（农产品加工及贮藏工程专业论文）高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母.pdf

摘要 从来源不同的基质中共分离得到2 2 7 株耐高温酵母菌，经初筛、复筛和酒精 发酵试验，获得一株耐高温且具有一定产酒精能力的酵母菌株h _ 1 ，其在4 2 。c 下 7 2 小时发酵，酒精产率为5 5 。研究了h l 的形态和生理生化特性，结果表明： h 1 菌株产生1 - 4 个土星行子囊孢子，该菌株发酵葡萄糖、蔗糖，弱发酵棉籽糖， 不发酵麦芽糖、半乳糖，乳糖；同化棉籽糖、纤维二糖、木糖、柠檬酸、琥珀酸、 蔗糖，不同化肌醇、核糖、赤藓糖醇、鼠李糖、核糖醇、甘露醇、可溶性淀粉、 阿拉伯糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖；不能同化硝酸盐；可在无维生素培 养基上生长：3 7 下可生长。根据( 9 8 ，在含2 0 淀粉培养基中培养2 4 h ，可获得9 5 ( v v ) 的酒精；在含2 5 淀粉培养基中培养2 4 h ，可获得1 0 2 ( v t v ) 的酒精1 4 ”。泡盛曲霉 ( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) 产生的葡萄糖淀粉酶具有a 1 ，4 和q - 1 ，6 糖苷酶活性，广泛应用于淀 粉的耱化工艺中。王永吉等人f ”1 利用r t - p c r 技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶i 基因， 将其置于酵母菌烯醇酶启动子与终止子之间，构建了表达载体，并转化到酒精酵母 a s 2 1 3 6 4 ，获得了能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株。 1 5 耐高温酵母的耐热特性 高温对酵母细胞也有一定的毒性，温度越高，可引起酵母早衰、死亡，使杂菌占优势。 温度通常会引起酵母细胞内各种成分，如脂肪酸，磷脂，麦角周醇等的变化。 1 5 1 脂肪酸组成的变化与酵母菌耐热性的关系 高温通常引起了膜流动性的变化，酵母通过改变它的脂肪酸的组成来适应这一变化。 温度越高，酵母细胞膜内的饱和脂肪酸更多，比如油酸、亚油酸、亚麻酸等含不饱和酰基 链的脂肪酸减少，而棕榈酸，棕榈油酸等饱和脂肪酸的含量则增加。 m s u u t a r i 等人通过研究发现，酵母包含了3 - 5 种类型的脂肪酸，占全部脂肪酸的9 0 以上。主要的脂肪酸是棕搁酸( 1 6 ：0 ) ，棕榈油酸( 1 6 ：1 ) ，油酸( 1 8 ：1 ) 。亚油酸( 1 8 ：2 ) 和亚麻酸( 1 8 ：3 ) 。棕榈酸是目前所研究的菌株中唯一一种重要的饱和脂肪酸。随着生长温 度的上升，棕榈酸的相对含量呈上升趋势。在c o l e o p h i a ，cu t i l i s 。l s t a r k e y i 和s , c e r e v i s i a e 菌株中，随温度的下降，棕榈酸的绝对含量上升。油酸是目前所研究过的菌株中唯一的不 饱和脂肪酸。由温度导致的油酸比例的变化因种的不同而有差异。在三s t a r k e y i 中，油酸 的相对和绝对含量随温度的下降而上升。在c u t i l i s 和上s t a r k e y i 中，亚麻酸的绝对和相对 含量在低温( 2 0 ) 下是恒定的，但随温度的进一步上升而降低。在c u t i l i s 中，随着亚 麻酸含量的减少，亚油酸的含量增加。在r t o r u l o i d e s 中，亚麻酸很明显被亚油酸所代替， 当用相对脂肪酸含量来表示时，随着温度的上升。油酸的含量减少。 4 4 1 s u u t a r i 等人研究了几株酵母随温度变化的情况，随温度的上升，有的酵母脂肪酸链的 平均长度增加了，有的酵母脂肪酸的不饱和程度上升了，有的酵母则两种情况都发生。使 用一些如亚麻籽油，芥茉油之类的油，以及从这些油中提取出来的脂肪酸可以减轻酒精或 温度对酵母细胞膜的损害。 4 4 1 1 5 2 磷脂与酵母耐热性的关系 6 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 表1温度的上升对细胞和膜的磷腊蛋白的比率的影响 高温通常引起膜磷脂数量的减少以维持细胞活性的最适膜流动性这可能是细胞适 应反应的一部分。b e n s c h o t e r 和i n g r a i n 于1 9 8 6 年发现产酒精的细菌z y m o n o n a s m o b i t i s 也 表现出类似的膜的变化。 细胞在不同温度下的生长会导致磷脂含量磷脂，蛋白的比率发生变化( 表1 ) 。膜片段 中的脂类蛋自比率从2 0 0 时含5 6 0 l lg 磷脂，g 膜蛋白降到4 1 含2 7 0ug 磷脂，g 膜蛋白。 生长在4 1 的细胞中每克分子蛋白中所含的磷脂数最大约为3 0 c 时所含磷脂数量的6 0 。 【4s 1 表2 显示了温度的增长对磷脂组成的影响。双磷脂酰甘油( 包括痕量的磷脂酸) 和磷 脂酰胆碱的比例随温度的上升而增加，而磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺的含量随温度的上升 而下降。 表2 生长温度对磷脂组成的影响 生长温度磷脂含量 g r o w t ht e m p e r a t u r e ! ! ! 业! ! ! ! ! ! 里p 塑! ! ! ! ! ! 堑! ( )c l p gp ep c 缩写 fl 职碱脂酰甘汕 p e ：哦脂酰乙肿胺 p o 磷脂酰甘油 p c - 磷脂酰胆碱 7 2 o j t 1 拍” 4 o 8 4 9 o 0 2 5 6 5 4 田一6 8”， 8 9 7仉 m o 0 7 i 4 河e 农业大学硕士学位论文 1 5 3 麦角固醇与酵母耐热能力的关系 k a z c c y o s h io h t a 等人发现。当温度从4 0 上升到5 0 c 时，细胞中甾醇( 尤其是麦角固 醇) 的含量上升。随后，他们又发现一株缺乏麦角固醇的h p o l y m o r p h a c k - l 突变株在4 0 一5 0 的生长速率比它的野生型菌株慢，并且，在5 0 。c 时，当这株突变株生长在含有麦角周醇 软磷脂的乳浊液中时，它可以结合麦角固醇，提高生产速率。 1 6 原生质体融合的研究现状 原生质体融合技术已广泛应用于工业用酵母菌株的优良性状改造“47 ”l 。例如c h i 等虬利用原生质体融合技术使酵母菌株w y 2 和酿酒酵母1 2 0 0 ( s a c c h a r o m y e e ss p t 2 0 0 ) 的细胞融合，与亲本相比得到四倍体菌株c 4 能明显提高发酵速度。目前，实现淀粉原 料直接发酵生产酒精是酒精发酵工业需要迫切解决的问题m5 “5 ”。酵母糖化酶基因的表 达受多种基因的调控，因此很难分离到与之相适应的基因产物。用原生质体融合技术进行 糖化酵母育种则显现出了更大的优势。通过遗传物质重组，可选育出具有淀粉糖化酶活性 的酵母新菌株或进一步改良亲本菌株，实现淀粉直接发酵成酒精的步生产法。目前国 内外已通过此方法实现了酿酒酵母( 只c e r e v i s i a e ) 和其他酵母菌或霉菌种间或属间的融合。 庞小燕等人p ”以酿酒酵母( 曼c e r e v i s i a e ) 和热带假丝酵母( ct r o p i c a l i s ) 为亲本，通过单亲 灭活，进行属间原生质体融合技术。获得了既具有糖化酶活性又高产酒精的融合株，在 定量的淀粉培养基中发酵，酒精产量可达1 1 5 ( v v ) 。黎碧莲等人15 4 l 在酿酒酵母( s c e r e v i s i a e ) 9 1 1 扣囊拟内孢霉( e n d o m y c o p s i sf i b n l i g e r a ) 属问的融合产物中获得两株融台子 p 5 0 l 和p 5 1 9 ，并进行了术薯粉耱化醪发酵试验，酒精产量可达6 9 ( v v ) 和7 7 ( v v ) 。 王建玲等人p q 利用p e g 诱导原生质体融合技术，进行糖化酵母单倍体和耐高温酒精酵母 单倍体的同型原生质体融合，培育出既有较强的糊精利用能力，又耐高温和高产酒精的融 合子，使用该菌发酵可减少4 0 的糖化酶用餐。 另外，采用原生质体融合技术也有利于扩大酒精酵母可利用底物的范围和特殊性状的 改良。f a r a h n a k i s 6 乖j 用原生质体融台技术，构建了脆壁克鲁维酵母( k ，一a g i l i s ) 犁i 酿酒酵 母( c e r e v i s i a e ) 的融合子，能在乳清中利用乳糖生产酒精，最终产量达到13 ( v v ) 。 清酒酵母( s s a k e ) y a k e 具有能耐高达2 2 ( v v ) 酒精的特性，而k 氏酵母( s k ek ) 具有较好的发酵能力。侯红漫将清酒酵母y a k e 与k 氏酵母融合，选育出产酒精量高而 且耐酒精力强的融合子，酒精产量为7 4 ( v f v ) ，酒糟耐量为1 5 ( v v ) 。l e g m a n n 5 8 1 将 酿酒酵母( c e r e v i s i a e ) 和能耐4 0 以上葡萄糖的蜜蜂酵母( m e l l i s ) 作为亲株进行原 生质体融合，提高了酿酒酵母的葡萄糖耐眭。在3 5 的葡萄糖培养基中产酒精的速度为亲 株的3 倍和7 倍，最终产量也有大幅度的提高，融台株可产生13 6 ( v v ) 的酒精，而酿 酒酵母( sc e r e v i s i a e ) 和蜜蜂酵母( sm e l l i s ) 只能产生9 ( v v ) 和4 ( v v ) 的酒精。 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 1 7 小结 目前，酒精酵母育种技术主要有以下三个发展趋势：( 1 ) 培育出能直接利用淀粉或纤 维素进行酒精发酵的新菌株。( 2 ) 培育能在高温( 4 0 ) 下发酵的新菌株，以适应南方 和北方夏天高温酷暑条件的生产要求。( 3 ) 培育产量高且耐高浓度酒精的酵母菌株，通过 对高产酒精酵母被抑制生长的酒精浓度来定义酒精酵母耐受性并结合酒精的产量来评价高 产酒精酵母性能。 近年来，由于高产要求和气候变暖，研究和应用耐高温酒精酵母已受到人们的广泛重 视，成为当前国内外酒精行业研究的热点。目前，工业上乙醇的发酵生产主要是利用酵母 菌的活动。 生产过程中，酒精发酵和其他发酵生产一样，需要适当的温度。温度的变化将导致微 生物生长和繁殖速度的改变以及微生物酶活性的变化，进而影响产品质量和产量。外部环 境温度的升高和微生物自身代谢放出的热量，会导致发酵温度升高，影响酒精和其他发酵 工业的生产。口9 】例如很多热带国家( 如印度) 和我国南方地区、盛夏的北方，气温常达到 4 0 c 以上( 甚至4 5 5 0 c ) ，这将严重抑制酵母菌的生长、代谢和酒精产量；酒精发酵过程 如果没有冷却系统，代谢反应放热可使温度提高，甚至上升1 l 之多。【6 0 1 通常情况下发酵 罐的温度上升到4 0 c 以上时，将导致酒精产量下降。酒精发酵的实际生产过程中，人们通 过向发酵罐壁上喷洒冷水来达到降温的目的，这势必增加生产的成本。因此，耐热的酵母 菌种的分离选育将给工业发酵( 如单细胞蛋白生产，啤酒酵母的生产，药用酵母和酒精的 生产) 提供高温下正常生产的优良菌株。同时，耐热酵母菌株在饲料酵母，酒精和面包酵 母的生产中仍有广泛的应用。1 6 1 人们一般认为能在4 0 6 c 以上生长的酵母是耐热的。现在已经有报道，s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 突变体的最大生长温度为3 3 3 5 c 。6 3 j 还有报道，一些属于k l u y v e r o m y c p 。属 的耐热酵母可以在4 0 。c 以上生产酒精，晟大生长温度为4 9 【6 4 1 ，有的甚至达到了5 2 c 1 6 5 1 。 根据w a t s o n 的准则”，它们被划分为嗜热型酵母。 目前国内较有代表性的耐高温酵母主要是沈睿的y h 4 6 ”，蒋亚平的w v h y 8 6 8 1 ，宜昌 酵母基地的y y 和w y ，北京酒精厂的8 0 1 4 2 8 和寇运同的h t y 。国外的研究主要集中在 东南理和日本。这些酵母一般在3 8 - 4 0 c 还保存有较高的酒精产率，他们的应用给企业带 来了可观的经济效益。【6 9 1 综上所述，选用耐高温高产酒精的酵母，对酒精工业有重要的现实意义，这将在不增 加任何设备的前提下提高发酵罐的生产能力，降低发酵和蒸馏成本。有鉴于此，本项研 究旨在：( 1 ) 筛选、融合出适用于高温发酵的新菌种，降低生产成本；( 2 ) 采用原生质体 融合技术，构建耐高温高产酒精酵母。为此，本课题将从以下几方面进行研究： ( 1 ) 从来源不同基质中分离耐高温酵母菌，从中筛选出性状较好的耐高温酵母菌株，对其进 行鉴定： ( 2 ) 将筛选出的耐高温酵母与高产酒精但不耐高温的酵母进行原生质体融合，从融合子中筛 选出耐高温高产酒精酵母。 ( 3 ) 研究耐高温高产酒精酵母融合子的生长和发酵特性，并对其酒精发酵的工艺，采用正交 实验进行优化，确定最佳发酵工艺条件。 9 河北农业大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 材料与方法 2 1 1 酵母菌分离源 污水酒液腐败桃罐头汁大曲酱油坯、醋坯各种腐败水果土壤 2 1 2 试验菌种及来源 亲本：h 1 ；分离于酒曲；s p 4 8 ：取自河北农业大学食品科技学院生物工程系实验室，3 0 产酒精率为1 6 9 ( v v ) ，5 0 c 基本不生长。 以上两种菌现保存于河北农业大学食品科技学院生物工程系 酒精用a d y ：市售的中国哈尔滨市福康酒类催化剂厂产的强力生香耐高温酵母a d y ，活 化分离后。移至斜面保存，试验均采用斜面菌种。 2 1 3 培养基 ( 1 ) 富集培养基：麦芽汁( 1 0 b r i x ) 。 ( 2 ) 分离培养基：麦芽汁( 1 0 b r i x ) ；y p d 培养基( 葡萄糖2 0 9 、蛋白胨2 0 9 、酵母浸膏1 0 9 、 水1 0 0 0 m 1 ) 。 ( 3 ) 初筛培养基： t t c 上层培养基：t t c 0 0 5 9 、水1 0 0 0 m l ； t t c 下层培养基：y p d 琼脂。 ( 4 ) 复筛培养基：加杜氏小管的y p d 培养基；玉米面培养基。 ( 5 ) 酵母保藏用培养基：y p d 琼脂用培养基。分离出的菌种保存在y p d 琼脂培养基试管 斜面上，每隔两个月转接一次。 ( 6 ) 酵母菌鉴定培养基；培养基配方及其配制，参考t h ey e a s t ) ) 1 6 和常见与常用真菌 a 生理生化基础培养基，见附录a b 产子囊孢子培养基： 酵母膏3 9 、麦芽汁3 9 、蛋白胨5 9 、葡萄糖1 0 9 、水1 0 0 0 m l 。上述培养基于1 2 1 灭菌 2 0 m i n 作斜面。 c 路格氏( l u 9 0 1 ) 碘液的配制：2 9 碘化钾溶于2 0 m l 水中，加碘l g ，待碘溶解后，再加水 使总体积达3 0 0 m l 。 e 生化鉴定碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、棉子糖、纤维二糖、肌醇、 核糖、赤藓糖醇、鼠李糖、木糖、核糖醇、柠檬酸、琥珀酸、甘露醇、可溶性淀粉、 阿拉伯糖、海澡糖。均为分析纯。 o 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 ( 7 ) 融合培养基及试剂： a 再生培养基y e p d s 固体培养基：葡萄糖2 0 9 、蛋白胨2 0 9 、酵母浸膏1 0 9 、水1 0 0 0 m l 、 k c l 5 2 5 9 。 b 缓冲液：柠檬酸溶液：柠檬酸1 0 5g 、水5 0 0 m l ； n a 2 h p 0 4 溶液：n a 2 h p 0 4 7 1 6 2 8 9 、水1 0 0 0 m i 蒋生缓冲液：柠檬酸溶液3 3 9 m l 、n a 2 h p 0 4 溶液6 6 1 m h 高渗缓冲液：柠檬酸溶液3 3 9 m l 、n a 2 h p 0 4 溶液6 6 l m l 、k c l 5 2 1 8 9 。 c p e g 溶液：4 0 的p e g - - 6 0 0 0 称2 0 9 、o 6 m o l l 的k c l 7 4 5 5 、o 0 4 m o l l 的c a c l 2 5 0 m l d 生理盐水：0 7 n a c l 溶液。 e 巯基乙醇( 现配) ：0 2 m lb 巯基乙醇、1 0 0 m l0 7 生理盐水，用细菌过滤器过滤。 f 蜗牛酶( 现配) ：1 5 9 蜗牛酶、高渗缓冲液1 0 0 0 m l ，用细菌过滤器过滤。 2 1 4 主要仪器设备 l r h 2 5 0 a 型生化培养箱，广东省医疗器械厂： d l - c j 2 n 医用型洁净工作台，哈尔滨东联电子技术开发公司； y x o s g 4 6 - 2 8 0 s 不锈钢手提压力灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂 b i o f 一2 0 0 0 型1 0 l 发酵罐，上海高机实业总公司 h z q q x 全温震荡器，哈尔滨东联电子技术开发公司； p h h j 0 13 型p h 计，北京海淀航天计算机公司： 7 5 6 b 型分光光度剂，上海第三分析仪器厂； o m p 2 0 0 a 型分析天平，上海第二天平仪器厂： o l y m u p u s 显微镜，o l y m u p u sc o l t d ： m o t i c a e 3 1 显微摄影用倒置显微镜，m o t l cc h i n a g r o u p c o l t d ： 酒精蒸馏设备、酒精比重计、w 1 o 一8 0 型手持折光仪、细菌过滤器等。 2 2 方法 2 2 1 酵母分离样品的采集 从各个基质中采用随机取样原则收集样品，装入灭菌纸袋中，储存于冰箱中备用。 222 酵母菌的分离 菌种分离方法：取适量样品分别加入到已灭菌的y p d 培养基中，5 0o c 培养2 4 h ，镜检， 柏无活菌存在，若有则取l m i 接入y p d 固体平皿中，5 0 培养2 4 h ，待长出菌落后，选择 具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进步划线分离2 - 3 次，经镜检为纯种后分别转入y p d 吲体斜面，低温保存。 河北农业大学硕士学位论文 2 2 3 酵母菌的筛选 ( 1 ) 酵母菌一级筛 t t c 法：在一定培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层t t c 显色剂后会显现不同的颜 色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。将分离得到的各菌株接入y p d 固 体培养基中。初筛出显色较深、性状良好的菌株。试验重复三次。 ( 2 ) 酵母菌的二级筛 将酵母菌分别接入带有杜氏小管的不同的y p d 液体试管中，放入不同的温度下培养， 分别在1 2 、2 4 和4 8 h 观察杜氏小管中产气情况。试验重复三次。 ( 3 ) 酵母菌的三级筛 玉米面发酵法：把二级筛选出的菌株话化后，在y p d 液体培养基中增菌，使活菌浓度 达到1 0 8 个m l ，接入装有经液化、糖化的玉米面发酵液三角瓶中，于4 2 c 发酵3 天，三天 后测酒精产量，并对发酵液进行分析( 可溶性固形物，酒精度，还原糖) 。复筛得到性状较 为优良的菌株。试验重复三次。 2 3 酵母菌的鉴定 酵母鉴定方法参考( ( t h ey e a s t ：at a x o n o m i cs t u d y ) ) ( 第三版) ”j 。 2 3 1 形态与培养特征： 将菌种接种到y p d 液体培养基中，2 5 c 培养3 7 d ，观察是否发酵、培养液是否混浊， 是否形成环或岛，是否有沉淀及沉淀松紧状况并制成东浸片于显徽镜下观察，记录酵母 的无性繁殖方式与细胞的形状，以目镜测微尺测其营养细胞大小。将酵母在y p d 琼脂培养 基上划线，于2 5 培养3 4 d ，观察其菌落形态。 ( 1 ) 酵母假菌丝的观察： 将菌株活化后。在y p d 琼脂培养基上划线接种，2 5 * ( 2 培养2 4 d ，用接种环挑取少许，用 载玻片进行观察假菌丝的形态。 ( 2 ) 酵母菌子囊孢子的观察： 在接种到生孢培养基之前菌株在y p d 培养基上，2 5 c 重新培养1 2 d ，进行活化。将 已活化好的酵母在产孢子培养基斜面上划线，2 5 c 培养3 d ，镜检是否有子囊孢子。凡未见 孢子的在2 5 。c 左右保持4 6 周，每周再检查是否出现子囊孢子。注意观察子囊形成前是 否有接合现象，子囊和子囊孢子的形状，每一子囊内孢子的数目，孢子是否有颜色。 2 _ 3 2 生理生化试验 a 发酵糖类试验：鉴定所需发酵碳源为葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、棉籽糖、乳糖和蔗糖。 将一定量的上述糖经过滤( 0 2 0um ) 除苗，分别加入到含有杜氏发酵管的氮源基础培 养基中。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中，2 5 条件下培养，每隔2 d 观察发 酵情况，连续观察2 周，四周后再观察一次，每次观察时注意杜氏小管中c 0 2 的量， 2 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 以及出现的速度，判断发酵情况。以杜氏小管中有气泡计为阳性，无气泡为阴性。重 复三次。 隆同化碳源试验：鉴定所需同化物质共十八种，为半乳糖、棉籽糖、赤藓糖醇、蔗糖、 i 口溶性淀粉、核糖醇、麦芽糖、d 一水糖、d 甘露糖醇、纤维二糖、l 阿拉伯糖、琥珀 酸、海凛糖、d 核糖、柠檬酸、乳糖、l 一鼠李糖和肌醇。将一定量的上述糖经过滤( o 2 0 l j m ) 除菌。分别加入到氮源基础培养基( y n b ) 中。以含y n b 而不舍碳源的试管作 为空白对_ i 。酵母菌经活化后分别接入到上述培养基中。3 0 0 条件下培养分别在1 、2 和第3 周观察，咀试管中出现混浊计为阳性，否则为阴性。重复三次，以不加糖的培 养基为对照。结果观察标准：将已培养数天的试管于混合振荡器摇动，使内容物充分 均匀。在一张自纸卡片上划一条约3 4 r a m 宽的线，将卡片紧靠试管，直对自然光观察， 如果管中溶液的混浊度完全将线掩盖，即此结果为+ + + ：如果透过试管中溶液仅能看到 不连续的线段，则记为+ + ；如果能看到不连续线段的清晰边缘，则记为+ ：如果溶液非 常澄清，记为一，表示未有酵母生长。 c 同化氮源：同化的氨源有硝酸钾。该试验主要考察酵母菌在分别以硝酸钾为唯一氮源 b , j 的生长情况，向碳源基础培养基中加入硝酸钾，加入量为o 0 7 8 ( w w ) ，1 2 1 灭菌 2 0 m i n 。试验重复三次t 以不加硝酸钾的培养基为对照。结果观察标准同碳源同化测试。 浊麈为+ + 或+ 十+ 则为能生长。 ， d 无维生素生长测试：将无维生素液体培养基经过滤( o 2 0 um ) 除菌，无菌操作接种已 活化好的酵母菌，3 0 ( 2 培养7 d 观察，为避免由于接种而混入的微量维生素而引起的误 差，可将已培养7 d 的初始培养液作为酵母的活化液，取少量接种到另一无维生素培养 基试管中，3 0 。c 培养7 d 后观察结果。结果观察标准如碳源同化测试，如果试管中溶液 j 蔗现+ + ，则说明该酵母具有合成生长所需的维生素的能力；若为+ ，则说明无此能力。 2 4 酵母菌的融合 241 遗传标记的选择 ( 1 ) 药物标记的筛选 选择几种杀真菌剂对酿酒酵母s p - 4 8 和h 1 进行测试，选择种药物对酿酒酵母s p 4 8 有抑制作用而对h - l 酵母没有抑制作用。 ( 2 ) 菌株条件致死缺陷型标记的选择： 取酵母h - 1 的原生质体液( 浓度为5 1 0 6 个m 1 ) ，倒入无菌的培养皿中，于2 0 w 紫外 灯f 保持3 0 c m 的垂直距离照射不同的时间。照射完毕，涂y e p d s 平板。同时在照射前厉 驭原生质体悬液涂布高渗y e p d 平板，在3 0 c t 培养3 天观察存活情况，并计算致死率。 致死率2 ( 照射前的菌数一照射后的菌数) 照射前的菌数 2 4 2 原生质体的制备 ( 】) 菌种培养：将酵母菌s p 4 8 和h - 1 酵母活化转接新鲜斜面自新鲜斜面分别挑取一环s p 4 8 河北农业大学硕士学位论文 酵母和h 1 酵母转接入2 5 m l 完全培养基中，3 0 c 振荡培养1 6 h ( 2 ) 收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液5 m l ，3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，弃上清液 柠檬酸磷酸缓冲液洗两次，收集菌泥 ( 3 ) 预处理：取5 m 1 0 2 1 3 一巯基乙醇p b 缓冲液于装有酵母泥的离心管中，3 0 c 保温1 0 m i n ， 以3 0 0 0 转分离心1 0 r a i n ，倾去上清液 f 4 ) 去壁：在装有处理过的s p - - 4 8 ，h 1 酵母菌泥的两只离心管中，分别加入5 m l1 5 蜗牛 酶p b 溶液置3 0 c 水浴中，s p 一4 8 酵母处理o 5 h ，h 一1 酵母处理1 5 h ，取样镜检，当8 0 以上 的细胞转变为原生质体时，2 5 0 0 d m i n 离心1 0 m i n ，用p b 液离心洗涤，洗去酶液，加入4 m t 高渗p b 液制成1 0 6 m l 以上的原生质体液，测定形成率。 原生质体形成率= ( 酶解前菌落计数一未形成原生质体菌数) 酶解前菌落计数x1 0 0 2 4 3 原生质体再生率测定 将制备的原生质体进行稀释，各取l m l 原生质体液用p b 高渗液稀释后涂布在高渗完全 培养基( y e p d s ) 和完全培养基( y e p d ) 3 0 c 培养3 天计算菌落数，酶解前的菌液直接用无 菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。计算每种菌的原生质体再生率。 原生质体再生率( ) = ( 再生培养基平板上总菌落数一经酶及低渗处理后剩余菌数) ， 原生质体数x 1 0 0 2 4 4 原生质体的融合 ( 1 ) 将h - 1 酵母的原生质体用紫外线灭活2 分钟，在黑暗中保存2 0 分钟，2 5 0 0 r a d m i n 离心 1 0 m i n 。用2 m l 高缓冲液悬浮。 ( 2 ) 将两菌的原生质体悬浮液混合，离心，向沉淀中加入3 m l p e g - c a c i z , 振荡均匀，3 0 c 处理 2 0 r a i n ，镜检并观察融合情况。 ( 3 ) 用高渗缓冲液洗涤菌体沉淀，2 5 0 0 转m i n 离心1 0 m i n 。 ( 4 ) 立即用高渗缓冲液稀释，取融合原菌液及l o 。1 稀释液各o 1 m l 菌液，涂布于再生培养基平 板i - 。 2 4 5 融合子的检出 将融合液涂布在加有o 0 1 的三唑酮和青霉素( 1 0 0 i u ，m 1 ) 的再生培养基上，3 0 进行培 养2 天，测定其融合率。 融合率= 融合子数完全培养基平板上原生质体数x1 0 0 观察比较两亲株和融合予的细胞形态。将再生培养基上长的菌落与两亲本比较，影印接种 三代，以淘汰异核体。 2 4 6 融合子的初筛 将再生培养基上长出的菌落经t t c 法筛选后，将颜色较深的菌落转接到带有杜氏小管 的麦芽汁中，观察产气情况。 童星壁堡盟坌塞鳖塞墨堕生堕苎壁鱼塑垄型查塑量兰塑堕壁篓 2 4 7 融合子的复筛 对经初筛得到的融合子进行酒精发酵宴验，比较酒精产量。 2 4 8 融合子的初步鉴定 观察比较两亲株和融合子的细胞形态。并测其细胞体积。 v = 4 3 a 2 x ( b 2 ) 2( a 为长轴g m ，b 为短轴m ) 2 4 9 融合子的稳定性试验 将融合子传代二十次后，测定融合子韵酒精产率，确定其遗传性状的稳定性。 2 5 融合子基本生理特性的研究 ( 1 ) 最适生长温度的测定：将融合子以相同接种量接入y p d 液体培养基中，分别在不同 温度下恒温培养2 4 h ，镜检计数确定晟适生长温度。 ( 2 ) 最适生长p h 的测定：将融合子以相同接种量接入不同p h 值的y p d 液体培养基中， 于于不同生长温度p h 值下最适生长温度下恒温培养2 4 h ，镜检计数确定最适生长口h 值。 ( 3 ) 生长曲线的测定：将筛选出的酵母融合子以相同接种量接种到y p d 液体培养基中， 分别于不同生长温度、p h 值下、2 0 0 r t m i n 的摇床上培养，每隔2 h 取一次样。利用分光光 度计，在波长6 6 0 n m ，以没有菌体的y p d 液体培养基做空白，比色皿厚度为o 5 c m ，测定 培养液的o d 值。 ( 4 ) 最适发酵温度的确定：将酵母融合子的菌液以相同接种量接种到玉米面糖化醪中，在 不同的温度下恒温培养7 2 h ，称二氧化碳失重，依据失重的大小确定最适生长温度。 ( 5 ) 最适发酵p h 的确定：将酵母融合子的苗液以相同接种量接种到不同p h 值的玉米面 糖化醪中，于最适生长温度下恒温培养7 2 h ，称二氧化碳失重，依据失重的大小确定晟适 生长d h 。 ( 6 ) 发酵曲线的测定：将酵母融合子的菌液以相同接种量接种到玉米面培养基中，分别于 不同生长温度、p h 值下、2 0 0 r m i n 的摇床上培养培养9 6 h ，每隔1 2 h 称量一次，计算二氧 化碳失重。 ( 7 ) 融合子的耐酒精特性：杜氏小管注满培养基后倒置于盛满y p d 的试管中。灭菌后加 入不等量的无水乙醇，制成不同的浓度梯度，接种待测菌株于3 0 的条件下培养。十小时 后测定细胞死亡率。 ( 8 ) 融合子的耐酸碱特性：将融合子以相同接种量接入不同p h 值的y p d 培养基中，于 最适生长温度卜恒温培养2 4 h ，于6 6 0 n m 下测定o d 值，依据o d 值确定在不同p h 值下 的生长情况，并观察产气情况。 ( 9 ) 融合子的耐糖特性：将融合予以相同接种量接入不同葡萄糖浓度的y p d 培养基中， 于展适生长温度f 恒温培养2 4 h ，于6 6 0 n m 下测定o d 值，依据o d 值确定在不同糖浓度 下的生长睛况，井观察产气情况。 河北农业大学硕士学位论文 ( 1 0 ) 融合子的耐盐特性：将融合子以相同接种量接入不同食盐浓度的y p d 培养基中，于 最适生长温度下恒温培养2 4 h ，干6 6 0 n m 下测定o d 值，依据o d 值确定在不同盐浓度下 的生长情况，并观察产气情况。 ( 11 ) 融合子耐发酵副产物的特性：将融合子以相同接种量接入不同乙酸、乳酸和甘油浓 度的培养基中，于最适生长温度下恒温培养2 4 h ，镜检计数确定在不同副产物浓度下的生 长情况。 ( 1 2 ) 酵母细胞数与存活率的测定；采用血球计数板和次甲基蓝染色法，测定发酵液中的 酵母菌细胞数与存活率。 ( i 3 ) 发酵力的测定：采用二氧化碳失重法。 1 4 ) 还原糖的测定：采用赢接滴定法。 ( 1 5 ) 酒精度的测定：取成熟发酵醪1 0 0 m l 加入1 0 0 m l 蒸馏水，混匀后用常法蒸馏，收集 l o o m l 馏出液，用酒精计法测定酒精度，同时测出馏出液温度，换算成2 0 c 的酒精度( v v ) 。 2 6 融合子发酵工艺的正交试验 2 6 1q 淀粉酶用量试验 发酵工艺流程为： 斜面接种 l 接种 y p d 液体培养基一一酒母培养 接种 玉米粉一搅拌一低温蒸煮液化、糖化一发酵一成熟醪液一蒸馏一酒精 取1 2 5 9 玉米粉，加入2 5 0 克g 水，糊化时分别加入不同用量的d 一淀粉酶( o 0 5 9 、o 1 9 、 o 2 9 、0 3 9 、o 4 9 、0 5 9 ) ，糊化3 0 m i n ，测定折光率，找到最佳淀粉酶用量；取1 2 5 9 玉米 粉，加入2 5 0 9 水，糊化时最佳剂量的淀粉酶，糊化不同的时间( 1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、 3 0 m i n 、4 0 r a i n 、5 0 m i n 、6 0 r a i n ) ，测定折光率，找到最佳淀粉酶作用时间。 2 6 2 融合子l z 一3 酒精发酵工艺优化试验 通过预试验和革因子试验，确定正交试验的不同因素和水平。本试验设不同料水比 ( a ) 、糖化酶用量( b ) 、初始p h 值( c ) 和接种量( d ) 四个因子，每个因子设三个水平， 进行酒精发酵，寻找酒精发酵的最佳工艺条件。试验用l 9 ( 3 ) 4 正交表安排设计。试验因子 水平对照表如表3 ，l 9 ( 3 ) 4 试验方案见表4 。 表3 因子水平对照表 l 查士 垒! 型垄些! 堡! 堡些堕旦量! ! 盥! 曼! 垫塑堕笪! 一 百玛要再喜瓦f t 7n n1e 1 一 1 1 ：33 0 045 6 注：接种量3 “、6 、9 对应的发酵最初葫数分剐为每毫升糖化薛啦有的菌数为4 x 1 0 7 个向】、8 1 0 2 - ? - m 1 、1 2 x l o t 十m l 。 6 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 表4b ( 3 ) 4 试验方案 在2 0 0 m l 盛有糖化后玉米粉的三角瓶中，按正交试验的最佳条件将扩培后的种子接入 糖化醪中，前2 4 h 摇床培养，后4 8 h 静置发酵测酒精产奎。 河北农业火学硕士学位论文 3 i 酵母菌的分离 3 结果与分析 从不同地区不同地点共采集样品3 0 份，从中共分离得到酵母菌2 2 7 株，其中来自污水 的酵母5 株：来自酒液的酵母3 6 株：来自腐败桃罐头汁的酵母1 5 株；来自酒曲的酵母1 0 5 株：来自酱坯、醋坯的酵母3 0 株；来自各种腐败水果的酵母2 9 株；来自土壤7 株。分离 酵母结果见表5 。 表5 酵母蓖分离结果 从分离到的酵母菌株数量可看出，各种腐败水果中酵母数量较多，分离到能耐5 0 。c 高 温的菌株也多；酒曲中菌项复杂，含有的微生物种类也较多，但分离到的能耐5 0 c 高温的 菌株较少。 3 2 酵母菌的筛选 3 2 1 酵母菌的一级筛 t t c ( 2 ，3 ，5 一氯化苯基四氮唑) 是种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应， 通过它可以判断酵母中呼吸晦活力的大小，即酵母产酒精能力的高低”“。将2 2 7 株酵母用 灭菌的牙签分别接种于y p d 固体培养基中，每个平板接2 旷3 0 个，于4 5 培养，待长出 菌落后t 倒入配好的t t c 溶液，覆盖菌落，4 5 c 再继续培养，注意及时观察菌落的颜色变 化，比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力，从每 一平板中记下颜色较深的1 2 株菌，作为二级筛的出发菌株，共得到1 5 株酵母菌。 3 2 2 酵母菌二级筛 一级筛得到1 5 株性状较好的菌株，进行二级筛试验，重复三次，其产气结果见表6 。 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 表6 二级筛的产气结果 注：撤挺杜氏小管中产气多少分为5 个等级 a “+ + 十+ ”表示杜氏小管中充满气体： b “+ + + ”裹示桂氏小管中充满3 1 4 气体； c “+ ”表示杜氏小管中充满l 2 气体： d “+ ” 表示丰十氏小管中充满i 4 气体 e “ ” 表示礼氐小管中没有气体。 河北农业大学硕士学位论文 其中编号为c 、e 、h - 1 、y 、5 5 、8 9 、9 6 、1 1 5 、1 4 5 的菌株在4 2 6 c 的高温条件下产 气较多，且能忍受5 0 的高温可以作为三级筛的出发菌株。从菌株来源分析，c 、e 、h - i 、 i i i 、6 6 、8 9 、9 6 来自酒厂的大曲：y 、二十、5 5 、1 4 5 来自酒厂的酒液； 1 1 5 来自罐 头汁：1 0 来自腐败的水果；7 8 来自土壤。来自酒曲中的菌株占总数的8 0 ，来自自然 环境的占到总数的2 0 ，说明从酒曲中分离产较高酒精的耐高温酵母菌株的可能性更人。 3 2 3 酵母菌三级筛 将二级筛得到的1 0 株菌进行2 0 0 m l 玉米面发酵试验，接种量为2 1 0 7 个m l ，发酵温 度为4 24 c ，重复三次结果见表7 0 表7 三级筛的发酵结果 由发酵结果可看出h - 1 酵母的产酒精率在这几株酵母菌中比较高，达到5 5 ( v v ) ：残 还原糖较低，仅残留1 1 2 ；且发酵力较高，7 2 h 失重为6 ，9 9 。 3 3 酵母菌的鉴定 3 3 1 亲本h - 1 菌株的形态和培养特征 h - 1 菌株在y p d 液体培养基中( 2 8 。c ) 培养一天细胞呈椭圆形或圆形，细胞大小( 3 2 5 5 ) x ( 62 5 9 ) u m ，见图片1 。在生孢子培养基2 8 c 培养1 6 d 后有子囊孢子形成，产子 囊方式，每个子囊含1 4 枚土星形子囊孢子。在y p d 琼脂培养基培养上生长的菌落为乳 白色、平滑、有光泽、边缘整齐。在加盖片的玉米淀粉培养基培养2 8 培养l o d 后形成假 菌丝。 3 3 2 生理生化试验 ( 1 ) 发酵糖类试验 h 一1 菌与模式菌株发酵糖类试验结果见表8 。 高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母 表8h i 菌与模式菌株发酵糖类试验结果 “+ ”表示发酵，“一”表示不发酵“+ - ”弱发酵 ( 2 ) i n 化碳源试验 h 一1 菌与模式菌株同化碳源试验结果见表9 。 袭9h - l 茁与模式菌株同化碳源试验结果 壁婆h-1菌土星汉逊酵母 棉耔糖+ 干 纤维二糖+ 肌醇一 一 核糖一 一 赤藓糖醇一一 鼠李糖一v 木糖+ 核糖醇一一 柠檬酸+v 琥珀酸+ 甘露醇一v 可溶性淀粉一 一 阿拉伯糖一一 海藻糖一 一 半乳糖一 一 麦芽糖一 一 蔗糖+ 乳糖一 一 “+ ”表示同化，“一”表示不同化，”v ”可变 ( 3 ) 同化氮源试验 h - l 菌与模式菌株同化氮源试验结果见表1 0 。 表1 0 h - l 菌与模式菌株同化氮源试验结果 “+ ”表示j 司化“一”表示不同化 ( 4 ) 其他生理生化试验 h - 1 菌与模式菌株其他生理生化试验结果见表11 。 表1 1 h - 1 菌与模式菌株其他生理生化试验结果 “+ ”表示同化，“一”表示不同化 根据生理生化试验结果- 并对照 t h ey e a s t s ：a t a x o n o m i cs t u d y ( 第三版) 【6 1 对汉逊 酵母的描述，h - 1 菌为土星汉逊酵母( h a n s e n u l as a t “r “s ) 。 2 河北农业大学硕士学位论文 3 4 酵母菌的原生质体融合 由于酿酒酵母s p 一4 8 在3 0 的产酒精率为1 6 9 ，但在5 0 的高温下却几乎不能生长： 而土星汉逊酵母h - 1 可在5 0 。c 下生长，但在4 2 。c 产酒精率仅为5 5 ，故采用原生质体融 合的方法获得在高温下可生长且产酒精率较高的菌株。 34 1 遗传标记的选择 ( 1 ) 药物标记的筛选： 表1 2药物标记的筛选 墨堕型鎏廑 堕塑醛蔓蔓匣! 二二二二二j 互二二二二 o 1 一 放线菌酮0 0 5 一 00 1 一 0 1 一 一 三唑酮 拳躐了： 0 0 0 1 + 0 1 一一 多菌灵 ? 盏萋： 00 0 1 + 01 一 一 灰酶特杀 ? 淼了了 0 0 0 1 + 01 + 决菌 ? 躐： 00 0 1 + 0 1 一 一 霜霉狂杀 ? 勰：了 00 0 1 + 通过上表可以看出，0 们的三唑酮对酿酒酵母s p 4 8 抑制，而对h - l 不抑制：多菌灵， 灰酶特沙抑制酿酒酵母时，也抑制h 1 ，决菌不抑制酿酒酵母s n _ 4 8 ，也不抑制h 1 ：而0 0 1 的霜霉狂杀不抑制酿酒酵母s p 4 8 抑制h - 1 。综合考虑，选用o 0 1 的三唑酮作为酿酒酵 母s p 4 8 的药物标记。 ( 2 ) 菌株条件致死标记的选择： 表1 3 h - 1 酵母致死率 墼錾空f 堑21 ：! ! ! ! ： ：二亚! 二二二：亟二二二二二卫i ：二 由上表可以看出，当照射时间为2 r a i n 时，致死率为1 0 0 。故选用2 m i n 的紫外照射 为酵母菌h - 1 的遗传标记。 高温酵母的分离鉴定及原生质体融台构建耐高温高产酒精酵母 3 4 2 原生质体的制备 ( 1 ) 菌种培养：将酵母菌s p 4 8 和h l 酵母活化转接新鲜斜面自新鲜斜面分别挑取一环s p - 4 8 酵母和h 1 酵母转接入2 5 m l 完全培养基中，3 0 振荡培养1 6 h ( 2 ) 收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液5 m l ，3 0 0 0 d m i n 离- t h , 1 0 r a i n ，弃上清液 柠檬酸磷酸缓冲液洗两次，收集菌泥 ( 3 ) 预处理：取5 m 1 0 2 d 巯基乙醇p b 缓冲液于装有酵母泥的离心管中，3 0 c 保温3 0 r a i n ， 以3 0 0 0 转分离心1 0 m i n 。倾去上清液 ( 4 ) 去壁：在装有处理过的s p 一4 8 ，h 1 酵母菌泥的两只离心管中，分别加入5 m l1 5 蜗牛 酶一p b 溶液置3 06 c 水浴中，s p 一4 8 酵母处理o 5 h ，h - l 酵母处理15 l - ，取样镜检，当8 0 以上 的细胞转变为原生质体时，2 5 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，用p b 液离心洗涤，洗去酶液，加入4 m l 高渗p b 液制成1 0 0 t m l 以上的原生质体液，铡定形成率，结果见表1 4 和图l 一4 。 图片l h 1 m e ( x 4 0 倍) 图