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海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗查基丝益蔓挂别直盟的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 肖舒 签字日期：州务年月刈日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： j | i 甭多 签字日期：p 年月- 1 日 翩擀雄专 海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 摘要 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) 是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属 结合蛋白。由于水生生物体的m t s 能被金属诱导，而且诱导程度与水环境重金 属浓度之间存在一定的相关性，可间接反映出水环境中重金属的污染水平，因此， 海洋动物体内的m t s 已被认为是海水和沉积物重金属污染的生物标志物。而且 海洋动物m t s 含量还被认为是海洋金属暴露风险评价和健康评价的重要工具。 近二十年来，为了将m t s 应用于海洋污染的生物监测，国内外学者先后研究了 多种分析技术及相应的提取方法。但是海洋动物m t s 的分离和定量分析尚无国 际性的标准方法，因此本研究以暴露于含镉海水的菲律宾蛤仔( r u d i t a p e s p h i l i p p i n a r u m ) 为试验材料，在文献报道的汞饱和法和分光光度法的基础上，分 别对两种方法的提取和测定条件进行优化。 对汞饱和法的优化，依次采用正交设计和单因素设计对内脏和鳃m t ( 以粗 提液中的巯基含量表示) 的提取工艺条件进行优化。所得到的内脏最佳匀浆条件 为：t r i s h c l 缓冲液浓度为0 0 2 m o l l ，p h 值7 8 ，内脏与缓冲液的质量体积e l ( r n v ) 为1 5 ，其中，缓冲液的浓度对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首 先在4 c 、2 0 0 0 0 9 离心3 0 m i n ，再于8 0 。c 水浴加热1 0 r a i n ，然后于4 c1 5 0 0 0 9 离 心1 0 m i n 。 所得到的鳃最佳匀浆条件为：t r i s h c l 缓冲液浓度为0 0 2 m o l l ，p h 值7 8 ， 内脏与缓冲液的质量体积比( m v ) 为1 4 ，其中，缓冲液的p h 对提取效果影响较 大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4 、2 5 0 0 0 9 离心2 0 m i n ，再于8 0 水浴加 热1 0 m i n ，然后于4 1 5 0 0 0 9 离心1 0 m i n 。 测定条件优化时，以菲律宾蛤仔的鳃组织为试验材料，逐一测定该方法的各 因素对鳃组织c d m t 提取液中汞含量的影响，由此得到汞饱和法测定双壳类 m t 的适宜条件为：将稀释4 倍的c d - m t 提取液与h 矿+ 浓度5 0 m g l 的1 0 z 氯乙酸按等体积比混合后，孵化反应5 m i n ，再加入1 5 倍体积的2 牛血红素溶 液，迅速在2 0 0 0 0 9 离心2 0 r a i n 。经过优化的汞饱和法对蛤仔c d m t 的相对标准 偏差为4 9 5 ，加标回收率为7 1 0 8 0 o - - - 7 8 8 6 ，检出限为0 2 4 p g h g l ，对应于 4 4 7 1 x g m t g 组织。 对于分光光度法的优化，采用单因素设计分别对内脏和鳃m t ( 以粗提液中 的巯基含量表示) 的除杂工艺和测定条件进行优化。内脏除杂最佳工艺条件为： 取l m l 上清液加入l m l 无水乙醇( 2 0 。c 预冷) 和8 0 9 l 氯仿，离心取上清液加入 3 倍体积无水乙醇2 0 沉淀l h ，6 0 0 0 9 离心1 0 r a i n 后弃去上清液，取沉淀加1 7 4 m l 无水乙醇和2 6 0 p lt r i s h c l ( 含蔗糖) 振荡冲洗沉淀，离心取沉淀，n 2 吹干得到 m t 干粉。最佳测定条件为：e l l m a n 显色试剂中n a c i 浓度为0 5 m o l l 。经优化 的分光光度法测定内脏m t 相对标准偏差为3 2 0 ，加标回收率在9 0 0 9 9 6 8 5 之间，检测限9 9 8 p g m t g 组织。 鳃m t 除杂阶段最佳工艺条件：取l m l 上清液加入l m l 无水乙醇( 2 0 预 冷) 和4 0 山氯仿，离心取上清液加入3 倍体积无水乙醇2 0 沉淀l h ，6 0 0 0 9 离 心1 0 r a i n 后弃去上清液，n 2 吹干得到m t 干粉。最佳测定条件：e l l m a n 显色试 剂中不含n a c l 。经优化的分光光度法测定鳃m t 相对标准偏差为2 9 2 ，加标 回收率在9 1 8 8 1 0 1 2 9 之间，检测限6 6 1 i t g m t g 组织。 综上所述，相对于汞饱和法，分光光度法简单、重复性好、准确度高、成本 低，试验器材容易获取，更适于一般实验室选用，且能保证结果的真实性与可靠 性，可作为蛤仔等双壳类m t 检测的可靠的分析技术。 关键词：菲律宾蛤仔；金属硫蛋白( m t s ) ；汞饱和法；分光光度法；测定条件 r e s e ar c ho nt h ee x t r a tio na n d a n ai y siso f m e t ai | o t hio n ein s inm arir ebiv aiv e a b s t r a c t m e t a l l o t h i o n e i n s ( m t s ) a l eaf a m i l yo fl o wm o l e c u l a rw e i g h tm e t a l - b i n d i n g p r o t e i n s ，w h i c hc o n t a i nah i g hp r o p o r t i o no fc y s t e i n e i nm a n ya q u a t i c s p e c i e s m e t a l l o t h i o n e i n sc a nb ei n d u c t e db ym e t a l s ，a n dt h ed e g r e eo fm t si n d u c t i o ni s c o r r e l a t e dw i t hm e t a lc o n c e n t r a t i o n s ，t h e r e f o r et h el e v e lo f m e t a l si n a q u a t i c e n v i r o n m e n tc a nb er e f l e c t e di n d i r e c t l yb yt h ei n d u c t i o no fm t s a tp r e s e n t m t si 1 1 m a r i n ea n i m a l sh a v eb e e nr e c o g n i z e da sp o t e n t i a lb i o m a r k e ro fh e a v ym e t a l si n s e a w a t e ra n ds e d i m e n t m t sc o n c e n t r a t i o n si nm a r i n eo r g a n i s m sa r ea l s op r o p o s e da s a ni m p o r t a n tt o o lt oe v a l u a t et h er i s ko fm e t a le x p o s u r ea n da s s e s st h eh e a l t ho f o c e a n s i nt h ep a s tt w od e c a d e s ，m a n yr e s e a r c h e r sb o t ha th o m ea n da b r o a dh a v e a p p l i e d m t st om a r i n e p o l l u t i o nm o n i t o r i n g ，a n dd e v e l o p e dd i f f e r e n ta n a l y s i s t e c h n i q u e sa n de x t r a c t i o nm e t h o d s u n t i ln o w ，t h e r ei sn os t a n d a r dm e t h o d ，n e i t h e r i s o l a t i o nn o rq u a n t i f i c a t i o ni nt h es t u d i e so fm a r i n ea n i m a l s i nt h i ss t u d y , r u d i t a p e s p h i l i p p i n a r u me x p o s e dt os e a w a t e rc o n t a i n i n gc a d m i u mw a su s e da sam a t e r i a l ，t h e e x t r a c t i o na n dd e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o no ft h ee s t a b l i s h e dm e r c u r ys a t u r a t i o nm e t h o d a n ds p e c t r o m e t r i cm e t h o dw e r eo p t i m i z e d f o rt h em e r c u r ys a t u r a t i o nm e t h o d ，e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o rm a x i m u mm t r e c o v e r yf r o mv i s c u sa n dg i l l s ，e x p r e s s e da sc o n t e n to fs u l f l l y d r y lg r o u p ( s h ) i nt h e c r u d ee x t r a c t , w e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a ld e s i g na n ds i n g l e f a c t o r d e s i g n t h e o p t i m i z e dh o m o g e n i z a t i o np r o c e s so fv i s c u sw a sa sf o l l o w s ：t h eb u f f e rc o n c e n t r a t i o n w a s0 0 2m o l l ，p h 7 8a n dm vw a s1 5 m t y i e l dw a sp r i m a r i l ya f f e c t e db y t r i s h c lb u f f e rc o n c e n t r a t i o n t h eo p t i m a lp r o c e s so b t a i n e df o rr e m o v i n gi m p u r i t y w a st h a tt h eh o m o g e n a t ew a sc e n t r i f u g e da t2 0 0 0 0 9a t4 cf o r3 0m i n ，a n dt h e nt h e c o l l e c t e ds u p e r n a t a n tw a sh e a t e da t8 0 cf o r10m i n ，f o l l o w e db yas e c o n d c e n t r i f u g a t i o na t15 0 0 0 9a t4 cf o r10m i n t h eo p t i m i z e dh o m o g e n i z a t i o np r o c e s so fg i l l sw a sa sf o l l o w s ：t h eb u f f e r c o n c e n t r a t i o nw a s0 0 2m o l l p h 7 8a n dm vw a s1 4 m ty i e l dw a sp r i m a r i l y a f f e c t e db yt r i s h c lb u f f e rp h t h eo p t i m a lp r o c e s so b t a i n e df o rr e m o v i n gi m p u r i t y w e r et h a tt h eh o m o g e n a t ew a sc e n t r i f u g e da t2 5 0 0 0 9a t4 cf o r2 0r a i n ，a n dt h e nt h e c o l l e c t e d s u p e m a t a n t w a sh e a t e da t8 0 。cf o r10m i n ，f o l l o w e db yas e c o n d c e n t r i f u g a t i o na t15 0 0 0 9 a t4 cf o r10r a i n w h e nt h ed e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o nw a so p t i m i z e d ，g i l l si nr p h i l i p p i n a r u mw e r e u s e da sm a t e r i a l ，t h ee s t a b l i s h e dm e r c u r ys a t u r a t i o nm e t h o dw a so p t i m i z e db y s i n g l e f a c t o rd e s i g n ，e x p r e s s e da s t h ec o n t e n to fh gi ns o l u t i o n t h eo p t i m i z e d d e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：t h e4 一f o l dd i l u t i o no fs u p e m a t a n tc o n t a i n e d c d - m tw a sm i x e dw i t hh g c l 2s o l u t i o na t5 0m gh g li n10 t r i c h l o r o a c e t i ca c i di n t h es a m ev o l u m e a f t e ri n c u b a t i n gf o r5r a i n ，1 5 - f o l do f2 b o v i n eh e m o g l o b i nw a s a d d e da n dr a p i d l yc e n t r i f u g e da t2 0 0 0 0 9f o r2 0m i n t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n o ft h i so p t i m i z e dm e t h o dw a s4 9 5 ，t h er e c o v e r yo fs t a n d a r da d d i t i o nw a s 7 1 0 8 0 o - - 7 8 8 6 ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a so 2 4 i t g h g l ，e q u i v a l e n tt oat i s s u e c o n c e n t r a t i o no f4 4 7 i _ t g m t g f o rt h es p e c t r o m e t r i cm e t h o d ，t h ec o n d i t i o n so fr e m o v i n g i m p u r i t ya n d d e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o nf o rm tf r o mv i s c u sa n dg i l l s ，e x p r e s s e da sc o n t e n to f s u l f l a y d r y lg r o u p ( - s h ) i nt h ec r u d ee x t r a c t , w e r eo p t i m i z e db ys i n g l e f a c t o rd e s i g n t h eo p t i m a lp r o c e s so b t a i n e df o rr e m o v i n gi m p u r i t yf o rv i s c u sw a sa sf o l l o w s ：f o rp e r 1m lo ft h es u p e m a t a n t , lm lc o l d ( 一2 0 c ) a b s o l u t ee t h a n o la n d8 0 t x lo fc h l o r o f o r m w e r ea d d e d s u b s e q u e n t l y , t h es a m p l e sw e r ec e n t r i f u g e da n dt h es u p e r n a t a n t sw e r e a d d e dt o3 - v o l u m eo f c o l de t h a n o l ，s t o r e da t 2 0 ( 2f o rl ha n dc e n t r i f u g e da t6 0 0 0 9f o r 10m i n t h e n t h ep e l l e t sa f t e rc e n t r i f u g e dw e r ew a s h e d 谢t l l1 7 4 m la b s o l u t ee t h a n o l a n d2 6 0 p 1t r i s h c lh o m o g e n i z a t i o nb u f f e r ( c o n t a i n i n gs u c r o s e ) ，c e n t r i f u g e da g a i n a n dt h ep e l l e t sw e r ed r i e db yn 2 ( 9 9 9 9 1 t h eo p t i m a ld e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o nw a s e l l m a nr e a g e n tc o n t a i n i n go 5 m o l ln a c l t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no ft h i s o p t i m i z e dm e t h o dw a s3 2 0 ，t h er e c o v e r yo fs t a n d a r da d d i t i o nw a s9 0 0 9 9 6 8 5 ， a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s9 9 8j - t g m t g t h eo p t i m a lp r o c e s so b t a i n e df o rr e m o v i n gi m p u r i t yf o rg i l l sw a sa sf o l l o w s ：f o r p e r1m lo ft h es u p e r n a t a n t , lm lc o l d ( 2 0 。c ) a b s o l u t ee t h a n o la n d4 0 9 lo fc h l o r o f o r m w e r ea d d e d s u b s e q u e n t l y , t h es a m p l e sw e r ec e n t r i f u g e da n dt h es u p e r n a t a n t sw e r e a d d e dt o3 - v o l u m eo f c o l de t h a n o l ，s t o r e da t 一2 0 cf o rl ha n d c e n t r i f u g e da t6 0 0 0 9f o r 10m i n t h e n ，t h ep e l l e t sa f t e rc e n t r i f u g e dw e r ed r i e db yn 2 ( 9 9 9 9 1 t h eo p t i m a l d e t e r m i n a t i o nc o n d i t i o nw a st h a tt h en a c lw a sn o tc o n t a i n e di ne l l m a nr e a g e n t t h e r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no ft h i so p t i m i z e dm e t h o dw a s2 9 2 ，t h e r e c o v e r yo f s t a n d a r da d d i t i o nw a s9 1 8 8 10 1 2 9 ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 6 6 1g g m t g i ns h o r t ，c o m p a r e dw i t hm e r c u r ys a t u r a t i o nm e t h o d ，s p e c t r o m e t r i cm e t h o di s m o r es i m p l e ，r e p e a t a b l e ，a c c u r a t e ，l o w c o s t ，a n dm a t e r i a l sc a nb eo b t a i n e de a s i l y , a n d c a n g u a r a n t e et h e f a c t i c i t y a n d d e p e n d a b i l i t y o ft h e r e s u l t s t h e r e f o r e ， s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dc a nb eu s e df o rt h ed e p e n d a b l ed e t e r m i n a t i o no fm t si n m a r i n eb i v a l v es u c ha sr p h i l i p p i n a r u m k e yw o r d s ：r u d i t a p e sp h iii p p i n a r u m ；m e t a i io t h io n ein ( n t ) ：m e r c u r y s a t u r a tio na s s a y ：s p e c t r o p h o t o m e t ricm e t h o d ：d e t e r min a tio no o n ditio n 目录 1 文献综述1 1 1 引言1 1 2m t 理化性质1 1 2 1 组成1 1 2 2 等电点1 1 2 3 可诱导性1 1 2 4 稳定性与光谱特性2 1 3m t 在海洋环境重金属污染监测中的应用2 1 4 海洋动物m t s 的提取与纯化3 1 4 1 提取技术一3 1 4 2 分离纯化5 1 5 海洋动物m t s 的检测技术5 1 5 1 金属饱和法一6 1 5 2 巯基检测7 1 5 3蛋白质检测7 1 6 研究目的和研究内容。9 1 6 1 研究目的9 1 6 2 研究内容10 2 汞饱和法测定m t 的条件优化11 2 1 引言11 2 2 材料与方法1 2 2 2 1 材料1 2 2 2 2 仪器13 2 2 3 方法13 2 3 结果与分析17 2 3 1 提取条件优化1 7 2 3 2 汞饱和法优化2 4 2 4 本章小结2 6 3 分光光度法测定m t 的条件优化一2 7 3 1 引言2 7 3 2 材料与方法2 7 3 2 1 材料2 7 3 2 2 仪器2 8 3 2 3 方法2 8 3 3 结果与分析3 0 3 3 1 除杂过程优化3 0 3 3 2n a c l 浓度对测定结果的影响3 5 3 4 本章小结3 6 3 4 1 基于分光光度法的菲律宾蛤仔内脏m t 提取与测定条件3 6 3 4 2 基于分光光度法的菲律宾蛤仔鳃m t 提取与测定条件3 6 4 两种方法对蛤仔m t 的测定结果比较3 7 4 1 引言3 7 4 2 材料与方法3 7 4 2 1 材料3 7 4 2 2 仪器3 8 4 2 3 方法3 9 4 3 结果与分析4 1 4 3 1 精密度、准确度和检测限测定4 l 4 3 2 两种方法对相同样品m t 的测定结果比较4 3 4 4 本章小结j 4 5 5 结论与展望4 6 5 1 结论4 6 5 1 1 汞饱和法的样品提取条件和测定条件4 6 5 1 2 分光光度法的样品提取条件和测定条件4 7 5 1 3 分光光度法比汞饱和法更适于蛤仔样品m t 的测定4 8 5 2 进一步研究方向4 8 参考文献4 9 致 射5 6 个人简历5 7 硕士期间发表论文情况5 7 海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 1 文献综述 1 1 引言 金属硫蛋i 刍( m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) 化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一 类广泛存在于生物体中的低分子量( 通常小于1 00 0 0 d ) 、富含半胱氨酸的金属结 合蛋白【1 埘，具有较强的耐热性【3 3 和低p h 值稳定性4 1 。一般认为，m t s 的一个主 要生理功能是稳态调节细胞内的金属水平，即参与生物体内必需金属元素( c u ，z n ， c o ，n i ) 的调节和非必需金属元素( c d ，h g ，a g ，p b ) 的解毒【5 ，6 】。m t s 存在多种形态， 典型的m t s 由2 种同形体组成，即m t - i 和m t - i i 5 1 。自从1 9 5 7 年m a r g o s h e s 和 v a l l e e 首次发现m t 以来，m t s 已成为最热门的研究课题和应用热点之一。 1 2m t 理化性质 1 2 1 组成 一般说来，哺乳动物的m t 含有6 1 个氨基酸残基，其中有2 0 个半胱氨酸残 基，但不含组氨酸和芳香族氨基酸。无脊椎动物m t 与之基本相似：( 1 ) 两者的 半胱氨酸( c y s ) 含量都很高；( 2 ) 均具有典型的c y s 排列构型，即c y s x c y s ； ( 3 ) 生理功能相似 7 ，8 】。l e r c h 等【9 从锯缘青蟹( s c y l l as e r r a t a ) 中提纯的两种m t 分别包含5 7 和5 8 个氨基酸，它们的序列非常类似于哺乳类m t ，尤其是c y s 的分布，有4 7 的位置是相同的。但是，无脊椎动物m t 和哺乳动物m t 的差 异也十分明显：其一，无脊椎动物某些种类m t 含有芳香族氨基酸；其二，哺乳 动物m t 各亚型序列相似性很高，而无脊椎动物m t 各亚型序列相似性较低【8 1 。 1 2 2 等电点 m t 的等电点p i 一般在4 左右，例如：哺乳动物m t 的等电点在3 9 4 6 之 间，已发现的水生生物m t 的等电点在3 5 6 0 之间【2 1 ，杨丰等测得褐菖鳓 ( s e b a s t i s c u sm a r m o r a t u s ) 的等电点分别是4 0 和4 2 。 1 2 3 可诱导性 m t 的最显著的生物特性是可诱导性。已知的诱导因素有金属、激素( 包括糖 1 海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 皮质激素，胰高血糖素和肾上腺素等) 、四氯化碳中毒、阿片样物质、阿霉素和 其他物质( 如c a m p 、干扰素和白细胞介素l 等) ；各种应激，如压力、刺激、进 食、体力限制、高温、寒冷以及由于炎症和细菌内毒素引起的组织损伤均能使 m t 合成增加【l l 】。 1 2 4 稳定性与光谱特性 金属离子与m t 的结合能力通常按如下顺序：h g ( i i ) a g ( i ) c u ( i ) c d ( i i ) z n ( i i ) 1 2 】。m t 分子上结合的金属在酸性条件下可脱去，去金属的硫蛋白在低 p h 值时较稳定。各种金属硫蛋白5 0 的金属离子发生解离的所需的p h 值分别 为：z n m t 为3 5 4 5 ，c d m t 为2 5 3 5 ，c u m t 小于1 。但当p h 调至中性时， 硫蛋白分子间发生二硫交联，形成大分子聚合物，同时会对它的生理活性产生一 定的影响。因此，m t 的存在形式及稳定性与其所结合金属的种类、是否结合了 金属以及环境的p h 值密切相关【7 1 3 1 。 同样，m t 的光吸收特征除了与其氨基酸组成有关外，还与其所结合的金属 种类密切相关。因为分子中不含芳香族氨基酸，所以m t 没有2 8 0n i n 处的吸收 峰，但是在脱掉金属离子后，硫蛋白在1 9 0 n m 处有一明显的肽键吸收峰。m t 与 金属结合而产生的特征吸收峰为：c d m t2 5 0 r i m ，z n m t2 2 5 n m ，c u m t2 7 5 n m ， h g m t3 0 0 r i m ，据此可以对不同的m t 进行分离鉴定1 5 1 。 1 3m t 在海洋环境重金属污染监测中的应用 许多海洋生物体内都含有m t s 或类金属硫蛋白( m t l p s ) ，至今已发现6 0 多种无脊椎动物中存在着m t s ，海绵、帽贝、贻贝、沙蚕、虾蟹类、海胆和多种 鱼体内也发现有m t l p s 的存在【1 6 1 引。 大量研究证明，在重金属( a g ，c d ，c u ，h g ，z n 等) 诱导下，生物体内 m t s 含量会显著增加，而且这种诱导与环境中金属浓度具有一定的相关性，可以 间接反映出环境中的金属水平，上世纪七十年代末就有人提出水生生物m t s 含 量可作为指示水环境污染物暴露和毒性效应早期警报的主要生物标志物【5 1 。与哺 乳动物和鱼类不同的是，海洋软体动物的m t s 中甘氨酸含量很高，因此可用于 区别其他的m t s 异构体。不同的软体动物体内m t s 的基本含量大致相同，约 2 3 r a g g ( 软体组织干重) ，可以直接横向比较不同地理环境下的m t s 生物检测数 2 海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 据，因此，软体动物体内的m t s 作为重金属污染物暴露的生物标志物有着非常 广泛的适用范围【1 9 】，利用这种含量的变化能检测出海水中金属离子浓度在1 0 。9 数量级上的变化【2 0 】。贻贝( 尤其是紫贻贝( m y t i l u se d u l i s ) ) 是一类全球性分布 的沿岸底栖双壳类海洋动物，因其摄食和附着生活方式，体内容易富集重金属等 污染物，能反映所在水域的环境变化状况，因而被认为是检测m t 指标的最佳 生物供体，其m t 水平可作为环境中c d 、h g 、a g 及c u 污染的生物标志物2 1 2 2 ， 已被广泛应用于海水污染的生物监测。其他海洋动物如牡蛎2 3 1 、文蛤【2 4 】、多毛 纲动物 2 5 】的m t l p s 也可作为海洋重金属污染的生物标志物。 1 4 海洋动物m t s 的提取与纯化 1 4 1 提取技术 目前已从许多海洋动物的消化腺或肝胰腺、生殖腺、肝、脑、鳃、肌肉、外 套膜等组织以及幼体或成体中提取到m t s 或m t l p s e 2 6 - 3 0 。提取方法均采用缓冲 溶液匀浆后直接离心法，常用提取剂有t r i s h c l 缓冲溶液和蔗糖溶液。 1 4 1 1t r i s h c l 缓冲溶液提取 i r i s h c l 缓冲液性质稳定，与生理体液的相容性好【3 1 1 ，在m t s 的相关研究 中，一般都采用t r i s h c l 缓冲溶液提取。另外，温度是影响蛋白质稳定的最重要 因素，一般温度越高，蛋白质的稳定性越低，对绝大多数蛋白质而言，在0 - - - 4 c 之间较为稳定1 3 2 1 ，因此含m t s 的生物组织一般在冰上解剖，并在8 0 。c 保存备用， 以免引起蛋白质的变性及降解。 采用t r i s h c l 缓冲溶液提取m t s 时，一般先将经金属诱导的组织与t r i s h c l 缓冲液混合，经过匀浆、4 c 下3 00 0 0 9 离心l h 得到上清液；然后根据m t s 的热 稳定性，采用水浴加热和离心方法去除热不稳定大分子蛋白，得到的上清液即为 m t s 粗提液。t r i s h c l 缓冲液的浓度一般为0 0 1m o l l 或o 0 2 m o l l ，p h 值 7 2 8 6 ，被提取的组织与缓冲液的质量体积比( g m 1 ) 一般为1 3 - 1 5 。有些研 究所采用的t r i s h c l 缓冲液中含有0 1 5 m o l l n a c l ，作用是促进蛋白溶解；有的 研究则向t r i s h c l 缓冲液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟( p m s f ，0 1m m o l l 或0 2 m m o l l ) 、还原剂二硫苏糖醇( d t t ，l m m o l l ) 或b 巯基乙醇( 1 0 r e t o o l l ) ， 以保护m t s 的巯基( s h ) 不被降解或氧化。水浴处理一般在8 0 加热1 0 r a i n 3 海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究 左右，也有少数研究采用沸水浴处理2 3 m i i l 【3 3 3 4 1 。 为进一步提纯m t ，可在上述粗提液中加入3 倍体积的无水乙醇，并在2 0 下沉淀过夜，然后将沉淀物用缓冲液溶解、离心，弃去沉淀后可得m t s 提取液【3 3 】。 e r k 等3 5 1 研究发现，水浴处理( 7 0 。c 和8 5 。c ) 和乙醇氯仿沉淀虽然都能有效去 除大分子杂蛋白，但是温度达到8 5 时，会造成m t 亚型m t 2 0 的损失，而乙 醇氯仿沉淀处理也会造成m t 2 0 的大量减少，由此提出，测定前不宜进行高倍 数稀释，因为稀释本身会造成误差，如果在水浴处理之前将上清液用o 9 的n a c l 溶液稀释1 0 倍，不仅可以降低m t 随高分子蛋白的协同沉淀损失，而且测定之 前也无需再稀释。 该提取方法可去除大部分杂质，所制备的提取液可直接采用极谱法、酶联免 疫吸附法、金属饱和法及色谱法测定。 1 4 1 2 蔗糖溶液提取 糖类是蛋白质在溶液中和干燥状态下最好的稳定剂，可有效降低蛋白酶的水 解作用【3 6 1 。蔗糖溶液提取法在a g 饱和法中应用较多，多采用0 2 5 m o l l 蔗糖溶 液进行组织匀浆，然后在4 。c 下2 0 0 0 0 9 离心2 0 r a i n 得到m t 粗提液。与t r i s h c l 缓冲液提取相比，该方法步骤简单，但是后续测定过程需要增加水浴处理、离心 等除杂环节，以减少杂质影响。 1 4 1 3 蔗糖和t r i s h c l 缓冲溶液提取 该提取方法主要应用于m t s 的分光光度法测定。由于分光光度法易受杂质 干扰，提取步骤比较繁琐。通常在缓冲液中含有0 0 0 6 m m o l l 亮抑蛋白酶肽、 0 5 m m o l lp m s f 和0 0 1 1 3 - 巯基乙醇以保护s h 。一般在第一步离心( 多数 3 0 0 0 0 9 ，2 0 r a i n ) 取得的l m l 上清液中加入1 0 5 m 1 2 0 预冷的无水乙醇和8 0 9 l 氯仿，在o 4 下6 0 0 0 9 离心1 0 r a i n 以沉淀大分子杂蛋白，向收集的上清液中加 入l m gr n a 和4 0 山体积比3 7 的h c l 以提高m t s 回收率，随后加入3 倍体积 的冷乙醇在2 0 。c 沉淀l h ，6 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，取沉淀物，加入无水乙醇、氯仿 7 ：1 ：1 2 ，然后于6 0 0 0 9 再次离心1 0 r a i n ，得到 巯基物质如谷胱甘肽、半胱氨酸和b 巯基乙 7 3 8 】 4 海洋双壳类动物金属硫