（农产品加工及贮藏工程专业论文）霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究.pdf

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l ，而根霉酯化酶适宜用量为 9 9 l o o m l 。通过正交实验优化功能性大曲在水相中合成己酸乙酯条件为： 己酸浓度为1 5 m l l o o m l ，乙醇浓度为l o m l l o o m l ，功能性大曲用量 9 9 l o o m l ，催化温度为4 0 。 3 黄水酯化液制备技术的研究：浓香型白酒生产过程中的副产物黄水和 酒尾中含有大量的酯类前体物质，以黄水、酒尾为主要原料，采用酯化酶 酶法制备酯化液，优化得出的酯化液酶法制各参数为：黄水、水与酒尾的 比例为2 ：2 ：1 ，乙醇浓度l o m l l o o m l ，己酸添加量1 5 m l l o o m l ，功能 性大曲用量7 l o o m l ，在温度3 0 的条件下，酯化7 d ，得到的酯化液中 香味物质含量高，比例适宜，风味协调，经处理可应用于提高浓香型白酒 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 主体香味物质的含量，提高白酒优质率。 关键词：根霉；红曲；酯化酶：己酸乙酯；酯化液 2 山东农业人学硕十学位论文 a b s t r a c t e s t e r i f y i n ge n z y m ei s ak i n do fe n z y m ew h i c hc a nm a k ep r e c u r s o r s u b s t a n c ef o r mf l a v o rc o m p o n e n t s e s t e r i f y i n ge n z y m eo fr h i z o p u ss p ， e s t e r i f y i n ge n z y m eo fm o n a s c u ss pa n df u n c t i o n a ld a q u a r em a i n l yu s e di n l i q u o r - m a k i n gi n d u s t r yt oi n c r e a s et h em a i nf r a g r a n c eo f l u z h o u f l a v o u rl i q u o r , b u tt h e r ea r em a n yp r a c t i c a lp r o b l e m s ，s u c ha sl o we n z y m ea c t i v i t y , u n s t a b l e e f f e c ta n du n w i d eu s a g ea n ds oo n i no r d e rt od e f i n i t et h ea c t i o nr u l e sa n d i m p r o v ea p p l i c a t i o n o fm o l de s t e r i f y i n ge n z y m e s ，t h i st e x t s t u d i e dt h e s u b s t r a t es p e c i f i t yo fm o l de s t e r i f y i n ge n z y m e s ，t h et e c h n i q u eo fs y n t h e s i so f e t h y l h e x a n o a t ei n a q u e o u sm e d i u ma n d t h e p r e p a r a t i o nt e c h n i q u e o f e s t e r i f y i n gl i q u i d p r i m a r i l ys t u d yr e s u l t sa sf o l l o w 暑： 1 s t u d yo nt h es u b s t r a t es p e c i f i t yo fm o l de s t e r i f y i n ge n z y m e s ：t h e e s t e r i f i c a t i o nr a t eo fa c e t i ca c i d ，b u t y r i ca c i d ，v a l e r i ca c i d ，h e x a n o i ca c i d ， h e p t a n o i ca c i da n do c t a n o i ca c i di n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fa c i dc a r b o n n u m b e rb yt h et h r e ed i f f e r e n te s t e r i f y i n ge n z y m e s t h et h r e ee s t e r i f y i n g e n z y m e si n h i b i t e dt h ef o r m a t i o n o fe t h y ll a c t a t e t h er e a s o nm i g h tb er e l a t e dt o t h ec h e r r i i c a ls t r u c t u r eo fl a c t i ca c i d t h e r ew e r ed i f f e r e n ts y n t h e s i se f f e c t so f d i f f e r e n te n z y m e s t h ee s t e r i f i c a t i o nr a t e so fa c e t i ca c i d ，l a c t i ca c i da n d h e p t a n o i c a c i dw e r eh i g h e rb ye s t e r i f y i n ge n z y m eo fr h i z o p u ss p 1 1 1 e e s t e r i f i c a t i o nr a t eo fo c t a n o i ca c i dw a sh i g h e rb ye s t e r i f y i n ge n z y m eo f m o n a s c u ss p t h ee s t e r i f i c a t i o nr a t e so fb u t y r i ca c i d ，v a l e r i ca c i da n dh e x a n o i c a c i dw e r eh i g h e rb yf u n c t i o n a ld a q u b u te t h y lh e x a n o a t e w a sh i g h l y s y n t h e s i z e db ya l ld i f f e r e n te n z y m e si nt h er e a c t i o ns y s t e mo f f o u r - m i x e da c i d a n de t h a n o l 2 r e s e a r c ho nt h et e c h n i q u eo fs y n t h e s i so fe t h y lh e x a n o a t ei na q u e o u s m e d i u m ：t h ec o n d i t i o n so fs y n t h e s i so fe t h y lh e x a n o a t ei na q u e o u sm e d i u m w e r ed i f f e r e n tb yd i f f e r e n tk i n d so fe s t e r i f y i n ge n z y m e s t h ea p p r o p i a t e c o n d i t i o n sf o rt h r e ee s t e r i f y i n ge n z y m e sw e r e ：t h et e m p e r a t u r e3 5 - - 4 0 c ；t h e c o n c e n t r a t i o no fh e x a n o i ca c i d lm l lo o m l ；t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l 1 0 ，。1 2 m l 1 0 0 m l ；t h ed o s a g eo fe s t e r i f y i n ge n z y m e 9 9 1 0 0 m l t h eo p t i m u m 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 c o n d i t i o n sf o rt h es y n t h e s i so fe t h y lh e x a n o a t eb ym i x e de s t e r i f y i n ge n z y m e w e r e ：t h ec o n c e n t r a t i o no f e t h a n o ll o m l l o o m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f h e x a n o i c a c i d1 5 m l l o o m l ，t h ed o s a g eo ff u n c t i o n a ld a q u9 9 l o o m la n dt e m p e r a t u r e 4 0 。 3 r e s e a r c ho nt h ep r e p a r a t i o nt e c h n i q u eo fe s t e r i f y i n gl i q u i d ：t h e p r e p a r a t i o nt e c h n i q u eo fe s t e r i f y i n gl i q u i dw a ss t u d i e db yu s i n gy e l l o ww a t e r , e n d i n gl i q u o ra n df u n c t i o n a ld a q ua sm a i nm a t e r a l s w i t ht h ea i do fs i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s a n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a lp r e p a r a t i o n t e c h n i q u eo fe s t e f i f y i n gl i q u i dw a st h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o llo m l lo o m l ， t h ea d d i t i o no fh e x a n o i ca c i d1 5 m l lo o m l ，t h ed o s a g eo ff u n c t i o n a ld a q u 7 9 l o o m la n dt e m p e r a t u r e3 0 k e y w o r d s ：r h i z o p u ss p ；m o n a s c u ss p ；e s t e r i f y i n ge n z y m e ；e t h y lh e n a n o a t e ； e s t e r i f y i n gl i q u i d 4 山东农业大学硕七学能论文 l 引言 1 1 中国白酒类型与特点 中国白酒( s p i r i t ) 是世界著名的六大蒸馏酒之一，是我国的传统蒸馏 酒，是我们中华民族的骄傲。中国白酒与其他蒸馏酒相比，独具风格，具 有特殊的风味。香味物质中的酯高、酸高、醛酮高、高级醇低的特征为我 国白酒的主要特点( 沈怡方，1 9 9 8 ) 。在1 9 7 9 年，第三届全国评酒会上按 照白酒风格的不同将其划分为酱香型、清香型、浓香型、米香型和其他香 型五种香型，后又出现了风香型，董香型，豉香型，芝麻香型，特香型等 香型白酒，最近又有老白干香型和馥郁香型通过了鉴定( 李大和，2 0 0 7 ) ， 表l 为我国主要三大香型白酒的分析比较。 目前，我国白酒的产量和消费量在饮料酒中位于第二位，仅次于啤酒， 其生产厂家遍布全国各地，其中四川、山东、安徽等省份为我国白酒的主 要产区。随着社会和经济的不断进步和发展，人们的消费观念也发生巨大 的转变，现在的消费者更加注重饮酒的感受，注重白酒的口感，这就对白 酒的质量提出了更高的要求。 表1三大香型白酒的比较( 李大和，2 0 0 7 ) t a b l e 1t h ec o m p a r i s o no ft h r e ek i n do fc h i n e s e s p i r i t s 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 1 2 浓香型白酒及增香技术 浓香型白酒，亦称泸香型白酒，以四门i 的泸州老窖和五粮液为典型代 表，属大曲酒类，其特点是窖香浓郁，清冽甘爽，绵柔醇厚，香味协调， 尾净余长。据相关资料统计，我国白酒市场上浓香型白酒所占比例为 6 9 1 3 ，可见其在整个白酒行业中占据主导地位，其消费量也是其他香型 6 山东农业大学硕士学位论文 白酒无可比拟的，也证明浓香型白酒消费群体仍占主流( 谢玉球，2 0 0 7 ) 。 白酒酿造是集糖化、发酵、酯化为一体的生物代谢过程，酿造前期主 要生成各种酸类和醇类物质，中后期酸和醇在酶的作用下，在适当的温度 条件下进行生化反应，逐步生成各种酯类，形成白酒独特的风格( 程江红， 2 0 0 6 ) ，尤其是低级脂肪酸与乙醇形成的酯，呈特有的芳香气味，是构成 酒的芳香成分与特殊风味的主要物质基础，如己酸乙酯是浓香型白酒的主 体香味物质，乙酸乙酯为清香型白酒的主体香味物质，乳酸乙酯为各香型 白酒香味物质的主要组成成分等( 表2 为各种乙酯类物质的感官特征) 。 浓香型白酒作为消费量最大的白酒香型，其风格及酒质的优劣，主要取决 于酒体中己酸乙酯含量的高低以及与其它酯类物质的比例是否协调。这些 酯类物质是由发酵产生的酸与醇进一步缩合而成。由于在曲酒生产过程 中，产酒快，产酯生香慢，特别是大曲中酯化菌含量较少，从根本限制了 己酸乙酯及其他酯类的生成，故造成了大曲酒发酵生香周期长，优质酒率 较低。而酒体中己酸乙酯的含量偏低历来是浓香型酒酒质低下、优质酒少 的主要原因( 潘运国，2 0 0 6 ) 。 表2 酯类化合物的感官特征( 沈恰方，2 0 0 1 ) t a b l e 2t h et a s t ec h a r a c t e ro fe s t e rc o m p o u n d 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 1 2 1 浓香型白酒中酯类的合成机理 白酒中酯类的生成途径有两条：一是酸和醇通过化学反应直接生成酯 类，但在常温下极为缓慢，往往需要很长时间才能使酯化反应达到反应平 衡。有研究发现在没有催化酶的条件下，己酸与乙醇直接反应能生成大量 的己酸乙酯，但需要严格控制时间在5 0 d 内，如果大于5 0 d 时，己酸乙酯 的量将减少，推测可能是酯化和皂化同时进行的结果( 赵树欣，1 9 9 7 ) 。 国外也有将醋中添加发酵粮食酒，放置1 个月后，醋中酯类的含量增多的 报道( 王福源，1 9 9 8 ) ；二是微生物的生化反应生成酯类。在白酒生产中 具有酯化能力的微生物主要是酵母菌和霉菌，它们都没有直接从碳水化合 物生成酯类物质的能力( 酵母菌能直接生成乙酸乙酯) 。但如果发酵基质中 8 山东农业大学硕士学位论文 有有机酸存在时，这一过程就可以完成。此过程是一个较复杂的生物化学 过程，有学者对酵母菌己酸乙酯的合成进行了深入的研究，推测其合成有 两条路径：一是在酯化酶作用，己酸和乙醇生成己酸乙酯；另一条路径为 乙醇、乙酰己酸转移酶在己酸辅酶a 之间反应而成( 栗山一秀，1 9 8 6 ； 赵华，1 9 9 8 ) ，其反应生成方式如下： ( 1 ) 己酸+ 乙醇且垮己酸乙酯 ( 2 ) 己酸+c o a + 乙醇丛马己酸乙酯 从以上研究可以看出为了提高浓香型白酒主体香味物质己酸乙酯的 含量，可以通过人工老窖泥培养己酸菌的方法增加前体物己酸的含量，从 而有利于己酸乙酯的合成，但是在实际生产应用中存在酯化反应速度缓 慢、转化率低等问题。可以在酒醅中加入酯化酶来加速酯化反应的进行， 从而能达到缩短发酵周期，提高酒体中已酸乙酯含量之目的。在适当的条 件下，酯化酶可直接催化酸与醇合成酯，并使反应速度大大加快，从而使 困扰白酒生产的发酵周期长和优质品率低的问题将会得到进一步的解决 ( 潘运国，2 0 0 6 ) 。近年来，酯化酶对酯化反应的催化作用已被越来越多 的酿酒界人士所认识，成为新的研究热点和浓香型白酒增香技术开发的途 径之一。 1 2 2 浓香型白酒增香技术 在过去的生产过程中，酿酒工作者为提高浓香型白酒的优质率，通过 长期的摸索实践，总结出了很多技术措施，如延长发酵期、双轮发酵、人 工培窖技术、回酒发酵、回泥发酵、回糟及翻糟发酵、回己酸菌液发酵， 回综合菌液发酵等( 沈怡方，1 9 9 8 ) 。虽然在实际生产中取得良好的效果， 但也存在一定的实际问题如发酵周期长、设备利用率低、粮耗高、出酒率 低等缺陷。随着现代科技的发展，我国酿酒科技人员逐步认识并掌握了增 香技术的原理，使其更好的应用于实际生产中，其中的人工老窖技术、强 化大曲技术、酯化酶技术被称为是提高浓香型酒酒质的三大微生物技术 ( 吴衍庸，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 1 人工老窖技术 泥窖在浓香型白酒酿造中必不可少，泥窖越老，产酒质量越高。通过 9 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 对浓香型白酒与窖泥微生物关系的研究，发现窖泥中富集多种厌氧功能 菌，它们参与浓香型白酒发酵的生香作用，是老窖出好酒的主要原因。人 工老窖技术，即通过人工的方法加速新窖窖泥老熟，使之达到老窖泥泥质 水平，从而使浓香型白酒己酸乙酯含量及优质品率有很大提高。窖泥的微 生物区系极为复杂，除己酸菌、丁酸菌等还有甲烷菌、丙酸菌、甲烷氧化 菌等功能菌，随着研究的深入，发现老窖中存在甲烷菌、己酸菌共酵的“种 间氢转移关系，其中的己酸菌发酵产生氢用于甲烷发酵产生甲烷上，使 己酸菌消除了氢的抑制而促进产酸，最终提高己酸乙酯含量，提高酒质( 吴 衍庸，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 2 强化大曲技术 一 白酒生产过程为开放式发酵，含有丰富的生香微生物，包括众多种类 霉菌、酵母菌、细菌，大多是从窖泥、酒曲中的微生物分离、筛选获得优 质生香菌株，如根霉菌是北方大曲霉菌中的主体霉菌，含有丰富的淀粉酶 和糖化酶，有的菌株含有丰富的酯化酶系，具有合成较长碳链酯的能力( 吴 衍庸，1 9 9 6 ；陈晓春，2 0 0 2 ) 。强化大曲就是将自然接种和人工接种相结 合，将从生产浓香型大曲酒的麦曲中筛选出酯化功能菌，加上霉菌和酵母 的优良菌系，制成生香功能曲。此强化大曲比传统大曲具有更强的糖化力、 发酵力和生香能力，并且强化大曲的生产周期短，质量也比较稳定，使用 该强化大曲不仅能提高出酒率和优品率，而且还可以减少用曲量，缩短发 酵周期。 1 2 2 3 酯化酶技术 酯类物质为浓香型白酒中主要的香味物质，但在实际生产中生酯速度 缓慢，使得浓香型白酒优质率不足3 0 。酯化酶在酶学上是解酯酶的统称， 包括脂肪酶和酯酶，它们与酯的生物合成有关。自1 9 7 6 年发现酵母及曲 霉菌在不同条件下对己酸的酯化作用后，有关酒厂及科研单位对曲霉菌的 酯化作用进行了较系统的理论研究及应用试验。目前，我国的科技工作者， 利用红曲霉、根霉和球拟酵母等产生的酯化酶，提高浓香型曲酒中的己酸 乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大酯的含量，提高优级率均获 得大生产的成功( 施安辉等，2 0 0 2 ) 。人工增香技术成为现代白酒酿造技术 的重要组成，增香技术的研究与成熟应用也成为浓香型白酒节能增效的重 1 0 山东农业大学硕士学位论文 要途径之一。 1 3 酯化酶技术研究与应用 大曲是浓香型白酒生产中的糖化剂、发酵剂、产香剂。大曲质量的好 坏直接影响着白酒的产量和质量。从优质大曲中筛选酯化酶产生菌以提高 白酒质量成为一新的研究点。卢世珩等( 1 9 9 4 ) 从2 7 株脂肪酶产生菌中 筛选出8 株能合成己酸乙酯，其中一株酯化活性强根霉( r h i z o p u ss p h 3 ) ， 脂肪酶活力6 0 u m l ；吴衍庸等( 1 9 9 9 ) 用从泸酒麦曲中分离到的烟色红曲霉 m 1 0 1 菌株培养生产复合香酯酶，其最适产酶温度3 0 。c ，酶反应最适温 度为5 0 ，酶液在6 0 处理2 4 h ，酶活力仍保存7 5 ，p h 稳定性在4 5 7 5 ，可保存1 0 0 酶活力。赵华等( 1 9 9 9 ) 以g 工曲霉( m o n a c u sf u l g i n o s u s ) 为 出发菌株，通过紫外线诱变选育出一株高活性己酸乙酯酯化菌m 3 e ，在 含l 己酸和1 5 乙醇的酯化培养基中添加5 m 3 e 菌麸曲粗酶制剂， 3 4 间歇振荡酯化7 d ，酯化液中己酸乙酯含量达2 3 5 9 l 。山东兰陵美酒 股份有限公司采用国内最先进的优良菌种生产，酯化酶活力高。产品主要 应用于浓香型大曲酒生产，可直接加入酒醅参与发酵，提高出酒率3 5 ，提高优质酒率2 0 - - - - 3 0 。目前，国内很多白酒厂应用酯化酶新技 术都取得了显著的效果( 傅金泉，2 0 0 6 ) 。 1 3 1 酯化酶的反应特性 酯化酶在酶学上是解酯酶的统称，包括脂肪酶和酯酶，它们与酯的生 物合成有关，酯化反应中两种酶的组成比例可能对酯的生成产生影响，从 而影响增香效果( 吴衍庸，1 9 9 6 ) ，酯化酶技术理论基础为酶在溶剂中反 应，将酸和醇在酯化酶作用下合成酯，酯化酶具有多向合成功能，能受控 同时合成浓香型酒以己酸乙酯为主体香的四大酯，也可单一合成纯己酸乙 酯，还可合成稀有酯类( 吴衍庸，2 0 0 3 ) 。酯化酶的反应特性与酯化菌有关， 在酿酒微生物中酵母菌合成乙酸乙酯的能力较强，浓香型大曲中的红曲 霉、根霉和毛霉中的某些菌株具有合成较长直链酯的酯化活性( 刘光烨， 2 0 0 2 ) ，且相同的酯化酶对不同的酸合成的能力也不一样。在反应过程中 底物种类、反应溶剂类型、温度、底物浓度等因素对酯化酶催化活性都有 影响。 1 3 1 1 底物种类 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 水相中酯化酶酸底物特异性的研究主要是针对浓香型白酒中的四大 酯的合成效果进行的研究，杜礼泉等( 2 0 0 5 ) 对红曲霉酯酶酯化特性的研 究中发现红曲霉酯酶对乙酸、丁酸、己酸都有较强的酯化作用生成相应的 乙酯，且红曲霉酯酶是一类专一性很低的酶，属于键专一性的生物酶。唐 玉明等( 2 0 0 5 ) 在对红曲酯化菌2 1 3 的特性研究中发现：四大酸和乙醇 反应生成相应的乙酯，但是四大酸的混合物却生成的物质为己酸乙酯。任 道群等( 2 0 0 6 ) 对红曲霉、大曲以及根霉菌对单一酸( 乙酸、己酸、乳酸， 丁酸) 和混合酸( 四大酸按1 ：1 ：l ：l 混合) 的酯化效果进行了研究，结果表 明：红曲霉能促进己酸，丁酸及混合酸与乙醇的酯化作用，生成的酯类物 质均为己酸乙酯，而且酯化能力极强；大曲能促进己酸，丁酸及混合酸与 乙醇的酯化作用，生成的酯类物质均为己酸乙酯，且能促进乙酸与乙醇的 酯化生成乙酸乙酯；根霉能促进己酸和混合酸与乙醇的酯化作用，生成少 量的己酸乙酯和乳酸乙酯。 1 3 1 2 溶剂类型 近几年，酶在有机相中的生物催化作用日益受到人们的重视，在含有 微量水分的有机溶剂中，酶不仅不会失去活性，而且还由于蛋白质分子内 氢键作用的加强，增加了蛋白质的刚性，使酶的热稳定性显著增加，并增 加了非极性底物的溶解性，减少反应的副产物，增加了合成的反应速率( 杨 本宏等，2 0 0 6 ；李大和，2 0 0 8 ) 。但在食品工业中，有机相溶剂的存在不 利于简化下游操作步骤，并存在有机溶剂污染食品问题。水相酯化反应虽 然进行缓慢，但可以和实际生产相结合，可将酯化产品直接应用到生产中， 简单方便。所以应该根据不同目的，选用不同反应介质来进行酯化反应。 1 3 1 3 温度 酶促催化反应本质上是一种化学反应，底物分子运动的动能与温度高 低有直接的关系，升高反应温度能增加底物分子运动动能，增加底物分子 与酶接触的机会，从而提高了反应速度( 王境岩等，2 0 0 5 ) 。但是温度对 酶促反应速度的影响又是很复杂的，随着温度的升高，一方面酶反应速度 加快，另一方面酶蛋白的热变性速度亦加快，因此，一个合适的反应温度 对酶促反应的进行有重要意义。 1 3 1 4 底物浓度 1 2 山东农业大学硕士学位论文 由于酯类物质的底物为酸和醇类，两者在酯化反应中不仅是底物，还 都是酯化酶的变性剂，在低底物浓度范围，己酸乙酯合成转化率是随着浓 度的增加而增大的，这是因为增加底物浓度，可增加酶分子与底物作用的 机会，加快反应速率；但底物浓度过大时，高浓度的酸和醇将抑制反应的 进行，反应速率减慢，一定时间内的转化率将下降。 1 3 2 酯化酶在食品行业中的应用 目前，酯化酶在食品中的应用研究主要集中传统发酵食品中来提高产 品的质量。酯化酶技术的应用是中国白酒工业的一项重大创新成果，在白 酒生产中应用的酯化酶制剂是生物酶和活菌体的生态混合体，在发酵过程 既有传统大曲的糖化功能，也有生香功能，从而能起到缩短发酵周期，提 高出酒率和优品率( 张志刚，2 0 0 6 ) 。有研究表明，在固态食醋酿造过程 中添加酯化酶功能性大曲，试验组酯香味明显高于对照组，气相色谱分析 结果表明乙酸乙酯和乳酸乙酯的量有明显的提高并且产品的出品率也得 到了提高( 施安辉，2 0 0 3 ) 。 许德富等( 1 9 9 5 ) 在对解决浓香型白酒发酵周期长的问题研究过程中， 提出了将生香酯化发酵从大曲整体发酵过程中独立出来并移到窖外，在人 为控制的条件下，应用微生物和酶技术来控制酯化过程，以实现缩短发酵 周期和提高酒质的目的。酯化液的制备就是对这一理论的进一步的发展， 酯化液是利用现在微生物技术和发酵工程技术将有机酸等成分转化为酯 类等白酒香味成分的混合液，其中富含以己酸乙酯为主要成分的多种香型 白酒所含的香味成分( 钟玉叶，2 0 0 3 ) 。现在通过人为的控制酯化条件， 利用黄水、酒尾等发酵副产品在酯化酶的作用制备酯化液的反应技术在大 部分白酒厂中都有应用，在苹果醋饮料中通过添加酯化酶也可提高饮料中 香味物质含量( 刘宾，2 0 0 7 ) 。因此，进一步深入研究明确酯化酶的生香 作用规律和条件，是提高其白酒生产中应用效果和拓展应用范围的基础。 1 4 本课题研究的目的、内容和意义 1 4 1 研究目的 ( 1 ) 通过研究霉菌酯化酶对不同酸底物与乙醇合成乙酯的能力，以总结 霉菌酯化酶合成乙酯底物作用规律。 ( 2 ) 通过对水相己酸乙酯合成技术，以总结霉菌酯化酶水相合成己酸乙 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 酯的规律和应用技术条件。 ( 3 ) 通过研究黄水酯化液的制备技术，为生产高质量酯化液提供理论和 技术支持。 1 4 2 研究内容 一 ( 1 ) 霉菌酯化酶不同酸底物特异性研究 ( 2 ) 霉菌酯化酶水相合成己酸乙酯技术研究 ( 3 ) 黄水酯化液制备技术研究 1 4 3 研究意义 研究针对提高霉菌酯化酶应用效果，扩宽霉菌酯化酶的应用领域，开 展霉菌酯化酶酸底物特异性、水相合成己酸乙酯技术、酯化液制备技术的 研究将对阐明功能性霉菌的酶学理论和霉菌酯化酶作用规律和机理有科 学理论意义，对提高霉菌酯化酶工业化、标准化和专用化生产有实践指导 作用。 1 5 技术路线 酯化菌( 根霉、红曲) 1r 粗酶制剂功能性大曲 r 一 r1 r1 r i 酸底物撑异性研究 合成己酸乙酯技术研究酯化液制备技术 l 上 总结霉菌酯化酶作用规律 1 4 山东农业人学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 菌种及原料 根霉( 本实验室选育保藏菌种) ； 红曲( 本实验室选育保藏菌种) ； 功能性大曲( 山东梁山徐坊大曲有限公司提供) ； 黄水、酒尾( 山东泰山生力源集团有限公司提供) 。 2 2 培养基 根霉保藏培养基： 麸皮l o g ，葡萄糖3 9 ，琼脂2 9 ，水l o o m l 。 红曲霉保藏培养基： 麦芽汁l o o m l ，琼脂2 9 。 酯化酶制备培养基： 配方：麸皮1 5 0 9 ，水1 5 o m l 。 2 3 主要试剂 试剂名称生产单位 葡萄糖天津市永大化学试剂开发中心 无水乙醇天津市百世化工有限公司 冰乙酸天津市凯通化学试剂有限公司 乳酸天津市凯通化学试剂有限公司 正丁酸国药集团化学试剂有限公司 戊酸上海星火化工厂 正己酸国药集团化学试剂有限公司 正庚酸天津市光复精细化工研究所 正辛酸天津市永大化学试剂开发中心 硫酸淄博化学试剂厂有限公司 氢氧化钠天津市化学试剂二厂 盐酸济南恒益瑞德化工有限公司 酚酞济宁市化工研究所 纯级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 化学纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 邻苯二甲酸氢钾 蒸馏水 琼脂粉 2 4 主要仪器 仪器名称 上海山浦化工有限公司分析纯 山东农业大学 上海 h h s 恒温水浴锅 h h b11 - 5 0 0 电热恒温培养箱 s w - c j i f 超净工作台 z d 8 5 a 气浴恒温振荡器 q l 9 0 1 涡旋器 y x q g 0 2 电热式蒸汽消毒器 n i k o ny s 2 电子显微镜 海尔冰柜 电子天平 k d m 型可调控温电热套 d e l t a 3 2 0p h 计 其它仪器：气相色谱仪s p 5 0 2 ， h p 4 8 9 0 d ，挥发酯蒸馏装置等。 2 5 实验方法 2 5 1 根霉酯化酶的制备方法 2 5 1 1 斜面培养 生产厂家 江苏省金坛市正基仪器有限公司 上海市跃进医疗器械一厂 苏州安泰空气技术有限公司 常州澳华仪器有限公司 其林贝尔仪器制造公司 山东新华医疗器械厂 日本尼康光学仪器有限公司 青岛海尔特种电冰柜有限公司 上海精天电子仪器有限公司 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司 梅特勒一托利多仪器有限公司 气相色谱仪s p 6 8 0 0 a ，气相色谱仪 麸皮加水( 1 0 麸皮) 煮沸1 5 m i n ，用纱布过滤，滤液中加入3 葡 萄糖和2 琼脂粉，全部融化后装入试管( 1 8 1 8 0 m m ) ，0 1 m p a2 0 m i n 高压灭菌，取出后摆成斜面。在无菌操作台中，接上菌种，放置到3 5 恒温培养箱中培养2 d 。 2 5 1 2 根霉孢子悬浮液的制备 用无菌水刮洗下斜面菌种，在无菌操作下用灭过菌的纱布过滤得孢子 悬浮液，稀释孢子悬浮液到每毫升含1 0 5 - - 1 0 6 个孢子( 血球计数板计数) 。 2 5 1 3 根霉酯化酶的制备 1 6 山东农业大学硕七学位论文 称取1 5 o g 麸皮，加水1 5 0 m l 搅拌均匀后装入2 5 0 m l 的三角瓶中 0 1 m p a 灭菌3 0m i n ，冷却后接种1 0 m l 孢子悬浮液，在3 5 。c 培养箱中 培养7 2 h ，每8 h 摇瓶次，将培养物自然风干磨碎过筛，即制得根霉酯 化酶，低温保存备用。 2 5 2 红曲酯化酶制剂的制备方法 2 5 2 1 红曲斜面培养 取一份麦芽粉加四份水，在6 5 水浴锅中保温3 4 h ，直至糖化完全 ( 检查方法是取0 5 m l 的糖化液，加2 滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖 化完全) ，糖化液用4 - - 6 层纱布过滤，调整p h ，加入2 琼脂，补充失水。 分装、加塞、包扎在o 1 m p a 灭菌2 0 m i n 后摆斜面，在无菌操作台中，接 上菌种，放置到3 5 恒温培养箱中培养7 d 。 2 5 2 2 红曲孢子悬浮液的制备 用无菌水刮洗下斜面菌种，在无菌操作下用灭过菌的纱布过滤得孢子 悬浮液，稀释孢子悬浮液到每毫升含1 0 5 1 0 6 个孢子( 血球计数板计数) 。 2 5 2 3 红曲酯化酶的制备 称取1 5 0 9 麸皮，加水1 5 0 m l 搅拌均匀后装入2 5 0 m l 的三角瓶中 o 1 m p a 灭菌3 0m i n ，冷却后接种1 0 m l 孢子悬浮液，在3 5 。c 培养箱中 培养7 d ，每8 h 摇瓶一次，将培养物自然风干磨碎过筛，即制得红曲酯化 酶，低温保存备用。 2 5 3 霉菌酯化酶不同酸底物特异性研究 2 5 3 1 霉菌酯化酶对单一酸与乙醇酯化反应的研究 分别吸取乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸各l m l 于1 0 0 m l 锥形瓶中，加入2 0 m l 无水乙醇，用蒸馏水定容到1 0 0 m l ，再分别加入不 同种类的酯化酶5 9 并标号：1 号为根霉酯化酶，2 号为红曲酯化酶，3 号 为功能性大曲，4 号作对照不添加任何酯化酶，在3 5 下酯化1 0 0 h 。酯 化后的试样倒入5 0 0 m l 蒸馏烧瓶中，量取5 0 m l 蒸馏水充分洗涤装酯化 液的锥形瓶，将洗液一并倒入蒸馏瓶中蒸馏，接馏出液1 0 0 m l 用气相色 谱测定生成的相应酯类的含量。 2 5 3 2 霉菌酯化酶对混合酸与乙醇酯化反应的研究 分别吸取己酸、乙酸、乳酸、丁酸各0 2 5 m l 于1 0 0 m l 锥形瓶中，加 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 入2 0 r a l 无水乙醇，用蒸馏水定容到l o o m l ，再分别加入不同种类的酯化 酶5 9 并标号：1 号为根霉酯化酶，2 号为红曲酯化酶，3 号为功能性大曲， 4 号作对照不添加任何酯化酶，在3 5 c 下酯化l o o h 。酯化后的试样倒入 5 0 0 r n l 蒸馏烧瓶中，量取5 0 m l 蒸馏水充分洗涤装酯化液的锥形瓶，将洗 液一并倒入蒸馏瓶中蒸馏，接馏出液l o o m l 用气相色谱测定四大酯( 己 酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯) 的含量。 2 5 4 霉菌酯化酶水相合成己酸乙酯技术研究 2 5 4 1 霉菌酯化酶水相合成己酸乙酯的单因素试验 依次改变乙醇浓度( 6 、8 、1 0 、1 2 、1 4m l l o o m l ) 、己酸浓度( 0 5 、 1 、1 5 、2 、2 5 m l 1 0 0 m l ) 、酯化酶用量( 3 、5 、7 、9 、1 l g l o o m l ) 、温 度( 2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 c ) 来研究不同酯化酶合成己酸乙酯的作用条件， 并确定功能性大曲正交试验中各因素的取值。 2 。5 4 2 功能性大曲水相己酸乙酯合成条件的正交优化 选取功能性大曲为研究对象，对其在水相中合成己酸乙酯的条件进行 正交优化，正交试验设计因素水平表如表3 所示： 表3 正交试验冈素水平表 t a b l e 3t h ef a c t sa n dl e v e l so ft h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 2 5 4 3 功能性大曲水相己酸乙酯合成作用规律 在优化条件下进行己酸乙酯合成作用规律的研究，每隔2 4 h 测定一次 试样中己酸乙酯的含量，计算己酸乙酯合成量并作图。 2 5 5 黄水酯化液酶法制备技术研究 一 2 5 5 1 酯化液原料的预处理方法 新鲜黄水需要静置一周后除去上层悬浮物及下层沉淀物后才能使用， 按照黄水：水：酒尾为2 ：2 ：1 的配方配制酯化反应液。 2 5 5 2 酯化液制备单因素试验 山东农业人学硕十学位论文 通过单因素轮换法确定对酯化液制备有影响的乙醇浓度、己酸添加 量、酯化酶用量、温度等因素的适宜作用条件并确定正交试验中各因素的 取值。 2 5 5 3 酯化液合成条件的正交优化 通过对影响酯化液合成因素的研究，选取各因素中较佳水平进行正交 优化，因素水平表见表4 。 表4 正交试验冈素水平表 t a b l e 4t h ef a c t sa n dl e v e l so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 2 6 分析方法 2 6 1 气相色谱条件及酯化率计算方法 ( 1 ) 气相色谱仪s p 5 0 2 ( 分析己酸乙酯和乳酸乙酯) 柱型：p e g 2 0 m ( 3 0 m x o 2 5 m m x l 0 p m ) ；检测器：f i d ；柱温1 2 5 。c ， 气化室温度1 5 0 c ，检测器温度1 5 0 。c ；氢气流速：3 0 m l m i n ，氮气流速： 3 0 m l m i n ，空气流速：3 0 0 m l m i n ；进样量：1 此。 ( 2 ) 气相色谱仪s p 一6 8 0 0 a ( 分析乙酸乙酯和丁酸乙酯) 柱型：g d x 1 0 2 ，柱长2m ，内径3m m ；检测器：f i d ；柱温1 5 5 ， 检测器温度1 6 0 ，气化室温度1 8 0 ：氢气流速：3 0 m l m i n ，氮气流速： 3 0 m l m i n ，空气流速：3 0 0 m l m i n ：进样量：l 此。 ( 3 ) 气相色谱仪h p 4 8 9 0 d ( 分析戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和混合 四大酯) 柱型：荷兰c h r o m p a c k 公司c p w a x 5 7 c b 柱，柱长5 0 m ，内径0 2 5 m m ； 检测器：f i d ；内标物：醋酸正戊酯；温度设置：柱温：起始温度3 5 c ， 保温4 m i n ，然后以4 c m i n 升至6 0 。c ，再以1 0 。c r a i n 升至1 3 0 c ，再以 1 5 c m i n 升至2 1 0 ，保温2 0 m i n 。氢气流速：3 0 m l m i n ，氮气流速： 1 9 霉菌酯化酶作用规律及应用技术研究 3 0 m l m i n ，空气流速：3 0 0 m l m i m 柱前压：1 2 2k p a ；气化室温度：2 5 0 c ： 检测器温度：2 7 0 c ；进样量：l 此，分流比：1 0 0 ：1 。 ( 4 ) 酯化率的计算公式 酯化率的计算公式： 酯化率= mm 1 1 0 0 m 2vp 式中： n l 一生成相应乙酯量，g ； m l 一相应酸的摩尔质量，g m o l ； m 2 一相应酯摩尔质量，g m o l ； v 一相应酸的添加体积，m l ； p 一相应酸的密度，g m l 。 2 6 2 挥发酯的测定 挥发酯的测定原理是：利用水蒸气蒸馏，将样品中的酯蒸馏出，先用 氢氧化钠中和游离的酸，再加入一定量的碱使之与挥发酯发生皂化反应， 剩余的碱再用一定过量的酸液中和，然后用氢氧化钠溶液滴定中和后剩余 的酸，以此公式计算样品中的挥发酯量，以己酸乙酯计。 挥发酯= n i ( v l - _ - v 2 ) - - n 2 v 3 x 0 1 4 4x 1 0 0 0 ( g l ) v 4 式中： n 1 一n a o h 标准溶液的摩尔浓度，t o o l l ； v l 一加入皂化用的n a o h 溶液体积，m l ； v 2 一滴定用n a o h 溶液的