（农产品加工及贮藏工程专业论文）猪骨胶原多肽的制备及其抗氧化性研究.pdf

附件一 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： i 弋l2 啪舞6 月2 7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 4 才 厣 l 乒 - 1 1 1 ) 即僻 i j 6 月z 宁日 钐夥( ；日 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 捅要 我国是一个生猪生产大国，猪骨加工具有重要意义。猪骨胶原多肽是将猪骨 胶原水解而得到的具有特殊生理功能的一系列多肽的总称。胶原多肽具有很多的 特殊生理功能，抗氧化功能是其重要的功能之一。本研究较系统地研究了猪骨胶 原多肽的制备条件和抗氧化功能。 1 猪骨胶原多肽的制备 在确定了中性蛋白酶适合制备猪骨胶原多肽的基础上，采用五元二次回归正 交旋转组合设计的方法，对中性蛋白酶酶解制备胶原多肽建立了如下的回归方 程： y = 5 2 5 7 + 5 8 x - 2 8 4 x ：+ 2 0 2 【3 + 7 6 2 ) ( + 6 8 5 x 5 + 0 2 5 x - x 2 + 1 o l x 】【3 + 1 3 x i ) 【+ 2 1 4 x 。x 5 0 1 9 x 2 】( 3 0 7 3 x 2 ) ( 4 + 0 7 8 x ：x 6 + 0 5 3 y l + o 1 7 x s + 0 6 6 x j ( s + 1 1 6 x - 。一 3 2 9 x 2 z - 3 3 6 x 3 - 4 9 1 烀一3 4 1 埒 经：弦分析检验显示该回归方程失拟性不显著，拟合度高。在建立回归方程的 基础上，采用统计选优法对中性蛋白酶酶解制备胶原多肽的最优酶解条件进行了 预测，结果显示最优酶解条件为： e c s = 9 8 1 0 ， s ：3 3 6 ，p h = 7 5 7 7 ，t = 4 6 4 c 4 8 1 ，t = 4 5 h 4 8 h 。 采用葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg - 2 5 ) 对猪骨胶原多肽进行洗脱分级，得到6 个级分，各级分对超氧阴离子的清除能力大小不一，其中清除能力最大的一个级 分的半抑制浓度( i 氏) 为4 1 lm g m l 。 2 猪骨胶原多肽的抗氧化功能研究 采用h ：0 2 为氧化剂检测胶原多肽的抗氧化能力。结果表明：胶原多肽具有较 强的抗氧化能力，其抗氧化能力仅次于二丁基羟基甲苯( b h t ) ，大于谷胱甘肽 ( g s h ) 和抗坏血酸( v c ) ，而且抗氧化能力随着浓度的增大而增强。 采用f e n t o n 反应体系对胶原多肽的羟基自由基清除能力进行了检测。结果 表明：胶原多肽具有较强的羟基自由基清除能力，其清除能力略大于谷胱甘肽， 随着浓度的增大而增强，而且无助氧化作用。 采用猪油、菜油和豆油体系对胶原多肽抑制油脂氧化作用进行了检测。结果 表明：胶原多肽具有较强的抑制油脂氧化作用，其在菜油和豆油体系中抑制作用 大于在猪油体系中抑制作用；b h t 和抗坏血酸均对胶原多肽具有明显的协同效 应。 研究了胶原多肽对小鼠肝组织匀浆、小鼠肝线粒体和大鼠红细胞氧化的抑制 作用。结果表明：胶原多肽对三个体系丙二醛( m d a ) 的生成均有较强的抑制作 用。 关键词：猪骨胶原多肽抗氧化酶水解 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 a b s t r a c t c h i n ai sa l lm a j o rp r o d u c e ro fs w i n e i ti si m p o a a n tt op r o c e s st h es w i n eb o n e t h e s w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d ew a so b t m n e db ye n z y m a t i ch y d r o l y s i so fs w i n eb o n e g e l a t i n t h e s ep e p t i d e sh a dm a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s t h ea n t i o x i d a n t i o nw a sa n i m p o r t a n to n e t h ep r e p a r a t i o na n da n t i o x i d a n t i o no ft h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p f i d e s w e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yi nt h i sp a p e r 1 p r e p a r a t i o no ft h es w i n eb o n ec o n a g e np e p t i d e s a f t e rt h ed i s p a s e l 3 9 8w a sc h o s e nt o h y d r o l y z e t h es w i n eb o n e c o l l a g e n ，t h e e x p e r i m e n tc o n d u c t e dw i t ht h eq u a d r a t i cr e g r e s s i o no r t h o g o n a lr o t a t i o n a lc o m b i n a t i o n d e i g nt os t u d yt h em a t h e m a t i c a lm o d e l f o rt h ep r e p a r a t i o no ft h es w i n eb o n ec o l l a g e n p e p t i d e s 1 1 1 em a t h e m a t i c a lm o d e li s ： y = 5 2 5 7 + 5 8 x 1 - 2 8 4 x 2 + 2 0 2 x 3 + 7 6 2 x 4 + 6 8 5 x s + o 2 5 x 1 x 2 + 1 0 1 x 1 x 3 + 1 3 x 1 x 4 + 2 1 4 x 1 x 5 0 1 9 x 2 x 3 0 7 3 x 2 x 4 + 0 7 8 x 2 x s + o 5 3 x 3 x 4 + 0 1 7 x 3 x s + 0 6 6 x o x s + 1 1 6 x ：t 2 - 3 2 9 x 2 2 3 3 6 x 3 2 4 9 1 x 4 2 - 3 4 1 x s 2 t h er e s u l to fa n a l y s i so fv a r i a n c es h o w e dt h a t ：t h ed e g r e eo ff i t t i n gw a sh i 曲e ra n dt h e r e l i a b i l i t y w a sb e t t e r t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s f o r e n z y m a t i ch y d r o l y s i s w e r e p r e d i c t e db yt h es t a t i s t i c a lo p t i m i z a t i o n m e t h o d t h er e s u l ts h o w e dt h a ti ft h e s c a v e n g i n gr a t eo fs u p e r o x i d ea n i o nw a sm o r et h a n7 2 ，t h ec o n d i t i o n sf o re n z y m a t i c h y d r o l y s i sw o u l db e 【e s 】9 8 1 0 ， s 3 3 6 ，p h7 5 7 7 ，t4 6 4 c 4 8 1 ，t4 5 b 4 8 h t h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d ew a sg r a d e dw i t hs e p h a d e xg 一2 5a n d6g r a d e sw e r e i s o l a t e d t h es u p e r o x i d ea n i o ns c a v e n g i n ga b i l i t yo fe a c hg r a d ew a sd i f f e r e n t t h e 5 0 i n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n ( i c s o ) o fo n eg r a d ew a s4 1 1m g m l , w h i c hh a dt h es t r o n g g e s t s u p e r o x i d ea n i o ns c a v e n g i n ga b i l i t yi n6g r a d e s 2 t h ea n t i o x i d a n t i o no ft h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d e t h eh y d r o g e np e r o x i d ew a su s e dt ot e s ta n t i o x i d a t i v ea b i l i t yo ft h es w i n eb o n ec o l l a g e n p e p t i d e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d eh a da n t i o x i d a t i v e a b i l i t yw h i c hw a sa l i t t l ew e a k e rt h a nd i b e n z y l a t i o o l u e n ea n ds t r o n g e rt h a nr e d u c e d g l u t a t h i o n eh o r m o n ea n da s c o r b i ca c i da n dt h ea n t i o x i d a t i v ea b i l i t yw o u l db e c o m e s t r o n g e rw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ew i n e b o n ec o l l a g e np e p t i d eb e c a m eb i g g e r 2 堕型奎些查兰! 塑! 旦堡主丝丝苎 t h ef e n t o nr e a c t i o ns y s t e mw a su s e dt ot e s tt h es c a v e n g i n ge f f e c to nh y d r o x y l r a d i c a l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d eh a dt h es c a v e n g i n g e f f e c to nh y d r o x y lr a d i c a l sw h i c hw a sal i t t l es t r o n g e rt h a nr e d u c e dg h t a t h i o n eh o r m o n e a n dt h es c a v e n g i n ge f f e c to nh y d r o x y lr a d i c a l sw o u l db e c o m es t r o n g e rw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no ft h es w i n eb o n ec o h a g e np e p f i d eb e c a m eb i g g e r t h es w i n eb o n e c o l l a g e np e p f i d ed i dn o ts h o wp r o - o x i d a t i o ne f f e c t t h el a r d 、r a p eo i la n db e a no i lw e r eu s e dt ot e s tt h ei n h i b i t o r ye f f e c to ft h es w i n eb o n e c o i l a g e np e p f i d eo n o x i d a t i o no fl i p i d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es w i n eb o n e c o i l a g e np e p f i d eh a di n h i b i t o r ye f f e c to n o x i d a t i o no fl i p i d s ，w h i c hw a ss t r o n g e ro n r a p eo i la n db e a no i lt h a no nl a r d d i b e n z y l a t i o o l u e n ea n d a s c o r b i ca c i dh a ds i g n i f i c a n t s y n e r g i ce f f e c t so nt h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d e 一 t h ei n f l u e n c e so ft h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d eo nt h em a l o n a l d e h y d e ( m d a ) c o n t e n ti nm i c el i v e rj u i c e ，m i c el i v e rm i t o e h o n d r i aa n dm i c er e db l o o dc e i lw e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es w i n eb o n ec o l l a g e np e p t i d ec o u l dr e d u c et h e c o n t e n t so fm d a g e n e r a t e db ym i c ef i v e rj u i c e ，m i c el i v e rm i t o c h o n d r i aa n dm i c e r e d b l o o dc e i l d u r i n gw a r l n b a t h i n g k e yw o r d s ：s w i n eb o n e ，c o l l a g e np e p t i d e ，a n t i o x i d a n t i o n ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s 3 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 前言 1 1 畜骨加工的意义 我国是一个畜牧业大国，猪的生产总量居世界前列。改革开放以来，在党和 政府一系列加速农牧业发展的政策推动下，我国畜牧业连续2 0 年平均年递增 9 9 ，产值增长近5 倍，达到4 0 0 0 亿元，占到农业总产值的i 3 。2 0 0 4 年生猪 存栏4 8 2 亿头，出栏6 1 8 亿头，猪肉产量4 7 0 1 6 1 万吨，均居世界第一( 1 】。 随着畜禽养殖的迅猛发展，副产物随之大量增加，这些副产物的深加工必须 跟上养殖业的发展步伐，才能提高畜禽养殖的经济效益，减少资源浪费，促进产 业持续、快速、健康、稳定地发展。因此，加强畜禽副产物的开发利用具有十分 重要的意义。畜禽副产物的开发利用主要包括对畜禽的血液、骨、内脏、皮毛、 蹄等的综合加工利用。目前，利用畜禽的副产品进行生化制药，已是与现代生物 科技紧密结合的一项高科技产业，如何发展更多具有科技含量高、附加值高的畜 禽副产品利用项目，已成为畜禽副产品研究、开发的重点。 畜禽副产物主要包括血液、骨、内脏、皮毛、蹄等。畜骨综合加工利用作为 畜禽副产物综合利用中重要的一部分值得深入的研究。畜禽骨骼由骨膜、骨质、 骨髓构成，是蛋白质和钙质组成的网状结构，再构成管状，管内充满了含多种营 养物质的骨髓( 如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原、软骨素等) 。鲜骨中含 有蛋白质、脂肪、矿物质( 如钙、磷、铁等) 、骨胶原、软骨素以及维生素a 、b 。、 b 。等。目前我国畜骨综合加工利用主要包括以下几个方面：对畜骨蛋白质的利用， 对畜骨脂肪的利用，对畜骨钙的利用，以及对畜骨中微量成分的利用。 1 2 畜骨蛋白质利用现状 ， 畜骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质，生物学效价高0 1 。骨蛋白的主要成分 为胶原蛋白，胶原蛋白是动物结缔组织( 骨、软骨、皮肤、腱、韧等) 的主要成 分，在脊椎动物中约占总蛋白质的1 1 3 左右，形成一种十分独特的三股超螺旋结 构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解“1 。 、目前对畜骨蛋白质的利用从加工方式来分：一方面是通过将畜骨加工成粉、 浆或是糊状加以利用；另一方面是通过一定的提取工艺将畜骨中的蛋白质提取出 来加以利用。 将畜骨加工成骨粉作为蛋白补充源是人们对畜骨很早就采用的一种利用方 式。其加工方法按加工过程的温度不同可分为：低温冷冻法、高温高压法和常温法。 低温冷冻法就是将鲜骨在一1 5 一2 5 以下充分冷冻脆化，然后粉碎、磨细：高温 高压法就是把鲜骨蒸煮酥软，然后烘干、粉碎；常温法就是指无需冷冻或高温蒸 煮，在常温下加工。和低温冷冻法、高温高压法相比，常温法是目前较新的方法。 据报道“1 ，利用钢柔复合材料超细粉碎机制备超细骨粉，其产品从粒度分布、微 4 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 观形貌及营养成分等方面与高温高压法制取的骨粉相比，具有粒度细、能耗低、 营养全的优点。这种加工方法过程是：将清洗烘干的骨头通过强冲击力，使其破碎 成1 0 ，2 0t o n i 的骨粒团，再粗粉碎，通过剪切力、研磨力使韧性组织被反复切断， 通过挤压力：研磨力使钢性骨粒进一步粉碎至l 2 咖的骨糊，接着通过剪切、挤 压、研磨的复合力场的作用，使骨料得到细粉碎或超细粉碎。 畜骨中的蛋白质提取主要是指对骨胶的提取。骨胶就是粉碎后的畜骨经洗涤 脱脂，加酸去杂，浸泡熬煮，浓缩成胶冻状的物质。骨胶的主要成分就是骨蛋白， 它被广泛应用于医药和食品工业中嘲。医药领域主要利用骨胶来制丸剂、胶囊， 食品工业上用明胶来制肉冻、酱类及软糖等，明胶还可用作微生物的培养基及照 相用明胶。目前，骨胶的制备工艺已较成熟，只是个别工艺环节有待改善。如刘 小玲、许时婴“1 对明胶传统提取工艺进行改良，在骨素吸水膨胀阶段添加0 2 的 h z o ：，并直接加热提取明胶，使明胶的提取率提高近3 倍，提取出的明胶的色泽浅， 抗菌性好。此改良的提取工艺极大地缩短了明胶生产时间，减少能耗。其研究表 明，由于h 。0 ：对芳香族氨基酸的破坏，加速胶原链的断裂解聚，因而使明胶的提 取率提高。， 对畜骨中提取的蛋白质进行酶水解则是畜骨蛋白质利用中较新的一个方向。 多肽是畜骨蛋白质酶水解的主要产物，目前的研究表明：利用畜骨蛋白质酶水解 得到的水解产物具有很多活性功能，如抗氧化、降血压等。“。很多学者也对畜 骨蛋白质酶水解的工艺作了研究。如白恩侠，张卫柱嘲利用牛骨为原料，采用酶 水解方法来制备易被人吸收的小肽及氨基酸，确定了工艺流程及最佳途径，其工 艺简单，成本低廉，易于推广应用。赵胜年等埘进行了酶法水解鲜牛骨的研究， 采用胰酶进行水解反应，确定了最适酶解条件。王朝旭等“”采用了胰蛋白酶对鲜 猪骨进行了酶法水解的研究，确定了酶解最佳工艺条件。 1 3 胶原多肽研究进展 胶原多肽亦称水解明胶，是胶原或明胶经过蛋白酶等降解处理得到的分子量 约为3 0 0 0 2 0 0 0 0 d a l ，与明胶相比具有较强的水溶性，易被人体吸收的一类多肽 混合物“”。胶原多肽具有较多的生理功能，例如抗高血压、预防与治疗骨关节炎 和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等 1 ”2 2 q 因此，胶原多肽在保 健食品、化妆品等领域具有较广泛的用途。 ：1 3 1 胶原多肽的生理功能 自古以来人们就知道明胶有利于身体健康，如我国“阿胶”( 主要为驴皮 胶原组分) 的补血、止血以及增强体质等方面的作用早已被人们所认可。近年来 研究证实胶原多肽也具有一定的功能性。自从1 9 7 9 年日本学者大岛等确认明胶来 源的多肽具有抑制血压作用以来，相继又有研究表明它具有很多的生理功能。可 媸川农业大学2 0 0 6 洲坝1 ：学位论义 见，胶原多肽的生理功能是基于胶原的生理功能上的，而胶原有提高人体骨骼强 度、保护胃粘膜、抑制血压上升、促进皮肤胶原代谢等作用。下面是胶原多肽的 一些具体的营养生理功能。 1 3 1 1 抗高血压 大量研究表明，肾素一血管紧张素一醛固酮系统( r e n a la n g i o t e n s i n s y s t e m ，r a s ) 在参与高血压病发病机制方面起着重要作用汹1 。在r a s 中，血管紧张 素转化酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 能使无生物活性的十肽血管紧 张素i ( ai ) 水解为血管紧张素i i ( ai i ) ，促使醛固酮分泌和儿茶酚胺的释放，引 起血管强烈收缩：同时a o e 又催化缓激肽的降解灭活，最终导致血压上升。因此， 通过寻找a c e 的抑制剂来降血压便成为一条重要的途径。 k i ms k 。”用三种酶水解牛皮，得到不同分子量分布的三种水解物，都具有a c e 抑制活性，其中胶原蛋白酶的水解产物对a c e 半抑制浓度( i c 。) 达到0 6 8 9 m g m l ， 分别低于a l c a l a s e 和p r o n a s ee 水解产物的半抑制浓度。两种强a c e 抑制活性的肽 用连续色谱法被分离出来，其结构分别是g l y p r o l e u 和g l y p r o v a l ，两者的a c e 半抑制率分别达到2 5 5m g m l 和4 6 7m g m l 。国内张义军”等选用正常麻醉大鼠、 s h r 及肾性高血压大鼠，采用颈动脉插管法检测胶原蛋白酶解物( c e h ) 对血压的 影响，c e h 对离体豚鼠回肠平滑肌的作用。结果表明c e h 对猪肺血管紧张素转换酶 ( a c e ) 的i c 。的为2 6 p m o l l 。对大鼠有降压作用和兴奋豚鼠平滑肌的作用，这些作 用可能与抑$ 1 a c e 有关。 1 3 1 2 抗氧化和抗衰老 自由基在生物体内对氧化和衰老起巨大作用，有效地清除自由基对抗氧化和 抗衰老有积极地作用。m e n d i se 等人”利用三种商品酶对h o k i ( j o h n i u s b e l e n g e r i i ) 鱼鳞水解，然后检测产生的胶原多肽的自由基清除能力。结果证实， 胰蛋白酶水解所得的胶原多肽具有最强的自由基清除能力。并分离出了具有最强 自由基清除能力的一个肽段，其序列为h i s g l y p r o l e u g l y p r o l e u ( 7 9 7d a ) 。 而且，这个肽段对亚油酸自氧化的抑制能力接近b h t 。进一步研究证实，该肽段 可以提高人的肝细胞中抗氧化酶的水平。经推测认为，该肽段可能与维持细胞环 境氧化还原的平衡有关。 1 3 1 3 预防与治疗骨关节炎和骨质疏松 胶原蛋白是骨结构中重要的组成部分，胶原多肽对于预防与治疗骨关节炎和 骨质疏松有着积极的作用。2 0 0 2 年，o e s s e ra n ds e i f e r t 报道o ”胶原多肽能够 刺激软骨细胞合成胶原蛋白i i ( 胶原蛋白i i 为骨关节的主要基础) ，并能影响胶 原在骨关节中的转化。m o s k o w i t zr w 。”报道，胶原多肽对骨关节炎和骨质疏松是 一种潜在治疗物质。临床研究证实，每天摄入l o g 胶原多肽，骨关节炎疼痛有明 显降低。 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 3 1 4 治疗胃溃疡等疾病 在消化道中，胃粘膜的损伤会引起胃出血，阿胶由于具有减少胃粘膜血流量， 促进血液循环以及血液凝固效果，因而引起了人们的关注。唐传核等人报道旺8 1 ， 胶原多肽具有保护胃粘膜的作用，而且其保护胃粘膜的效果比牛乳的效果要好得 多。 1 3 1 5 促进皮肤胶原代谢 经考证，伴随人体皮肤老化引起胶原纤维变质的原因是胶原量的减少以及胶 原间形成架桥( 从而导致纤维高密度化) 。而且，皮肤老化还会导致胶原代谢的降 低，因此胶原作为细胞基质的能力下降，从而加快皮肤老化过程，形成恶性循环。 唐传核等人报道，研究人员将胶原多肽饲喂老鼠一段时期后发现，胶原多肽具 有明显改善胶原合成能力的效果。另外，研究人员还确证胶原多肽具有促进皮肤 角质层的代谢回转效果( 角质层对保持皮肤水分起着关键作用) 。可见，胶原多肽 具有一定的美容效果。 1 3 2 胶原多肽制备与分离方法 一般的胶原多肽生产方法按工艺类型分有4 种：酸法、碱法、高温热解法和 酶法。酸法和碱法工艺简单，成本低，但产品中含盐量较高，相对分子质量分布 较宽，不适合生产高品质的食品级胶原多肽，而且由于这两种方法在生产过程中 需要长时间浸泡，对设备的材质要求都比较高。高温热解法产品含盐量低，但水 解时间长，需带压操作，产品相对分子质量分布不均且不易控制，也不适合生产 高品质的食品级胶原多肽。与前三种方法相比，酶法生产周期短，产品的相对分 子质量分布较窄，易控制，而且卫生环保，是目前比较先进的方法。用于食品和 化妆品 亍业的胶原多默多采用此法生产1 。目前，可用作胶原多肽制各的酶有菠 萝酶、木瓜酶、胰酶及菌源酶类等，各种酶各有优劣。张立萍1 报道，采用菠萝 酶和木瓜酶酶解，所得产品相对分子质量分布较窄、无异味；采用胰酶水解，产 品色泽浅，成本相对较低，水解时间短，但相对分子质量分布较宽，含盐量较多。 酶组合技术也被用于胶原蛋白多肽的制备。黄雅钦等m 1 应用酶的组合技术制备胶 原多肽，研究证实酶的不同组合方式是调节产物分子量及分布的极有效手段。 a s l 3 9 8 中性蛋白海和菠萝蛋白海组合，可以获得比用各自单酶水解分子量更小、 分布更窄的胶原多肽。 由于胶原蛋白酶解所得各种肽的分子量十分接近，因此胶原多肽分离纯化比 较困难，通常采用柱层析、h p l c 等进行分离纯化、如s e k w o nk i m 将阿拉斯加 青鳍鱼皮酶解物通过s e p h a d e xg - 2 5 ，再过s p - s e p h a d e xc - 2 5 柱，用n a c l 进行线性 梯度洗脱，收集具有抗氧化活力的流出液，再用h p l c 进行纯化，得到了最具抗氧 化活力的2 个肽段。 四川农业大学2 0 0 6 届碰上学位论文 1 3 3 胶原多肽的物理性质 胶原多肽的物理性质一般包括：溶解性、吸油性、乳化力( e c ) 、起泡性、 稳定性( 热稳定性和乳化稳定性) 、胶凝特性等。王碧、贾冬英等对胶原蛋白 多肽的物理性质作了测定，结果表明：高分子量胶原多肽凝胶性、保水性都较好， 但其吸水性、吸油性等相对较差，中分子量和低分子量分布的胶原多肽有较高的 溶解性、吸水性、乳化性、起泡性，但分子量过低，乳化能力、起泡能力反而下 降。面包与蛋糕应用实验显示胶原蛋白多肽对面包和蛋糕的品质都有较大的改善 作用。但是，有关p h 值、离子强度和湿度等环境因素对胶原蛋白多肽一些功能特 性如乳化性及乳化稳定性、发泡性及泡沫稳定性等的影响仍有待于进一步探讨。 1 4 抗氧化肽的结构与抗氧化活性研究方法 生物体在生命过程中会产生一定的自由基，这些自由基主要包括：氧自由基、 氮自由基、有机自由基和氢自由基。这些自由基是组织中许多生化反应的中间代 谢产物。在正常情况下，这些自由基受机体正常协调机制控制，处于不断产生和 不断消除的动态平衡中，但是一旦协调机制由于一定的原因出现问题，这些自由 基将在机体内过剩，从而威胁机体的健康“。抗氧化物就是指一类可以对自由基 起到抑制或清除作用的物质，如维生素c 、维生素e 等。近年来的研究发现，某 些肽类也具有抑制或消除自由基的作用“”，这些肽类被称为抗氧化肽。 1 4 1 抗氧化肽的结构特点 1 4 1 1 含巯基 有些抗氧化肽含有巯基，如谷胱甘肽( g s h ) 和卡托普利( c a p t o p r i l ) 。谷 胱甘肽的结构为谷氨酰半胱氨酸甘氨酸，分子中含有一个活泼的巯基，易被氧化 脱氢。g s h 是生理活性的形式，两分子g s h 失氢后转变为氧化型谷胱甘肽( o x i d i z e f o r mg l u t a t h i o n e ，g s s g ) 。g s h 的活性一s h 使之具有多方面的生理功能。卡托普利 ( 巯甲丙脯酸) 是含有一个- s h 的血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制剂，它能清除h ：晚、 h o c i 、o h 、叮：等体内的几乎全部活性氧。 1 4 1 2 含组氨酸及其衍生物 由于组氨酸及其衍生物分子中含有咪唑基团，咪唑基团为共轭体系，对自由基有 捕获能力，因此，含有组氨酸及其衍生物的物质或多或少都含有抗氧化活性。如肌肽 ( c a r n o s i n e ) ，高肌肽( h o m o c a r n o s i n e ) 和鹅肌肽( a n s e r i n e ) 。肌肽的结构是b a l a h i s ，鹅肌肽的结构为b a l a m e t h y 卜眦s ，高肌肽的结构为y - a m i n o b u t y r y l l h i s t i d i n e 。c h e nh u a m i n g “”等于1 9 9 5 年从大豆b c o n g l y c i n i n 中发现的六种抗 氧化肽，其中四种含有两个组氨酸，另外两个含酪氨酸。这些肽的结构为： 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 、吣- a m 鼎啦a 爷蝤卯b a 5 n ； l e u ia h 哇l 女 毡蓦 k 恤v a l - 锄p 睁毯鸯- a 爷西 g 】n - h i 争a 口a 鞠 己印棚1 d 哇垂 ： 量醵a 1 8 - a s p i l a 叫吣唯诎叫s 1 ) 1 y e 啪e - p m - a h - g l y - t v r - p m ； l e u - g l n - s e r - g 够! _ 趣 i a 喀l e u - a j g - v a l - p r o - s e r - g l u - t h r - t h r - t w 1 4 1 3 含色氯酸和酪氨酸及其衍生物 色氨酸及5 一羟色氨酸具有抗氧化活性，能抑制亚油酸的自动氧化作用。酪 氨酸及其衍生物具有酚羟基结构，此结构在维生素e 、多种有机酸以及黄酮类中 出现，被认为与抗氧化活性密切相关，此酚羟基可作为质子供体提供质子淬灭自 由基。因此，含有含色氨酸和酪氨酸及其衍生物的肽类都将具有抗氧化活性。 1 4 1 4 含牛磺酸和其他衍生物 牛磺酸即2 一氨基乙酸在鱼类和甲壳类动物肌肉中含量较高。延胡索酸( 反丁 烯二酸) 、阿魏酸( 4 - 羟基一3 一甲基肉桂酸) 、咖啡酸( 3 ，4 二羟肉桂酸) 及肉桂 酸( 苯基丙烯酸) 等有机酸亦具有抗氧化性。含有这些有机酸的肽类也将具有抗 氧化活性。 1 4 2 抗氧化肽活性的研究方法 不同抗氧化剂的抗氧化能力依赖于自由基的种类、产生过程、产生部位及它 所作用的靶“”。因此，在进行抗氧化肽活性实验时，只有考虑采取多种不同自由 基，作用于不同的体系来进行才有希望得出客观的结论。研究抗氧化肽活性的实 验体系从原理上可分为三类：第一类是通过氧化还原法研究抗氧化肽还原氧化物 能力的体系；第二类是研究抗氧化肽对各类自由基的抑制和清除作用的体系；第 三类是研究抗氧化肽对脂质过氧化抑制的体系。 1 4 2 1 氧化物的还原体系 实验室通常以h 2 0 2 为氧化剂，采用氧化还原的原理，研究抗氧化肽对h z 0 2 的还 原能力，如果还原能力越大，其抗氧化能力越强；相反，则不具有抗氧化能力。1 。 其原理在于一定量的抗氧化肽将h ：o ：还原，余下的h ：0 2 将体系中k i 氧化成i z ， i ：采用n a s 2 0 。以淀粉作指示剂定量滴定，被h ：也氧化的i ：越多，则表示抗氧化肽的 还原能力越低。此反应体系可用作抗氧化肽的抗氧化活性的初步判定。 1 4 2 2 自由基体系 一 自由基种类很多，实验室常采用超氧阴离子、羟自由基、过氧自由基、二苯 代苦味酰基自由基等进行抗氧化肽活性实验1 。 1 ) 清除超氧阴离子( 0 2 ) 能力的检测 产生0 2 。的体系有黄嘌呤黄嘌呤氧化酶、碱性二甲基亚砜( d m s 0 ) 、甲硫酸 非那宗n a d p h 等。检测方法采用比色法：仉可还原细胞色素c ( c y t c ) 或硝基 9 心川农业人学2 0 0 g 届碘：l ：学位论文 四氮唑蓝( n b t ) ， 反应式为： 0 2 一+ c y t c ( 1 1 ) 一c y t c ( i i ) + 0 2 。 n b t + 0 2 。- f o r m a n n e + 0 2 若受试物能与0 ：。反应则可降低细胞色素c 或n b t 的还原程度，用比色法测细 胞色素c 或n b t 含量的变化，可了解受试物清除0 2 一的能力。此体系可用于清除0 ：。一 的反应速率不是很高的受试物。 2 ) 清除羟自由基能力的检测 产生轻自由基( ：o h ) 的体系有f e 3 + _ e d t a 一抗坏血酸一h ：0 ：体系、f e 2 + _ e d t a - - h 。0 。体系、黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶一h ：0 ：体系及紫外光照h ：0 ：光解产生o h 等。 脱氧核糖核酸降解法：f e 3 l e d t a 、抗坏血酸及h ：0 ：产生o h 使脱氧核糖降解，在 酸性环境中，降解产物可与t b a 反应，形成粉红色物质，反应式如下“”： f e ”一e d t a 一抗坏血酸一f e 2 + _ e d t a + 氧化型抗坏血酸 f e “一e d t a + h 2 0 2 一f e ”e d t a + o h + o h 一 o h + 脱氧核糖一分解物一m d a 2 t b a 十m d a 一粉红色产物 可用比色法测知脱氧核糖的降解情况，了解受试物是否具有清除o h 的能力。 3 ) 清除过氧自由基能力的检测 将产生过氧自由基( r 0 ：) 的体系于3 7 c 与顺式十八碳四烯酸反应，r o 。造 成顺式十八碳四烯酸脂质过氧化，测定荧光强度( 于3 2 4 n m 激发，4 1 2 n m 处释放) 了解其脂质过氧化的情况，推测受试物清除r o ：的情况。检测清除e c h o 。的反应 动力学了解其c o l ，0 2 的能力。 4 ) 清除二苯代苦味酰基自由基能力的检测”3 二苯代苦味酰基自由基( d p p h ) 是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受 试物能清除它，则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由 基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。d p p h 有个单电子，在5 1 7 n m 有 强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，在5 1 7 n m 不同时间测定其清除 d p p h 而引起吸光度减少的情况。 1 4 2 3 脂质过氧化体系 在自由基的作用下，生物膜上的多不饱和脂肪酸( p u f a ) 发生脂质过氧化，其 检测方法主要有：电子自旋共振法：二烯共轭法：硫代巴比妥酸法。以上检测脂质 过氧化的方法均可用于检测受试物是否可抑制脂质过氧化反应，从而了解其抗氧 化性。在实验中，可使用红细胞、脂蛋白、组织匀浆、肝微粒体、肝线粒体、肝 细胞等生物脂质体系，各体系具不同特点，实验中可有选择地使用。 在进行抗氧化肽体外抗氧化实验的时候，通常要求采用的方法快速、灵敏。 1 0 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 具体实际应用中可根据实验具体需要，筛选一定的实验方法进行。 1 5 本研究的主要内容和目的意义 从目前的研究状况来看，制各胶原多肽的原料主要有畜禽的皮、骨和鱼类 的鳞，采用猪骨制备胶原多肽的研究很少。作为生猪生产总量居世界前列的国家 来说，我国每年有大量的猪骨产生，这些猪骨还没有得到科学的综合利用。如何 科学、有效开展猪骨综合利用就成为了一个重要的问题。采用一定的科学方法将 猪骨制备成胶原多肽不失为一条很好的猪骨综合利用途径，值得进行深入研究。 再者，在胶原多肽的制备工艺方面也存在着不同的思路，如何选择和选择怎样的 制备工艺也是值得研究的一个方向。其次，胶原多肽的生理功能目前已得到了一 些研究，初步认识到了其在提高人体骨骼强度、保护胃粘膜、抑制血压上升、抗 衰老和促进皮肤胶原代谢等方面的作用，但是对这些生理功能，特别是对抗氧化 作用的研究深度还不够。 因此本研究将从以下几个方面进行： 研究猪骨明胶的酶解工艺路线，探讨酶解进程和特征，优化酶解工艺。以抗 氧化活性为指标，建立猪骨胶原多肽酶解制备的数学模型。在建立了酶解制备的 数学模型基础上对猪骨胶原多肽的酶解制备最优工艺参数采用统计方法进行预 测。 采用普通低温离心和低温超滤离心相结合的措施对制备的猪骨胶原多肽进 行粗分离。采用柱层析对粗分离的猪骨胶原多肽进行洗脱分级，分别测定各级分 的半抑制浓度( i ) 。 收集抗氧化活性高的一个级分为代表，分别在不同的体系中对其抗氧化活性 进行研究，研究其抗氧化活性的大小及浓度效应。 四川农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料、试剂及仪器 2 1 1 实验材料 猪骨( 购于雅安市农贸市场) ：木瓜蛋白酶( 北京奥博星生物技术责任有限公 司，酶活6 8 4 0 0 u g ) ：中性蛋白酶1 3 9 8 ( 无锡杰能科生物工程有限公司，酶活 8 6 7 0 0 u g ) ：猪油( 采用市售猪板油自行炼制，起始p o v 值o 3 5m m o l l k g 油) ： 菜油( 购于雅安市农贸市场，起始p o v 值1 8m m o l l k g 油) ：豆油( 购于雅安市农 贸市场，起始p o v 值2 2 5 m m o l l k g 油) ：小白鼠( 6 周龄，雄性，( 2 5 2 ) ，四川大 学华西医学院) 。 2 1 2 主要试剂 磷酸二氢钾( a r ，成都天华科技股份有限公司) ：磷酸氢二钠( a r ，成都天华科 技股份有限公司) ：印三酮( a r ，s i g m a 公司) ：氯仿( a r ，天津市化学试剂一厂) ：冰 乙酸( a r ，广东汕头新宁化工厂) ：碘化钾( a r ，成都化学试剂厂) ：过氧化氢( a r ，上 海桃浦化工厂) ：二丁基羟基甲苯( b h t ，a r ，s i g m a 公司) ：抗坏血酸( a r ，s i g m a 公 司) ：三氯化铁( a r ，成都科龙化工试剂厂) ：脱氧核糖( a r ，s i g m a 公司) ：盐酸( a r ， 成都金山化工试剂厂) ：硫代巴比妥酸( t b a , a r ，国药集团化学试剂公司) ：正丁醇 ( a r ，成都科龙化工试剂厂) ：乙醇( a r ，成都科龙化工试剂厂) ：异亮氨酸( a r ，s i g m a 公司) ：三氯乙酸( a r ，天津市化学试剂六厂) ；m d a 试剂盒( 南京建成生物工程研究 所) 。 2 1 3 主要仪器 u v 一2 1 0 2p c s 型紫外可见分光光度计( u n i c o ) ：电子天平( s a r t o r i u s ) ：数显恒 温水浴锅( 金坛市富华仪器有限公司) ：电热恒温培养箱( 上海一恒科学仪器有限公 司) ：电热恒温鼓风干燥箱( 上海一恒科学仪器有限公司) ：低温离心机( t h e r m o ) ：磁 力加热搅拌器( 金坛市富华仪器有限