。许多生物体的细胞都是通过细胞膜形成泡囊，然后在泡囊内发生矿 化作用，生成无定形材料和晶体材料。随后在1 9 8 8 年，s t e p h c nm a 仰等人又用阳离子表 面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵( d d a b ) 、介稳态磷酸钙水溶液和长链烷烃的混合物制 8 第一章绪论 各出具有扩展网络微结构的磷酸钙，其中矿化过程的成核反应发生在双连续网络互联的水 的通道中p 。 有机高分子由于稳定性、易修饰性和可加工性，很适合作为矿物或材料沉积的基质。 1 9 9 2 年k a w a g i l c h i 曾报道将n a 2 c 0 3 加入到聚苯乙烯磺酸钠( p s 系列) 和叫n 0 3 ) 2 混合溶液中 恒温搅拌，可以产生球形的c a c 0 3 晶体。同年，m e l d m m f c 等人研究了贮铁蛋白，结果表 明它主要是由2 4 个蛋白质的亚单位有序排列而形成的一个的球状体，贮铁蛋白脱去铁后， 就变为脱铁铁蛋白，脱铁铁蛋白含有一个空腔，该空腔为仿生合成提供了一个特定的空间。 将f e ( i i ) 溶液加入到脱铁铁蛋白溶液中，就会产生大小均匀的、分立的纳米级晶体微粒，每 个微粒被蛋白质壳围绕着，这表明分立的晶体是在特定的脱铁铁蛋白空腔内形成的。1 9 9 3 年s t e p h e nm a n n 所领导的研究组的工作最为出色，他在m o l e c u l a rt e c t o n i c si n b i o m i r i e r a l i z a t i o na i i d b i o r n j m e t i c m a t e r i a l s c h e m i s t r y 一文中详细、系统地讲述了生物矿化 的机理和过程，指出了生物矿化的第二阶段一界面分子识别，认为矿物晶核的装配受到无 机有机界面上静电、结构和立体化学互补性控制。1 9 9 7 年，d e o l i v e i r a 等人在设计合成了 一种基本由灿a 残基组成的以c 【螺旋构象为主的多肽( c b p ) 。在不同的温度下，c b p 有不 同含量的螺旋构象，因此在不同条件下以它为基质生长出的碳酸钙晶体的形貌不一样， 这说明单一的生物分子可以控制无机晶体的形貌，而且生物分子的构象对无机矿物的形貌 有着重要的影响。1 9 9 8 年，d s c h u l e r 和r b f r a i l k e l 等人根据生物控制矿化的原理，在磁 细菌中形成了磁性纳米微粒，这种广泛存在于生命体中的磁性矿物能在十分温和的条件下 在实验室合成出来。一些生物活体组织中的矿物在基因调控下的形成机理的研究取得了进 展，开始从分子生物学的水平上探究诱导生物陶瓷生长的有机金属酶的遗传受控机制【3 9 1 。 2 0 0 0 年，o g a s a w a r a 等人利用动物组织复杂的结构进行了生物模拟材料的合成。在2 0 0 1 年，随着对些蛋白质和酶的结构解析，可以从枯草牙孢杆菌得到2 ，4 二氧四氢喋啶合 成酶( h m a z i l l es y n | l l a s e ) ，它是由6 0 个亚基构成的中空多孔壳状二十面体，s h e n t o n 等人 在氧化铁合成体系中加入这种酶，发现在酶的空腔内部形成了氧化铁纳米粒子，而且粒子 的直径随着所加入铁与酶亚基的摩尔比变化。2 0 0 4 年，德国的m b e i e r 利用钙示踪器揭示 了鱼的内耳石的生物矿化过程中的结晶位点。2 0 0 5 年，f 本的t a d 雏h i 等模拟生物矿化 的过程设计合成出了一系列具有生物活性的骨替代材料f 4 1 】。 综上所述，人们先用两亲分子作为基质模拟研究了生命体系中在脂类泡囊内进行矿化 的机理；由于有机高分子在结构方面与生物矿化过程中所用到的生物高分子具有一定的相 似性，接着又用高分子作为有机基质来模拟生物体内矿化的过程来进一步探讨生物矿化机 9 第一章绪论 理。近来，人们使用了与生物体更接近的生物大分子作为有机基质模拟生物矿化过程，模 拟体内形成的蛋白质笼来指导无机矿物的形成，取得了一定的进展，由此人们对生物矿化 的机理有了比较深入的认识。 1 2 2 我国生物矿化的研究现状 上世纪8 0 年代以来，我国学者也开展了生物矿化方面的研究，并已有专著问世【4 2 | 矧。 崔福斋【删等采用x 射线分析等方法，对象牙从纳米到厘米的分级结构做了详细的研究， 结果表明象牙与人类牙齿的牙本质相似，是由羟基磷灰石晶体和胶原纤维所组成。然而， 由于羟基磷灰石中的钙部分的被镁所取代，从丽导致象牙中钙的化学环境要比羟基磷灰石 晶体中的更复杂。他们还用扫描电镜、透射电镜和x 射线衍射等方法，研究了在硬脂酸单 分子膜下碳酸钙的受控结晶作用1 4 5 1 ，发现当无膜存在时，碳酸八钙( 0 c p ) 晶体以2 0n m 一5 0 柚的微小晶簇混乱地从溶液中析出，且不具有择优取向。邰子厚等人【4 q 在1 9 9 6 年来含成 了一系列新型的两亲配体，它们既具有通常两亲分子的结构特征，又具有配体的化学性质， 只要改变配位基团中杂原子的数目与种类，原则上就可能在气、液界面上形成不同结构类 型的单分子膜，用它不仅可以诱导形成难溶性的矿物，而且也为诱导形成水溶性的无机矿 物开辟了途径。温树林等f 明对生物陶瓷的显微结构特征做了深入的研究后指出，生物陶瓷 的物理化学性质及生物功能，最终取决于它的结构特征，如原子间的键长、键角、空间结 构以及晶体结构的缺陷、位错及晶界等。潘永信f 触】等研究了趋磁细菌磁小体的生物矿化作 用，这对于揭示高级生物体内磁铁矿的形成作用机理具有重要的参考价值。王成毓【删等模 拟了生物矿化过程，原位合成出活性纳米碳酸钙，为指导工业化生产提供了依据。 1 2 3 目前研究存在的问题 生物矿化在仿生材料合成中的应用已取得了令人振奋的成果【5 0 2 1 。但是，由于生物的 多样性和生物矿物形成过程的复杂性，目前得到的材料在其功能上与天然矿化材料相比还 有很大的差距。这就要求我们应当深刻了解结晶条件、过程、界面、结构和功能等多方面 的相互关系，解决仿生材料合成中的一些基本理论问题。近期的研究还表明，生物矿物的 形成受基因的控制f 5 3 】，这也增加了生物矿化研究的难度。 目前对于生物矿化机理的研究存在着以下几个基本问题。第一，目前人们常用的是一 些两亲分子和高分子等非生物大分子作为有机基质，在静态下来模拟生物矿化过程，虽然 这些生物大分子对无机物的矿化有一定的影响，但是它们与生物大分子的差距是很大的， 实验中采用的有机基质的官能团、立体构象和多级结构对无机矿物的形成的关键作用与生 物活体中的矿化过程有很大的差别，因此从生物大分子得到的研究成果很难对生物矿化过 】0 第一章绪论 程有正确的认识。第二，生物体内的矿化过程是一种动态过程，即有机基质的自组装和无 机矿物质的形成是程序受控的，而目前的模拟过程主要是静态的或者是简单受控的。第三， 现在人们对生物矿化机理的研究大多注重有机基质对无机晶体的晶型、外貌等的影响以及 所得到的无机有机复合材料的性能，但是对有机基质和无机晶体之间的界面分子识别的研 究，以及从分子水平上探讨生物矿化的机理、从超分子水平上研究矿物与基质之间相互作 用的本质和规律的研究等却鲜有报道。第四，人们大多仅注意到有机基质对无机矿物的影 响，但对于它们的协同作用却很少考虑，即反过来，无机物对有机基质的结构也有一定的 影响，它们之间的协同作用还受制于蛋白质、酶等生物大分子的立体构象和多级结构的测 定。 1 3 研究动机和主要内容 1 3 1 研究动机 生物组织中的无机盐，如碳酸钙、羟基磷灰石具有多种晶型和复杂的形态，这些无机 盐不仅在结构与支撑上具有惊人的机械性能，并且很多具有独特的生理功能i 州。人们采用 有机质模板法对碳酸钙的结晶进行了生物矿化的摸拟研究，试图使碳酸钙在材料、催化剂、 分离膜、多孔生物医用植入体和药用载体等方面得到应用。碳酸钙在生物体系中广泛存在， 其晶型易于表征，在工业技术中有广泛应用，因而近年来人们常用表面活性剂作有机相， 研究这种两亲分子形成的胶束、微乳、囊泡或l b 膜等有序模板对形成碳酸钙材料晶型、 结构和形貌的影响【5 3 1 。羟基磷狄石【c a 6 ( p 0 4 ) 1 0 ( o h b 简称h a 】在组成成分和结构上与骨骼、 牙齿等一致，具有良好的生物活性和生物相容性。作为植入材料，可引导新骨的生长，为 新骨的形成提供生理支架，并与骨组织形成直接的骨性结合f 5 5 1 。 蛋白质和酶是生命体系的重要组成物质，有着特殊的生物功能。本文选用了碳酸钙和 羟基磷灰石作为无机相，研究了多种蛋白质、酶和高分子与碳酸钙、羟基磷灰石结晶之间 的相互作用，着重讨论了碳酸钙、羟基磷灰石结晶过程对蛋白质、酶的高级结构的影响。 从超分子水平上研究矿物与基质之间相互作用的本质和规律以及有机基质和无机晶体之 问的界面分子识别，试图由模拟体系出发认识生命体系的矿化机理，为仿生合成新型材料 和防治疾病提供依据。 1 - 3 2 研究体系 在我们的研究体系中，选用了存在于生命体系中的生物大分子蛋白质、酶作为基质， 第一章绪论 在动态下模拟生物矿化过程，从分子水平上探讨生物矿化的机理，研究了生物大分子对碳 酸钙、羟基磷灰石结晶的诱导成核和晶体生长的影响以及形成的晶体对有机基质的作用。 根据蛋白质和酶的立体结构、生物功能以及可行的实验条件，我们选择了牛血清白蛋白、 牛血红蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶作为有机基质，这几种蛋白质具有不同的一级结构和高级 结构，在生物体内分别具有不同的功能，而且对生物体都有着非常重要的意义，同时考虑 碳酸钙、羟基磷灰石生物矿物在生物体内分布的广泛性和重要性，我们以它们二者之间的 相互作用为主要研究体系。 有机高分子由于其稳定性、易修饰性和可加工性，使其很适合作为矿物或材料沉积的 基质。而且有机高分子在结构方面与生物矿化作用所得到的生物高分子具有一定的相似 性，因此利用有机高分子作为有机基质进行仿生材料合成具有很好的前景。我们依据生物 矿化的基本原理，通过仿生合成的方法，以四种高分子聚乙二醇、聚乙烯醇、羟乙基纤维 素和聚丙烯酰胺作为有机基质进彳亍了碳酸钙的仿生合成研究，得到了很有意义的结果。 1 3 3 研究内容 在我们的研究工作中，首先用多种测试手段研究基质对难溶钙盐结晶的晶貌、晶型、 结晶位点以及结晶取向的影响规律。同时，把超分子作用的概念引入生物矿化的研究中， 从基质在参加反应前后红外光谱和圆二色谱的变化情况来探讨难溶钙盐结晶对蛋白质、酶 的二级结构影响。最后，我们归纳分析实验结果，从分子水平上探讨生物矿化的机理、从 超分子水平上研究矿物与基质之间相互作用的本质和规律。 1 4 研究方法 1 4 1 实验方法 我们的研究方法有两个特点。第一，我们选用扩散法使难溶钙盐在酶和蛋白质的作用 下结晶，在动态条件下模拟了生物体内矿化的过程，打破了在以往的研究中静态结晶的局 面。使实验体系更接近生物体系。第二，我们采用多种测试手段研究无机物的结晶位点、 有机基质与无机物的界面分子识别以及它们之间的协同作用。比如利用热分析、x 射线粉 末衍射和扫描电子显微镜对实验中生成的难溶钙盐晶体的晶型、形貌进行了表征，利用电 导率测定和红外光谱对有机基质诱导下无机盐结晶的位点进行了分析，同时利用傅立叶变 换红外光谱和圆二色谱对晶体生长过程中的有机无机之间的相互作用进行了动态的跟踪 测试。其中圆二色谱法独具特色，能够定性和定量的分析蛋白质的二级结构，从而为探讨 1 2 苎= 雯堕笙 生物矿化机理提供了有力的证据。 1 4 2 结果处理 目前，测定蛋白质的二级结构，x 射线衍射技术是最准确和可靠的，但它需要获得合 格的晶体，因而该技术的应用不仅工作量大，成功率低( 蛋白质单晶不易获得) ，而且测 定结果不易说明蛋白质在生理状态下结构与功能的关系。通常，测定溶液状态下蛋白质的 结构多用圆二色谱( c i r c u l a r d i c h r o i s m ) 法，简称c d 法。c d 对溶液中蛋白质的立体结构 变化高度灵敏，并且能检测立体化学的微小变化【5 3 l 。而今c d 己成为糖类、多肽、蛋白质、 核酸等化合物结构分析中的一种常规手段。c d 法作为一种光谱学方法，通过结合n m r 、 x 射线衍射及分子模拟等方法，在深入了解生物大分子的空间结构方面，有着巨大的优势 和潜力1 5 8 l 。 傅立叶变换红外光谱法也可以用来测定蛋白质的二级结构，将傅立叶变换红外光谱与 去卷积( d e c o n v o l u t i 伽) 、二阶导数谱( s e c o n dd c r i v a t i v es p e c t n l m ) 和曲线拟合( c u n ，c f i n i n 曲 等数学处理方法结合来研究蛋白质的二级结构。下文分别对这两种测定蛋白质二级结构的 方法进行详细的介绍。 1 4 2 1 圆二色谱 自k e n d r c w 采用x 射线技术，首次揭示肌红蛋白的折叠结构以来，蛋白质的研究从氨 基酸残基序歹0 的测定，深入到空间结构、构象的确定。近年来，人们发现疯牛病、克雅氏 病和震颤病等神经退行性疾病是由p r i o n 病蛋白所致，而构象变化在p r i o n 病蛋白的致病因 素中起着至关重要的作用【5 9 删。这使人们进一步认识到蛋白质的构象对其生理功能的巨大 意义，要深入理解蛋白质的生物活性，就必须了解它的构象及其相关变化。目前，确定蛋 白质构象最准确的方法是x 射线晶体衍射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说， 得到所需的晶体结构较为困难。二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的 构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。相比之下，圆二色( a r c u l 盯 d i c h m i s m ，简称c d ) 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。 1 9 6 9 年，g r e e n f i e l d 最早用c d 光谱数据估计了蛋白质的构象【6 l 】，相关的研究方法陆 续有报道【6 2 棚l 。特别是近十几年来，用远紫外圆二色( f a fu v c d ) 数据分析蛋白质二级结构， 不但在计算方法和拟合程序上有了极大地发展【弛7 9 1 ，而且随着x 射线晶体衍射与核磁共振 技术的提高，越来越多的蛋白质的精确构象得到测定，为c d 数据的拟合提供了更精确的 数据库i 敬瑚甜。研究者还发现用c d 光谱研究蛋白质三级结构具有独特优点，发展了用远紫 外c d 光谱辨认蛋白质三级结构的方法及相关程序f 8 2 1 ；此外，近紫外圆二色r n e a ru v _ c d ) 1 3 第一章绪论 作为一种灵敏的光谱探针，可反映蛋白质中芳香氨基酸残基、二硫键微环境的变化【8 3 1 。c d 光谱技术作为研究溶液状态下蛋白质或多肽构象的一种重要手段，己受到研究者的广泛关 注【8 4 胡7 1 。下面对c d 光谱技术分析蛋白质构象的基本原理、实验技术及其研究进展做一简 介。 1 4 2 1 1 蛋白质的圆二色性及其测量 在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫 桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，活性中心对平面圆偏振光中的左、 右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量 的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。圆二色性的大小常用 摩尔消光系数差p ( m 。1