（农产品加工及贮藏工程专业论文）鱼皮胶原的提取、制膜及单宁的吸附研究.pdf

摘要 鱼皮胶原的提取、制膜及单宁的吸附研究 学科、专业：工学、农产品加工及贮藏工程 硕士研究生姓名：赵露 指导教n - 过世东教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：2 0 0 9 年7 月2 0 日 授予学位时间：2 0 0 9 年8 月 日 论文优化了斑点叉尾鲴鱼皮胶原的提取工艺，同时测定了该胶原的物理化学特性。 然后以鱼皮胶原为原料，探讨了胶原膜的制备工艺。通过对胶原膜改性，得到了热稳定 性高、耐水性强、韧性好、力学性能优异的膜材料，最后研究了该改性胶原膜材料对单 宁的吸附性能。 本文首先优化了鱼皮胶原的提取工艺，并研究了所提胶原的基本特性。鱼皮胶原的 最优提取工艺为：乙酸浓度0 5 m o l l ，冷冻干燥鱼皮：乙酸= 1 ：1 0 0 ( g m l ) ，胃蛋白酶添加 量为1 1 0 4 u m l ，提取时间5 4 h ，提取温度4 。经氨基酸分析、傅立叶红外扫描、 s d s p a g e 电泳等研究表明：所提鱼皮胶原的相对分子质量约为3 0 万，变性温度为 3 3 o ，具有i 型胶原所特有的氨基酸组成，并且胶原的三股螺旋结构保持完整。 其次研究了胶原的成膜性，得出了胶原膜的最佳成膜条件为：以0 1 m o l l 的乙酸为成 膜溶剂，胶原与溶剂的配比为1 5 9 l 。胶原在低温下( 1 0 ) 溶解1 2 h ，采用超声波脱气 1 0 m i n ，以有机玻璃为成膜介质。在3 0 。c ，r h 5 0 的条件下恒温恒湿干燥2 4 h 后小心揭 膜，保存于2 5 ，r h 5 0 的干燥器中。实验通过戊二醛、甘油、聚乙烯醇对胶原膜进行 交联和共混改性以提高其膜性能。选择膜的溶解性、抗拉强度、断裂伸长率等为评价指 标来考察不同改性剂对膜性能的影响，得出最佳改性膜配方为：胶原浓度1 5 9 l ，甘油 添加量0 2 ，2 5 的p v a 添加量0 6 ，2 5 的戊二醛添加量0 2 。 最后研究了改性胶原膜材料对单宁的吸附性能如：吸附时间、膜的添加量、吸附平 衡等温线、吸附动力学等。研究结果表明：单宁酸浓度为1 0 0 m g l 时，改性胶原膜的适 宜添加量为4 9 l ，单宁酸的去除率能达到7 0 以上，并且在3 5 c 和4 5 c 条件下，l a n g m u i r 曲线能较好地拟合胶原膜对单宁酸的吸附效果。当单宁酸初始浓度为5 0m g l 、1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l ，并且膜的添加量为4 9 l 时，单宁酸的平衡吸附量分别为：1 0 0 4 m g g 、 2 3 4 7 m g g 和3 1 2 4m g g ，该浓度下胶原膜对单宁酸的吸附符合拟二级速度方程。此外， 5 0 乙醇对单宁酸的解吸效果良好，并且胶原膜经过解析后可以重复利用。 关键词：斑点叉尾鲴鱼皮；胶原膜；单宁酸；吸附 a b s t r a c t e x t r a c t i o no fc o l l a g e n ，p r e p a r a t i o no fm e m b r a n eb a s e dc o l l a g e n a n di t sa d s o r p t i o no ft a n n i n s u b j e c t ：e n g i n e e r i n g s p e c i a l t y ：p r o c e s sa n ds t o r a g eo ff a r mp r o d u c e m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：l uz h a o f a c u l t y a d v i s e r ：s h i d o n gg u o p r o f t i m e o fe n r o l l m e n t ：01 0 9 2 0 0 7 t i m eo fo r a ld e f e n s e ：2 0 0 7 2 0 0 9 t i m eo fc o n f e r r i n gd e g r e e ：0 8 2 0 0 9 a b s t r a c t t h i s p a p e rs t u d i e d t h ep r o c e s so fe x t r a c t i n gc o l l a g e nf r o mc h a n n e lc a t f i s hs k i na n dt h e n o p t i m i z a t i o n e dt h et e c h n i c a lp a r a m e t e r so ff i l mb a s e do nc o l l a g e n f i n a l l y , t h ec o l l a g e nm e m b r a n ew a s u s e da saa d s o r p t i o nm a t e r i a lt oa d s o r bt a n n i ca c i d f i r s t t h ec o l l a g e nw a se x t r a c t e df r o mc h a n n e lc a t f i s hs k i nb yp e p s i na n da c e t i ca c i d t h eb a s i c p r o p e r t i e so ft h ee x t r a c t e dc o l l a g e nw e r ec h a r a c t e r i z e dt h r o u g hu v - v i s ，f t - i 凡a m i n oa c i da n a l y z e ra n d d s c t h ep a p e rs t u d i e dt h eo p t i m i z a t i o nt e c h n o l o g yo ft h ee x t r a c t i o no fc o l l a g e nf r o mc h a n n e lc a t f i s h s k i nt h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t s e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a le n z y m o l y s i sc o n d i t i o nw e r e ： 0 5 m o i la c e t i ca c i da n d110 4 u m lp e p s i ni nu s e h y d r o l y s i s5 4 ha t4 w i t hi n t e r m i s s i o ns t i r , c h a n n e l c a t f i s hs k i n ：a c e t i ca c i d = l ：10 0 ( m l ) u n d e rt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h ee x t r a c t i n gr a t i oo f c o l l a g e nw a s6 5 1 6 a n di t sd e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 3 0 b e s i d e s t h ee x t r a c t e dc o l l a g e nh a st h e t y p i c a la m i n oa c i dc o m p o s i t i o n o ft y p ea n di th a sh e l i xs t r u c t u r ei n t a c t s e c o n d l y , c o l l a g e nf i l m i n gc o n d i t i o n sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e rs u c ha s ：t h es e l e c to fs o l v e n t , t h e r a t i o no fc o l l a g e na n ds o l v e n t , t h ef i l mm e d i u ma n dt h ew a y so ff i l m i n g e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a t t h eb e s tf i l mf o r m i n gc o n d i t i o n sw e r e ：0 1m o l la c e t i ca c i da ss o l v e n t ，t h er a t i o no fc o l l a g e na n ds o l v e n t w e r e1 5 ：1 0 0 ( g m l ) ，d i s s o l v ef o r1 2 hi n1 0 ，u l t r a s o n i cd e g a s s i n g1 0 m i n ，u s eo r g a n i cg l a s sa sf i l m m e d i u m d r i e d2 4 hi n3 0 a n d5 0 h u m i d i t y s t o r e di nt h ed e s i c c a t o r , u n d e rt h ec o n d i t i o no f2 5 a n d 5 0 h u m i d i t y b e c a u s eo ft h ec o l l a g e nm e m b r a n ew a t e ri m b i b i t i o nd e f o r m a t i o n ，e x p a n s i v ea n dp o o r m e c h a n i c a lp r o p e r t i e sa n db i o l o g i c a la n dc h e m i c a ls t a b i l i t y , e x p e r i m e n tt h r o u g hs u c ha sg l u t a r a l d e h y d e ， g l y c e r i n ，p v ao nm e m b r a n ep o s t - c r o s s l i n k i n ga n db l e n d i n gm o d i f i e dt oi m p r o v ei t sp r o p e r t i e s i nv a r i o u s c h a r a c t e r i s t i c s ，w ec h o i c et e n s i l es t r e n g t h ，e l o n g a t i o n ，e u p h o t i cr a t e ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ， s o l u b i l i t ya se v a l u a t i o ni n d e x e s t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fm e m b r a n ep e r f o r m a n c e t h eo p t i m u m m o d i f i c a t i o nm e m b r a n et e c h n o l o g yp a r a m e t e r sw e r ec o l l a g e n ：a c e t i ca c i d = 1 5 ：10 0 ( g m l ) ，g l y c e r i n 0 2 ， p v a0 6 a n dg l u t a r a l d e h y d e0 2 f i n a l l y , t h em o d i f i e dc o l l a g e nm e m b r a n ew a su s e da saa d s o r p t i o nm a t e r i a lt oa d s o r bt a n n i ca c i di n w a t e r w es t u d i e da d s o r p t i o nd o s a g e ，t i m e ，p h ，t e m p e r a t u r e ，a d s o r p t i o nb a l a n c ea n da d s o r p t i o nk i n e t i c s ，e t c r e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h et a n n i ca c i dc o n c e n t r a t i o nf o rlo o m g l ，m o d i f i c a t i o nm e m b r a n ef o r4 9 l ，t i m eo f 甜s o r p t i o ne q u i l i b r i u mf o r2 h i nl0 0 2 0 0 m g lc o n c e n t r a t i o nr a n g e m o d i f i c a t i o nm e m b r a n ef o rt h e r c m o v a lr a t eo ft a n n i ca c i d ，c a na c h i e v e7 0 a t3 5 a n d4 5 ，t h ea d s o r p t i o no ft a n n i ca c i dc a l lb e a e r f i t t i n gt h el a n g m u i rc u r v e i na d d i t i o n ，t h ee f f e c to f t a n n i ca c i dd e s o r p t i o nw i t h5 0 a l c o h o lw a sg o o d ，a n d c o l l a g e nm e m b r a n em a y r e u s e k e yw o r d s ：c h a n n e lc a t f i s hs k i n ；c o l l a g e nm e m b r a n e ；t a n n i ca c i d ；a d s o r p t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究芏 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同恚对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意尊 签名赶皇睡日期。司年7 弦7 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解汪南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的惠容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名； 堇斗 日期：叫年硇j 7 e l 1 引言 1 引言 1 1 立题背景 胶原的科学定义是：它是细胞外基质的一种结构蛋白质，含有一个或几个由伐链组 成的三股螺旋结构的区域，即胶原域。胶原广泛存在于从低等脊椎动物线虫、蚯蚓等体 表面的角质层，到哺乳动物机体的一切组织中，尤其富含于动物的结缔组织一皮、骨、 肌腱、韧带、血管中【l 】。胶原是结缔组织中极其重要的结构蛋白，有着支撑器官、修复 组织、保护机体等功能。 胶原属于硬蛋白，一般为白色、透明、无分支的原纤维，具有四级结构。胶原的基 本结构单位是原胶原分子，该分子由3 条肽链盘绕成3 股螺旋结构，直径约为1 5 r i m ， 长约为2 8 0 - - 3 0 0 n m ，它以重复的( g l y p r o h y p ) n 序列为主要特点【2 。3 l 。一般蛋白质含有 2 0 种氨基酸，但是胶原只含有1 8 种，且有其特别的组成即：胶原中缺少胱氨酸和色氨 酸，甘氨酸的含量几乎占了1 3 ，富含脯氨酸和羟脯氨酸，并且羟脯氨酸是胶原的特有 氨基酸。目前，研究者通过单克隆抗体及基因工程技术已发现了至少1 9 种不同类型的 胶原，最常见的是i 、i i 、i 型胶原，其中i 型胶原含量最高，占胶原总量的8 0 以上。 相关研究表明，胶原具有良好的生物相容性、低抗原性和生物可降解性。因此，胶原作 为天然的生物质资源，在食品、生物医学、化妆品等工业中应用的重要性和经济地位日 益突出。 1 1 1 胶原的应用 目前，国内外对胶原的应用研究主要分为两大类：一是基于胶原独特的物理特性， 即纤维性能，用于相纸底片、纺织、造纸、包装材料等；二是利用胶原的生物功能，用 于添加剂、保健食品、饲料、美容化妆品、医用材料等【4 - 7 】。胶原作为一种重要的天然 蛋白质资源，研究开发的速度很快，使它在众多的领域都具有广泛的应用前景和发展空 间。随着人们对健康的重视，胶原的天然高分子特性越来越受到人们的青睐，胶原的保 健功能和美容功能正在被人们熟知，这方面的研究正逐步成为热点。同时，在水产品加 工业的下脚料和皮革行业产生的废弃物中含有大量的胶原，对该胶原的综合利用问题正 逐渐被重视，对其加以利用和开发，不仅能推动水产加工业和皮革行业的发展，而且能 化废为宝减少环境污染。此外，胶原还具有氨基酸种类丰富、蛋白质含量高、不含脂肪 等特点，这为开发营养、健康的高附加值产品奠定了良好的基础。 1 1 2 胶原膜的研究 胶原是一种良好的膜材料，以胶原制备成的胶原膜除具有耐有机溶剂、生物可降解 性、组织可吸收性外，还具有亲水性强、透水透气性好等特点。对于胶原膜，国内外的 成型方法有很多种。国内的大部分研究都采用浇铸成膜的方法，而国外则较多采用机械 挤出的方法。关于胶原膜的应用，主要集中在食品和医学领域。在食品行业中，胶原膜 主要以包装膜的形式出现，即以可食用的胶原为原料，经过交联而制成的包装材料，应 江南大学硕士学位论文 用于食品包装。胶原膜具有阻油、阻氧、阻水、可携带抗氧剂及抗菌剂载体、保香等功 能，可以广泛应用于包装肉制品、酸奶、食品配料；可用作肠衣，制作香肠、冻肉；还 可用作包装袋，包装可可粉、咖啡、香料和药用胶囊等。在医学领域，胶原膜可用于暂 时性皮肤替代物、透析和固化酶的载体等瞵j 。 1 1 3 斑点叉尾鲴加工现状 斑点叉尾鲴( c h a n n e lc a t f i s h ) ，亦称美洲鲶、沟鲶，属于鲶形目，鲴科，为淡水温 水性鱼类。2 0 0 3 年以前，我国斑点叉尾鲴消费基本上是鲜活鱼消费。2 0 0 3 年开始，由于 我国斑点叉尾徊开始向美国出售，所以开始进行简单的粗加工，其产品主要有冻鱼片、 鱼糜和鱼肚等【9 j0 1 ，但深加工的企业不多。对斑点叉尾鲴加工中产生的下脚料，除了部 分鱼头出售给餐饮店外，剩余的鱼头、鱼脊骨和鱼尾等，被干燥、粉碎，加工成动物饲 料。目前关于斑点叉尾鲴下脚料的加工利用情况的报道，主要涉及鱼皮、鱼骨、鱼头胶 原和明胶的研究、鱼骨休闲食品的研究、鱼内脏水解工艺、鱼露加工等【1 1 。1 4 1 。总之，斑 点叉尾鲴下脚料的加工和利用目前只停留在粗放型阶段，还没有进行更为经济合理的综 合利用。 1 1 4 单宁的毒副作用 单宁又称鞣质，是一类天然多酚类化合物，它作为植物的次生代谢产物广泛存在于 植物的根、皮、叶及果实中，是森林资源综合利用的重要对象之一。单宁具有抑菌、抗 病毒、抗肿瘤、抗氧化等多方面的生物活性【”】，但是单宁同时也具有一定的毒副作用， 主要表现为：抗营养性和生物学毒性。例如：单宁能与蛋白质结合、抑制消化酶、影响 体内维生素和矿物元素的摄入；单宁酸能引起人和食草动物肝坏死，某些单宁也可能诱 发癌变；中药制剂中含有单宁，除了影响制剂的稳定性和澄清度外，还可能引起黄疸、 皮下出血、无菌炎症等严重的生理反应；果汁饮料中常常也含有一定量的单宁，单宁的 存在不仅影响果汁的贮存稳定性，而且还是引起果汁涩味的主要原因。因此，在植物性 资源的加工与中草药、果汁等产品生产中，对单宁的去除具有重要的意义。目前脱除单 宁的方法主要有明胶沉淀法、重金属离子沉淀法、树脂吸附法等【1 6 j 引。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 鱼皮胶原研究近况 由于欧洲疯牛病和口蹄疫的影响，以牛皮、猪皮作为主要原料的胶原的安全性受到 人们的质疑，人们开始以鱼皮、鱼骨等海洋生物材料代替猪皮、牛皮作为提取胶原的新 原料。从七十年代开始人们就研究从鱼皮中提取胶原，但很少有工业化生产。目前，国 外对鱼皮胶原的研究主要集中在海水鱼方面，主要涉及鳕鱼、章鱼、鲷鱼等 1 9 - 2 2 j ，而对 淡水鱼研究较少。我国是世界水产大国，其淡水鱼皮资源相当丰富。关于鱼皮胶原，周 爱梅等【2 3 l 研究了罗非鱼、鳙鱼、草鱼和鲫鱼四种淡水鱼皮胶原的提取工艺，其胶原提取 率依次为3 6 5 7 ，3 0 5 8 ，3 5 1 4 ，4 5 1 7 。孟昭宇等【2 4 1 分别用酶法和化学方法研究 了鳕鱼皮、蝶鱼皮和马哈鱼皮，这四种海水鱼中胶原的提取工艺，其提取率分别为l1 6 ， 2 1 引言 1 2 3 ，7 6 。从这些报道可以看出，鱼皮中提取的胶原大多为i 型胶原，但是不同鱼 皮胶原提取的工艺不同，其提取率也相差较大，所得到的胶原的性质也各不相同。关于 鱼皮胶原的利用，主要围绕其与胶原的功能共性和鱼皮胶原的特性来展开。由于鱼皮胶 原的变性温度比较低，因此，无论是在其提取、纯化、还是贮藏、应用过程中，都需保 持低温或合适的温度，以保持其活性、达到特定的功效【2 5 之6 1 。 1 2 2 胶原膜的研究进展 由于胶原膜遇水易膨胀变形、吸水性强、力学性能和生物化学稳定性差等缺点，近 年来许多学者一直在寻求合适的方法改性胶原膜，避免其材料本身的缺点，以提高其抗 降解能力，改善胶原膜的力学性能与吸水性等。目前用于改善胶原膜性能的方法主要有 交联法和共混法。交联按实现的方法可以分为化学交联方法和物理交联方法，目前常用 的化学交联剂有戊二醛、乙醛酸、二胺、环氧化合物等。采用化学交联剂对胶原膜进行 交联，可以明显改善胶原膜的机械性能，但化学交联剂的引入常产生细胞毒性、抑制细 胞生长、降低细胞的粘附能力。因此可以采用天然高分子与胶原共混，以改善胶原膜的 性能，使其同时达到几种材料的生理功能的协同增效。例如采用壳聚糖、聚乙烯醇、葡 甘聚糖、软骨素等 2 7 - 2 9 j 与胶原共混。本实验采用交联和共混并举的方法，改性胶原膜， 改善其膜性能。 1 3 研究创新及意义 由于我国对斑点叉尾鱼鲴的加工一般仅限于加工成鱼片出口，生产过程产生的下脚 料如鱼头、鱼皮、鱼骨等逐年增多，这些下脚料若不加以有效利用，不仅造成极大的浪 费，而且还会造成环境污染。鱼皮中含有丰富的胶原，因此将鱼皮加工成胶原、胶原膜 及其附加产品，可以大大提高其价值。这不仅拓宽了胶原的原材料，还为斑点叉尾鲴鱼 皮的工业化开发、为水产品下脚料的综合利用提供了参考。 在单宁的分离去除中，吸附法因具有效率高、不破坏有用物质、不带入杂质等特点 具有明显优势，但这一技术的关键是合成一种对鞣酸具有高选择性的吸附材料。由于胶 原中含有羧基、氨基和羟基，能与鞣质分子的酚羟基发生多点氢键硫水键结合，同时两 者还存在物理吸附作用，这些特性使利用皮胶原制备单宁吸附材料成为可能1 3 0 j 。本文研 究了胶原膜对单宁的吸附性能，该研究对果汁、中药等产品中单宁的去除具有重要的理 论指导和现实意义。 1 4 研究内容 本课题的研究内容主要有： ( 1 ) 优化了斑点叉尾鲴鱼皮胶原的提取工艺。首先对影响胶原提取率的主要因素如： 胃蛋白酶添加量、提取时间和乙酸浓度进行了单因素实验，然后对其进行正交优化得出 了鱼皮胶原的最优提取工艺。 ( 2 ) 测定了鱼皮胶原的基本理化性质。采用氨基酸分析、傅立叶红外光谱( f t - i r ) 、 s d s p a g e 电泳等方法对鱼皮胶原的基本特性进行了测定。研究结果表明：鱼皮胶原符 江南人学硕上学位论文 合i 型胶原的基本特性，并保留了天然胶原的原有形态，这为胶原的进一步加工与利用 提供了必要的基础资料。 ( 3 ) n 鱼皮胶原为原料采用浇铸成膜工艺，通过对成膜介质、成膜溶剂、成膜方法等 的研究得出了胶原膜的制备工艺。 ( 4 ) 实验通过戊二醛、甘油、聚乙烯醇对胶原膜进行交联和共混改性以提高其膜性能。 实验选择膜的溶解性、抗拉强度、断裂伸长率、透光率等为评价指标来考察其对膜性能 的影响，筛选出改性胶原膜最佳工艺配方。 ( 5 ) 研究了胶原膜对单宁的吸附性能。将改性胶原膜作为单宁的吸附材料，研究了这 种吸附材料的用量、吸附温度、吸附平衡等温线和吸附动力学等，并探讨了胶原膜吸附 单宁酸的作用机理及其洗脱和重复利用性能，为胶原膜吸附材料的实际工业应用奠定了 基础。 4 2 实验材料与方法 实验材料与方法 2 1 实验材料与设备 2 1 1 材料与试剂 斑点叉尾鲴鱼皮：于- - 2 0 保存，由江苏泰兴江泰食品有限公司提供；s i g m ai 型 胶原和s d s p a g e 次高分子量蛋白质m a k e r ，购于s i g m a 公司；即用型透析袋m w c o 1 0 0 0 0 ，购于上海绿鸟科技发展有限公司；聚四氟乙烯板，购于无锡市祥健四氟制品有 限公司；有机玻璃板，购于无锡市瑞力生塑胶材料有限公司；胃蛋白酶，购于国药集团 化学试剂有限公司；单宁酸、冰醋酸、聚乙烯醇、正己烷、氯化钠、钨酸钠、磷钼酸、 碳酸钠等均为分析纯；l 酪氨酸和2 5 戊二醛为生化纯，聚乙烯醇配成2 5 的溶液使用。 2 1 2 仪器设备 m i c r o m o d u l y o 2 3 0 真空冷冻干燥器，t h e r m os a v a n t 公司；d l 5 b 型飞鸽牌离 心机，上海安亭仪器厂；n e x u s 4 7 0 傅立叶变换红外光谱仪，美国t h e r m on i e o l e t 公司； a g i l e n t l 0 0 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；f r - 2 0 0 a 全自动紫外与可见分析装置， 上海复日科技有限公司；d s c 一2 0 0 p c 差示扫描量热仪，德国耐驰公司；b i o r a d 电泳仪， 美国伯乐公司；凝胶成像系统，上海复日科技有限公司；q u a n t a - 2 0 0 扫描电子显微镜， e 1 本明石公司；w s c s 测色色差计，上海精密科学仪器有限公司；t a - x t 2 i 物性仪，英 国s t a b l em i c r o s y s t e m 公司；r e 5 2 2 旋转蒸发仪，上海沪西分析仪器厂；p q x 型多段可 编程人工气候箱，宁波东南仪器有限公司。 2 2 实验方法 2 2 1 鱼皮胶原的提取 本文首先研究了鱼皮原料的预处理工艺，以去除非胶原蛋白、油脂、色素等杂质。 然后采用乙酸和胃蛋白酶从鱼皮中提取胶原，研究了提取时间、乙酸浓度和胃蛋白酶添 加量对胶原提取率的影响。最后利用正交实验优化，得到了鱼皮胶原的最优提取工艺。 2 2 1 1 原料的预处理 鱼皮流水解冻_ 清洗去除皮下脂肪和残存鱼肉一切块( 5 m m 5 m m ) - - - , 以5 倍体积 ( v m ) 的l m o l l 的n a c l 溶液浸泡6 4 ，1 5 0 r m i n 恒速震荡去除非胶原_ 冷去离子水 洗涤鱼皮并沥干_ 用2 倍体积( v m ) 的正己烷浸泡6 h ，每2 h 搅拌1 5 r a i n 去除脂肪一沥干 一冰箱内预冻一冷冻干燥。 2 2 1 2 胶原提取的工艺流程 根据相关文献【3 1 1 ，采用福林( f o l i n ) 法测得胃蛋白酶的酶活力为7 3 ，6 0 0u g 。实验采 用乙酸和胃蛋白酶对预处理鱼皮浸提，然后将浸提液离，t l , ( 4 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，用双层 纱布过滤得上清液，在冰水浴下搅拌并用研细的n a c l 盐析至0 7 m o l l 。盐析液静置 江南人学硕上学位论文 3 0 m i n 后，离，l , ( 4 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) 得白色沉淀物。将沉淀复溶于乙酸，复溶完全后离心 ( 4 0 0 0 r m i n ，1 5 m i n ) ，得上清液为胶原溶液，将胶原溶液移入透析袋内，用冷去离子水 透析脱盐，每3h 更换去离子水，不断搅拌以加速透析，透析至无c l ( 用1 0 9 l 的a g n 0 3 溶液检验) ，透析完后将胶原溶液于冰箱内预冻，然后真空冷冻干燥得到鱼皮胶刷3 2 - 3 4 】。 2 213 单因素实验 实验采用乙酸和胃蛋白酶浸提预处理鱼皮提取胶原，其主要影响因素为：乙酸浓度、 胃蛋白酶用量、固液比、提取温度和时间。当固液比较小时，浸提液粘稠，不利于离心 去杂及盐析操作，经试验得合适的固液比为：冷冻干燥鱼皮：乙酸= 1 ：1 0 0 ( g m l ) 。由于鱼皮 胶原的变性温度较低，故在整个胶原提取过程中均采用4 低温进行实验。实验以胶原 的提取率作为优化指标。胶原提取率( ) = 胶原干重预处理鱼皮干重( 去除水分后计) 。 酶量的影响：分别称取2 9 预处理鱼皮，放入2 0 0 m l 浓度为0 5 m o l l 的乙酸溶液中， 胃蛋白酶的添加量分别为：0 u m l 、1 8 4 u m l 、3 6 8 u m l 、5 5 2 u m l 、7 3 6 u m l 、9 2 0 u m l 、 1 1 0 4 u f m l 和1 2 8 8 i i ，提取时间为4 8 h 。 提取时间的影响：分别称取2 9 预处理鱼皮，放入2 0 0 m l 浓度为0 5 m o l l 的乙酸溶 液中，胃蛋白酶的添加量均为7 3 6 u m l ，提取时间分别为：1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 和7 2 h 。 乙酸的影响：分别称取2 9 预处理鱼皮，用2 0 0 m l 不同浓度的乙酸溶液浸泡，乙酸溶 液的浓度分别为：0 1 m o l l 、0 2 5m o l l 、0 5m o l l 、0 7 5m o l l 、1 0 0m o l l 和1 2 5m o l l ， 胃蛋白酶的添加量均为7 3 6 u m l ，提取时间为2 4 h 。 2 2 1 4 正交优化 实验选择胃蛋白酶量、乙酸浓度和提取时间为考察因素，根据单因素实验结果选择 三个水平，以胶原的提取率为考察指标，按l 9 ( 3 4 ) 正交实验表设计实验，实验步骤如 2 2 1 2 。正交试验因素水平安排见表2 1 ，数据处理采用d p sv3 0 1 专业版软件。 表2 - 1 胶原提取工艺因素水平表 t a b 2 - 1f a c t o r sa n dl e v e l so fc o l l a g e ne x t r a c t i o n 2 2 2 胶原理化性质的测定 氨基酸组成分析：取少量鱼皮胶原样品，用6 m o l l 的h c i ，于1 l o 水解2 4 h ，水 解液于a g i l e n t l 0 0 高效液相色谱仪中分析氨基酸组成 3 5 1 。 紫外光谱分析：取一定量鱼皮胶原样品用0 5 m o l l 的乙酸溶解，配制成o 1 m g m l 的胶原溶液，同时用0 5 m o l l 的乙酸溶液作对照。将胶原溶液加入l c m 的石英比色皿 进行紫外分光光度测定，选择波长范围为1 9 0 4 0 0 h m 。 6 2 实验材料与方法 傅立叶红外光谱( f r - m ) 分析：实验采用k b r 压片，用n e x u s 4 7 0 傅立叶变换红外光 谱仪，d t g s 检测器对样品在4 0 0 - - 一4 0 0 0e m l 区间内进行扫描，扫描次数3 2 次，分辨 率为4e m 。1 3 6 - 3 7 1 。 胶原热变性温度测定：采用差式扫描量热仪测定，仪器用金属铟校正后，准确称取 2 一- - 3 m g 鱼皮胶原样品于d s c 铝坩埚中，加盖密封，以空坩埚作为参比【3 引。温度扫描范 围为2 0 - 6 0 ，升温速率为5 。c m i n ，吹扫氮气流量为2 0 m l m i n 。 s d s p a g e 电泳：实验采用b i o t a d ( d , 型垂直电泳槽) 电泳仪，分离胶浓度7 5 ， 浓缩胶浓度5 ，t r i s ，h c i 电极缓冲液，考马斯亮蓝r 2 5 0 染色，样品浓度为o 5 m g m l ， 电泳条件为2 0 0 v t 3 9 - 4 0 l 。 胶原等电点的测定：利用浊度分光光度法测定鱼皮胶原的等电点【4 1 1 。 2 2 3 胶原的成膜条件研究 2 2 3 1 乙酸浓度的确定 由于胶原采用乙酸加酶的方法提取所得，胶原在乙酸中的复溶性较好，故实验采用 乙酸作为溶剂。将1 克胶原分别溶于1 0 0 m l 的0 1 、o 2 、o 3 、0 4 、0 5 、0 6 m o l l 不同 浓度的乙酸溶液中，充分搅匀后，静置溶解1 2 h 后观察胶原的溶解状况。 2 2 3 2 成膜介质的选择 将鱼皮胶原溶于o 1 m o f l 的乙酸溶液，配成浓度为1 0 9 l 的胶原溶液，充分搅匀后， 静置溶解1 2 h ，经超声波脱气1 0 m i n 后，取1 0 m l 分别均匀涂于普通玻璃板、聚四氟乙 烯板、塑料板、有机玻璃板上1 4 2 】，于恒温3 0 c 条件下，干燥2 4 后小心揭膜，保存于2 5 ， r h 5 0 的干燥器中。对比4 种不同成膜介质对膜外观性状的影响。 2 2 3 3 膜干燥方法的选择 将鱼皮胶原溶于0 1 m o l l 的乙酸溶液，配成浓度为1 0 9 l 的胶原溶液，充分搅匀后， 静置溶解1 2 h ，经超声波脱气1 0 m i n 后，取1 0 m l 均匀涂于有机玻璃板上，采用不同的 干燥方法，干燥2 4 h 。干燥方法分别为：室温( 3 0 ) 干燥、恒温恒湿干燥( 3 0 。c ，r h 5 0 ) 、 烘箱干燥( 3 0 0 c ) 和冷冻干燥。膜干燥后小心揭膜，保存于2 5 ，r h 5 0 的干燥器中。对 比以上4 种不同干燥方法对膜外观性状的影响【4 3 】。 2 2 3 4 胶原浓度的确定 用0 1 m o l l 的乙酸溶液，分别配制5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 9 l 不同浓度 的胶原溶液各1 0 0 m l ，充分搅匀后，静置溶解1 2 h 。经超声波脱气1 0 m i n 后，各取1 0 m l 胶原溶液，分别涂于有机玻璃板上。在3 0 。c ，r h5 0 的条件下，恒温恒湿干燥2 4 h 后 小心揭膜，保存于2 59 c ，r h 5 0 的干燥器中。对比不同胶原与溶剂配比的情况下，胶 原的溶解状况和膜的外观性状。 7 江南大学硕二l 学位论文 2 2 4 胶原膜的改性及其性质测定 2 241 改性膜的制备 将胶原溶于o 1 m o l l 的乙酸溶液，配成浓度为1 5 9 l 的胶原溶液，在低温下( 1 0 ) 搅拌均匀，然后向溶液中添加一定量的甘油、2 5 戊二醛和2 5 p v a 改性，搅拌均匀后 静置溶解1 2 h 。经超声波脱气1 0 m i n 后，取1 0 m l 胶原溶液均匀涂于有机玻璃板上成膜， 在3 0 ，r h5 0 的条件下，恒温恒湿干燥2 4 h 后小心揭膜，保存于2 5 ，r h 5 0 的干 燥器中。通过分析不同改性剂对胶原膜性质的影响，得出胶原膜的最佳工艺配方。 2 2 4 2 胶原膜性质的测定 厚度测定：对称选取膜的5 点测量其厚度，取平均值，( 单位r n m ) 。 色度测定：用w s c s 测色色差计进行分析。 含水量测定：膜的含水量采用直接干燥法测定。 溶解性测定：称取一定重量的膜w f ( o 2g 左右) ，加入盛有5 0m l 去离子水的培养 皿中。在2 5 下溶解2 4h ，然后使用布氏漏斗抽滤，先称取滤纸的重量w l ，抽滤后未 溶物与滤纸一并放入1 0 5 c 烘箱，烘干至恒重，称重w 2 ，膜的溶解性按下式计算： f s ：堑二竖二塑1 0 0 ( 2 1 ) 透光率测定：将胶原膜裁成合适的大小，紧贴于比色皿一侧，在5 0 0 n m 的波长下测 其透光率t ，以空比色皿作为对照。透光率大小可间接表示膜的透明度。 扫描电镜分析：胶原膜干燥后喷金，用q u a n t a - 2 0 0 扫描电子显微镜观察膜的微观结 构，观察不同放大倍数下胶原膜的表面特征，对比胶原膜改性前后表面微观结构的异同。 机械性能测定：用物性测试仪测定膜的拉伸特性，将膜剪成2 0 x 8 0 c m 的长条，采用 a g t 探头，距离4 0 m m ，以1 0 m m s 的速度拉伸，拉伸载荷2 0 9 ，记录膜断裂时的拉力f 和断裂伸长量l ，计算膜的抗拉强度( t s ) 和延伸率( e ) 。测定前先将试样在2 5 c ，r h5 0 的环境下平衡4 8 h 。在2 5 * ( 2 ，r h 5 0 的环境下进行机械性能的测定。 抗拉强度t s ( t e n s i l es t r e n g t h ) ：指膜在轴向拉伸力的作用下，断裂时承受的最大拉 力同膜宽度与厚度乘积的比值，按公式( 2 2 ) 计算： 硒：l 三x ( 2 2 ) 式中：t 蝴的抗拉强度，m p a ；f 一膜的轴向拉伸力，n ；嘲的宽度，m i l l ；) ( - 膜 的厚度，r e a l 。 延伸率e ( e l o n g a t i o n ) 指膜在拉伸情况下发生形变，发生断裂时材料的绝对增长与 初始长度的比值，按公式( 2 3 ) 计算： e ：丝1 0 0 上| d ( 2 3 ) 式中：e _ 一膜在拉伸断裂时的延长率，；l 广一膜的初始长度，m m ；的绝对增长 量，m l n o 8 2 实验材料与方法 膜的热力学分析：采用差示扫描量热仪( d s c ) 进行热力学分析，温度扫描范围为2 0 2 0 0 ，升温速率为5 m i n ，吹扫氮气流量为2 0 m l m i n 。 膜的傅立叶红外光谱( f t - l r ) 分析：用n e x u s 4 7 0 傅立叶变换红外光谱仪，d t g s 检 测器进行红外光谱分析。实验采用a t r 反射法制样，对样品在5 0 0 - - 4 0 0 0c m l 区间内 进行扫描，扫描次数“次，分辨率为4c m 。 2 2 5 胶原膜对单宁的吸附研究 2 2 5 1 单宁酸的测定 福林丹尼斯( f o l i n - d e n i s ) 法是国际上植物酚类化合物测定的常用方法，已广泛用于 植物多酚类的分析测定舶】。采用不同浓度的单宁酸显色后，测定其最大吸收波长和显 色稳定时间，并研究p h 对显色稳定性的影响，得出单宁酸的测定方法为：采用福林丹 尼斯试剂显色，显色时间为2 h ，显色p h 控制在4 - 1 0 之间，在7 5 0 h m 处测定其吸光度。 单宁酸标准溶液配制：准确称取单宁酸o 1 0 0 0 - a ：o 0 0 0 1 9 ，定容于5 0 0 m l 的容量瓶中， 配制成浓度为0 2 9 l 的单宁酸溶液。 单宁酸标准曲线：以吸光度a 为纵坐标，单宁酸浓度c 为横坐标绘制曲线，得到 单宁酸标准曲线方程为：y = 0 0 5 4 6 x ，其相关系数为r 2 - - 0 9 9 9 4 ，且单宁酸在1 - - - 7 m g l 的范围内具有良好的线性关系。 2 2 5 2 胶原吸附膜的制备 胶原吸附膜的工艺配方为：胶原浓度1 5 9 l ，甘油含量2 9 l ，2 5 戊二醛含量2 9 l ， 2 5 p v a 含量6 9 l 。鱼皮胶原采用0 1 m o l l 的乙酸溶解，然后加入一定量的甘油、2 5 戊二醛、2 5 p v a 改性，搅拌均匀后静置溶解1 2 h ，充分交联改性。成膜前经超声波脱 气l o m i n ，取1 0 m l 胶原溶液均匀涂于有机玻璃板上，在3 0 ，r h5 0 的条件下恒温 恒湿干燥2 4 h 后小心揭膜，保存于2 5 ，r h5 0 的干燥器中。 2 253 胶原吸附性能的测定 由于水解类单宁比缩合类单宁的毒性更大，故实验采用单宁酸为研究对象，研究胶 原膜对单宁的吸附性能。配制不同浓度的单宁酸水溶液，考察胶原吸附膜对单宁酸的吸 附效果【4 7 4 8 j 。取一定量的胶原膜于2 5 0 m l 的锥形瓶中，加入l o o m l 不同浓度的单宁酸 溶液，在一定温度下恒速( 1 5 0 r m i n ) 振荡吸附一定时间，取上层清液l m l 于1 0 0 m l 容量 瓶中，显色后测其吸光度。将实验所得吸光度y ( a b s ) 代入单宁酸标准曲线y = o 0 5 4 6 x ( r 2 为0 9 9 9 4 ) q b ，得出单宁酸的浓度x l ，然后按公式(